利用廢棄煙梗發(fā)酵生產(chǎn)白僵菌的響應(yīng)面優(yōu)化

陳辰 朱潤琪 臧曉靜 劉麗 馬軒 葉曉婉 劉珍珍 谷萌萌 席宇 朱大恒

摘 要：為實現(xiàn)廢棄煙梗資源化利用，以廢棄煙梗為主要發(fā)酵底料，白僵菌產(chǎn)孢量為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法（Response Surface Methodology，RSM）對煙梗發(fā)酵生產(chǎn)白僵菌的條件進行了優(yōu)化。通過Plackett-Burman（PB）試驗篩選出影響廢棄煙梗發(fā)酵生產(chǎn)白僵菌最顯著的因素，設(shè)計最陡爬坡試驗逼近最佳條件區(qū)域，進一步設(shè)計Box-Behnken Design（BBD）響應(yīng)面優(yōu)化，分析并確定最佳條件。結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)時間為9.40 d，蛋白胨含量1.21%，酵母粉含量1.03%時，白僵菌孢子產(chǎn)量預(yù)測最優(yōu)值為1.17×1010個/g，實際孢子產(chǎn)量為1.13×1010個/g，擬合度達到96.58 %，白僵菌產(chǎn)孢量顯著提高。因此，采用該方法優(yōu)化得到的最佳發(fā)酵條件合理而有效，對煙草生物防治以及煙梗廢料的綜合利用具有實際應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞：白僵菌；廢棄煙梗；固態(tài)發(fā)酵；響應(yīng)面法優(yōu)化

中圖分類號：S435.72 文章編號：1007-5119（2018）02-0046-08 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2018.02.007

Optimization of Fermentation Conditions of Beauveria bassiana Using Waste Tobacco Stem as Fermentation Substrate with Response Surface Methodology

CHEN Chen1， ZHU Runqi2， ZANG Xiaojing1， LIU Li1， MA Xuan1， YE Xiaowan1， LIU Zhenzhen1， GU Mengmeng1， XI Yu1， ZHU Daheng1*

（1. College of Life Sciences， Zhengzhou University， Zhengzhou 450001， China； 2. College of Pharmacy， Huazhong University of Science and Technology， Wuhan 430074， China）

Abstract： In order to realize the resource utilization of waste tobacco stems and improve the application status on waste tobacco stem， using waste tobacco stem as fermentation substrate， and the production of Beauveria bassiana as response value， the fermentation process of Beauveria bassiana was optimized using the response surface methodology （RSM）. Through Plackett-Burman （PB） design， the most significant factors affecting the production of Beauveria bassiana using waste tobacco stem as fermentation substrate were identified. Based on the results of the Plackett-Burman （PB） experiment， the steepest ascent experiment was used to approach the optimal region， and the mathematical model of optimization of Box-Behnken Design （BBD） response surface was established to determine the optimal conditions. The results showed that when the incubation time was 9.40 days， concentration of peptone and yeast powder was 1.21% and 1.03% respectively， the prediction spore yield of Beauveria bassiana was 1.17×1010/g， the actual spore yield was 1.13×1010/g， and the fitting degree was 96.58%. Therefore， the optimal fermentation conditions from RSM are reasonable， and have practical application value in microbial prevention and control and the comprehensive utilization of waste tobacco stems.

Keywords： Beauveria bassiana； waste tobacco stem； solid-state fermentation； response surface methodology

白僵菌（Beauveria bassiana）作為一種昆蟲病原真菌，在病害蟲的防治與調(diào)控中具有重要的作用，因其寄生范圍廣，可侵染種類多、數(shù)量大（包括15個目、149個科的700多種昆蟲及蜱螨目的6科10

基金項目：河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點項目“煙草廢棄物發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)單細胞蛋白和草炭技術(shù)研究”（13B180358）；鄭州大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃資助項目“有機廢水資源化利用生物工藝研究”（2015xjxm198）；國家自然科學(xué)基金項目（31401918）

作者簡介：陳 辰（1994-），男，碩士研究生，研究方向為微生物學(xué)與煙草生物工程。E-mail：chenchenem@aliyun.com

*通信作者，E-mail：zhudaheng2000@aliyun.com

收稿日期：2017-11-15 修回日期：2018-01-29

余種螨和蜱），易大規(guī)模生產(chǎn)等特點[1]，并且具有專一性強、對人畜無害、防治效果好、生物降解無殘毒等優(yōu)點[2-3]，從而被認為是目前世界上研究和應(yīng)用最廣泛的生物殺蟲劑之一[4-7]，在病蟲害防治中發(fā)揮著越來越重要的作用[8-10]。但目前固態(tài)發(fā)酵白僵菌大多是糧食生物質(zhì)底料作為發(fā)酵基質(zhì)[11]，例如麥麩、棉籽、米糠、碎米和稻殼等，成本較高，成為限制白僵菌推廣的主要因素之一，所以尋找合適的廉價廢棄原料物發(fā)酵生產(chǎn)白僵菌，不僅能夠降低生產(chǎn)成本，而且能夠降低污染，實現(xiàn)資源的回收再利用，已成為當(dāng)前的熱點領(lǐng)域。

煙梗是煙草卷煙工業(yè)的副產(chǎn)物[12]，占煙葉總重的20%～30%[13]，主要堆積于打葉復(fù)烤廠的倉庫中，嚴(yán)重浪費倉儲資源，目前對廢棄煙梗的處理主要采用造紙法生產(chǎn)煙草薄片，但生產(chǎn)過程耗能耗熱量大、產(chǎn)生的污水量高[14]，對環(huán)境造成污染。煙梗中含有豐富的糖類、氮類、磷、鈣、鉀等營養(yǎng)物質(zhì)[15-18]，可作為發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)[19-20]。李超等[21]以廢棄煙梗提取液為底物進行液態(tài)發(fā)酵，采用正交組合試驗設(shè)計，對蘇云金芽孢桿菌的培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件進行優(yōu)化，結(jié)果表明，優(yōu)化后蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)量明顯增加。郭大城等[22]采用Plackett-Burman（PB）試驗對影響深紅酵母（Rhodotorula rubra）JLC發(fā)酵煙梗廢料產(chǎn)類胡蘿卜素的相關(guān)因素進行了分析和篩選，結(jié)果表明，在PB試驗條件下，JLC發(fā)酵產(chǎn)類胡蘿卜素產(chǎn)量明顯提高，可達21.54 ?g/g。

目前關(guān)于利用廢棄煙梗發(fā)酵生產(chǎn)白僵菌的研究未見報道。本試驗以煙梗為主要發(fā)酵底料，在前期初步探究發(fā)酵因素（水分含量、發(fā)酵溫度、pH值等）的基礎(chǔ)上，進一步優(yōu)化完善培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝條件，以使廢棄煙梗利用率和白僵菌產(chǎn)孢量實現(xiàn)最大化。通過PB試驗從初選的相關(guān)因素中篩選出影響白僵菌產(chǎn)孢量的主要效應(yīng)因子，進一步設(shè)計最陡爬坡試驗逼近最優(yōu)條件區(qū)域，然后設(shè)計Box-Behnken Design-Response Surface Methodology（BBD-RSM）優(yōu)化，分析并確定最佳發(fā)酵條件，使白僵菌產(chǎn)孢量達到最大值，旨在為廢棄煙梗資源化應(yīng)用和生物防治領(lǐng)域相關(guān)微生物資源的開發(fā)提

供新思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料：廢棄煙梗，由天昌國際煙草有限公司提供（直徑為0.30～0.50 cm，長度為4.0～5.0 cm）。

1.2 煙梗預(yù)處理

將廢棄煙梗于60 ℃下烘干至恒重，粉碎過16目標(biāo)準(zhǔn)篩除塵，與蒸餾水按1∶3.5質(zhì)量比混合，常溫下浸泡16 h，1×105 Pa滅菌20 min作為廢棄煙梗發(fā)酵預(yù)培養(yǎng)基。

1.3 菌種及培養(yǎng)基

菌種：球孢白僵菌（Beauveria bassiana）（菌種編號：ACCC30713），商業(yè)菌種，菌種保藏及活化采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato Dextrose Agar，PDA）斜面培養(yǎng)基，瓊脂含量為1.8%，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配制方法參考文獻[23]；液體種子培養(yǎng)基，同PDA培養(yǎng)基，不加瓊脂即可；篩選固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)預(yù)處理的原梗10 g；蛋白胨，鄭州創(chuàng)生生物工程有限公司；酵母粉，英國OXOID公司；葡萄糖、NH4NO3、NaH2PO4、FeSO4、MnSO4均為分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心。

1.4 試驗方法

1.4.1 種子液的制備 從PDA斜面培養(yǎng)基上挑取白僵菌菌種，接入裝有50 mL液體種子培養(yǎng)基的錐形瓶中，28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)48 h。

1.4.2 Plackett-Burman試驗設(shè)計 選用N=12的Plackett-Burman（PB）設(shè)計對初選的影響廢棄煙梗發(fā)酵產(chǎn)白僵菌的9種相關(guān)因素：接種量、培養(yǎng)時間、葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、NH4NO3、NaH2PO4、MnSO4、FeSO4進行考察分析，以白僵菌孢子產(chǎn)量為響應(yīng)值，每種因素取高（+）低（?）兩個水平，高水平倍數(shù)不超過低水平2倍，因素之間間隔分布，每組3個重復(fù)，孢子產(chǎn)量取平均值，9種因素的編碼、單位及水平見表1。

表1 Plackett-Burman設(shè)計因素與水平

Table 1 Factors and levels in Plackett-Burman Design

編碼Code 因素Factor 水平Level

-1 +1

X1 接種量/% 5 10

X2 培養(yǎng)時間/d 5 10

X3 葡萄糖/% 0 0.2

X4 蛋白胨/% 0 0.5

X5 酵母粉/% 0 0.5

X6 NH4NO3/% 0 0.5

X7 NaH2PO4/% 0 0.2

X8 MnSO4/% 0 0.2

X9 FeSO4/% 0 0.2

1.4.3 最陡爬坡試驗設(shè)計 根據(jù)PB試驗選取對白僵菌孢子產(chǎn)量影響最顯著的3個因素：培養(yǎng)時間（X2）、蛋白胨含量（X4）、酵母粉含量（X5）進行最陡爬坡試驗。由于這3個因素對白僵菌孢子產(chǎn)量都有明顯的正效應(yīng)，因此將它們的含量逐漸增加以此來尋找最佳響應(yīng)區(qū)域，根據(jù)PB試驗結(jié)果設(shè)定變化方向與步長，每組3個重復(fù)，孢子產(chǎn)量取平均值，具體設(shè)計如表2所示。

1.4.4 BBD-RSM Design 采用Box-Behnken Design響應(yīng)面法，在PB試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)最陡爬坡試驗結(jié)果，設(shè)計Box-Behnken Design，每組處理3個重復(fù)，孢子產(chǎn)量取平均值，各因素及水平取值見表3。

1.4.5 白僵菌孢子數(shù)測定 發(fā)酵結(jié)束后向培養(yǎng)瓶中加入含有0.5 %吐溫80的蒸餾水70 mL，28 ℃、180 r/min條件下振蕩20 min，分兩次洗脫白僵菌孢子，將兩次洗脫液合并制成白僵菌孢子液，采用25×16型血球計數(shù)板直接計數(shù)，計算公式為：

白僵菌孢子數(shù)=50000×A×B×V/m

其中：A—5個中格內(nèi)白僵菌孢子的總數(shù)；

B—稀釋倍數(shù)；

V—白僵菌孢子液的體積；

m—物料的質(zhì)量

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0和Design-Expert 8.0.6進行統(tǒng)計和分析。

2 結(jié) 果

2.1 Plackett-Burman試驗

2.1.1 Plackett-Burman設(shè)計及響應(yīng)值 試驗方案及響應(yīng)值見表4。由表4可知，響應(yīng)值白僵菌孢子產(chǎn)量在試驗過程中變化幅度較大，表明所選因素對白僵菌產(chǎn)孢量有顯著影響。

表2 最陡爬坡試驗設(shè)計

Table 2 Design of Steepest Ascent Experiment

試驗組

Experimental group 培養(yǎng)時間

Incubation

time/d 蛋白胨

Peptone/% 酵母粉

Yeast powder/%

1 6 0.3 0.3

2 7 0.5 0.5

3 8 0.7 0.7

4 9 0.9 0.9

5 10 1.1 1.1

6 11 1.3 1.3

7 12 1.5 1.5

表3 Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平

Table 3 Factors and levels in Box-Behnken Design

因素Factor 水平Level

-1 0 1

培養(yǎng)時間/d

Incubation time/d 7 9 11

蛋白胨/%

Peptone/% 0.5 0.9 1.3

酵母粉/%

Yeast powder/% 0.5 0.9 1.3

表4 PB試驗設(shè)計及結(jié)果

Table 4 Design and results of Plackett-Burmant Design

試驗組 Experimental group X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 孢子產(chǎn)量 Spore yield/（109·g-1）

1 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 8.94

2 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 8.14

3 1 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 8.02

4 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 1 3.78

5 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 3.42

6 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 6.76

7 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 3.30

8 1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 1.67

9 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 7.28

10 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 4.99

11 1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 7.59

12 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 4.21

2.1.2 Plackett-Burman設(shè)計各因素效應(yīng)分析 各因素的影響度和模型貢獻率如表5所示。影響度[24]是指模型中的某個因素從低水平（?1）向高水平（+1）變化時對模型響應(yīng)值所產(chǎn)生的影響，其中負值表示該因素對響應(yīng)值具有負效應(yīng)，影響度值越大說明該影響因子對響應(yīng)值的影響越顯著。模型貢獻率[25]是指模型中某個因素的平方和占模型中所有因素平方和的總和的比例，其值大小表明該因素對響應(yīng)值影響程度的大小。

本試驗P值為0.0013，表明模型高度顯著。其中接種量、培養(yǎng)時間、蛋白胨、酵母粉、NH4NO3、NaH2PO4、MnSO4、FeSO4為有意義的模型參數(shù)（P值均小于0.05）。但是接種量、NH4NO3、NaH2PO4、MnSO4、FeSO4的模型貢獻率較低，對孢子產(chǎn)量影響較小。根據(jù)模型貢獻率、影響度和P值綜合評價，培養(yǎng)時間、蛋白胨含量、酵母粉含量為影響白僵菌產(chǎn)孢量的主要效應(yīng)因子，因此選取培養(yǎng)時間、蛋白胨、酵母粉3個因素，采用響應(yīng)面分析法作進一步的探究。

表5 PB試驗設(shè)計效應(yīng)分析

Table 5 Statistical analysis of Plackett-Burman design

因素

Factor 影響度/% 模型貢獻率/% P值

Effect/% Contribution/% P Value

模型 Model ― ― 0.0013

X1接種量 Inoculum concentration 6.51 2.03 0.007

X2培養(yǎng)時間 Incubation time 42.23 85.54 0.0002

X3葡萄糖 Glucose 0.59 0.017 ―

X4蛋白胨 Peptone 8.8 3.72 0.0038

X5酵母粉 Yeast powder 9.22 4.07 0.0035

X6 NH4NO3 6.39 1.96 0.0073

X7 NaH2PO4 2.7 0.35 0.0387

X8 MnSO4 -3.94 0.74 0.0188

X9 FeSO4 4.49 0.97 0.0145

2.2 最陡爬坡試驗結(jié)果

根據(jù)PB試驗結(jié)果，對白僵菌孢子產(chǎn)量影響最顯著的3個因素培養(yǎng)時間、蛋白胨含量、酵母粉含量設(shè)計最陡爬坡試驗，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，培養(yǎng)時間對白僵菌的孢子產(chǎn)量影響顯著，隨著培養(yǎng)時間的延長，孢子產(chǎn)量增加，且從試驗組3到試驗組4的孢子產(chǎn)量增幅最大、差異最為顯著，試驗組4到7的白僵菌孢子產(chǎn)量雖有所

注：圖中不同小寫字母表示在P<0.05水平上的顯著性差異。

Note： Values of spore yield marked by different lowercase letters in the graph indicate significant difference at the level of P<0.05.

圖1 最陡爬坡試驗結(jié)果

Fig. 1 Results of Steepest Ascent Design

增加，但差異均不明顯，而且考慮到延長培養(yǎng)時間會增加生產(chǎn)成本，因此以試驗組4為中心點，每個因素取3水平，以（?l，0，1）編碼，設(shè)計Box-Behnken Design，以篩選出培養(yǎng)時間、蛋白胨和酵母粉含量的最優(yōu)配比。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化

2.3.1 Box-Behnken試驗設(shè)計及響應(yīng)值 根據(jù)PB和最陡爬坡試驗結(jié)果，對選取的3種主要效應(yīng)因素培養(yǎng)時間（A）、蛋白胨（B）和酵母粉（C）含量進行Box-Behnken試驗，響應(yīng)值為孢子產(chǎn)量，設(shè)置17個試驗點，其中12個試驗點為析因點，其余5個試驗點為零點，零點的主要作用是估計試驗誤差，具體設(shè)計和響應(yīng)值見表6。

表6 Box-Behnken試驗設(shè)計及其試驗結(jié)果

Table 6 Experimental design and results of Box-Behnken Design

試驗組

Experimental group A B C 孢子產(chǎn)量

Spore yield/（109·g-1）

實際值

Experimental

value 預(yù)測值

Predicted

value

1 ?1 ?1 0 7.69 7.92

2 1 ?1 0 8.52 8.66

3 ?1 1 0 9.22 9.09

4 1 1 0 10.76 10.53

5 0 0 0 10.84 11.34

6 1 0 ?1 9.49 9.45

7 ?1 0 1 8.71 8.75

8 0 0 0 11.09 11.34

9 0 ?1 ?1 9.58 9.49

10 0 1 ?1 10.56 10.83

11 0 0 0 11.09 11.34

12 0 1 1 11.32 11.41

13 ?1 0 ?1 8.58 8.44

14 0 0 0 10.89 11.34

15 0 ?1 1 9.98 9.71

16 1 0 1 9.80 9.94

17 0 0 0 10.89 11.34

2.3.2 二次回歸模型擬合及方差分析 通過多元回歸法對試驗數(shù)據(jù)進行分析，得到回歸方程：

Y=11.34+0.55A+0.76B+0.20C+0.18AB+0.045AC+0.090BC-1.75A2-0.54B2-0.44C2

其中Y代表白僵菌孢子產(chǎn)量（109個/g），A、B和C分別代表培養(yǎng)時間/d、蛋白胨含量/%和酵母粉

含量/%。

方差分析結(jié)果如表7所示，模型P值為0.0003，表明該模型高度顯著。決定系數(shù)R2為0.9637，表明模型的相關(guān)性較好，變異系數(shù)為3.54 %，值較小，表明該模型能夠有效地反映真實值的情況。

表7 響應(yīng)面方差分析

Table 7 ANOVA for Box-Behnken Design

方差來源

Source of variance 平方和

Sum of square 自由度

Degree of freedom 均方

Mean of square F P 顯著性

Significance

模型

Model 23.51 9 2.61 20.67 0.0003 ***

A 2.39 1 2.39 18.89 0.0034

B 4.64 1 4.64 36.68 0.0005

C 0.32 1 0.32 2.53 0.1556

AB

AC 0.13

0.007 1

1 0.13

0.007 1.00

0.064 0.3513

0.8074

BC 0.032 1 0.032 0.26 0.6282

A2 12.95 1 12.95 102.46 <0.0001

B2 1.22 1 1.22 9.67 0.0171

C2 0.82 1 0.82 6.49 0.0383

殘差Residuals 0.88 7 0.13

失擬項Lack of fit 0.34 3 0.11 0.85 0.5341 ns

凈誤差Pure error 0.54 4 0.13

總差Total 24.40 16

R2-0.9637 R2adj-0.9171 R2pred-0.9393

Adeq Precision-12.813 C.V. %-3.54

注：***，P<0.001；ns，不顯著。Note： ***，P<0.001. ns means no significance.

2.3.3 響應(yīng)面分析及最佳發(fā)酵條件的確定 根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面和等高線圖，結(jié)果如圖2、3、4所示。由圖可知，培養(yǎng)時間（A）、蛋白胨含量（B）的交互作用以及培養(yǎng)時間（A）、酵母粉含量（C）的交互作用顯著，而蛋白胨含量（B）和酵母粉含量（C）交互作用不明顯。從響應(yīng)圖和模型分析可知回歸方程存在最大值，最優(yōu)條件為：培養(yǎng)時間9.40 d，蛋白胨1.21 %，酵母粉1.03 %時，白僵菌產(chǎn)孢量預(yù)測最優(yōu)值為1.17×1010個/g。

由圖2可知，當(dāng)培養(yǎng)時間（A）處于最優(yōu)值時，隨著蛋白胨含量（B）的增加，白僵菌孢子產(chǎn)量逐漸升高，但升高幅度不明顯，表明蛋白胨含量對白僵菌孢子產(chǎn)量有一定的影響。當(dāng)?shù)鞍纂说暮刻幱谝欢ǚ秶鷥?nèi)，隨著培養(yǎng)時間的延長，白僵菌孢子產(chǎn)量先增加后減少，變化幅度較大，表明培養(yǎng)時間的變化對白僵菌孢子產(chǎn)量具有顯著的影響，培養(yǎng)時間過短或過長都不利于白僵菌孢子產(chǎn)量的提高。培養(yǎng)時間與蛋白胨含量交互作用的等高線圖呈橢圓形，表明交互作用顯著。

圖2 培養(yǎng)時間（A）與蛋白胨含量（B）交互作用對白僵菌產(chǎn)孢量的響應(yīng)面與等高線圖

Fig. 2 Surface and contour plot showing interactions between incubation time （A） and peptone concentration （B） on spore content of Beauveria bassiana

由圖3可知，當(dāng)酵母粉含量（C）處于最優(yōu)值時，隨著培養(yǎng)時間（A）的逐漸延長，白僵菌孢子產(chǎn)量先增加后減少，表明培養(yǎng)時間的變化對白僵菌孢子產(chǎn)量具有顯著的影響，培養(yǎng)時間過短或過長，都不利于固態(tài)發(fā)酵白僵菌孢子產(chǎn)量的增加。當(dāng)培養(yǎng)時間處于一定范圍內(nèi)，隨著酵母粉含量的增加，白僵菌孢子產(chǎn)量沒有明顯的變化，表明酵母粉含量對白僵菌孢子產(chǎn)量的影響不顯著。培養(yǎng)時間和酵母粉含量交互作用的等高線圖接近橢圓形，表明交互作用顯著。

由圖4可知，當(dāng)?shù)鞍纂撕浚˙）處于一定范圍內(nèi)，隨著酵母粉含量（C）的增加，孢子產(chǎn)量幾

乎沒有變化，表明酵母粉含量對白僵菌產(chǎn)孢量影響不顯著；當(dāng)酵母粉含量處于一定范圍內(nèi)，隨著蛋白胨含量的增加，白僵菌孢子產(chǎn)量逐漸增加，表明蛋白胨含量對白僵菌孢子產(chǎn)量影響明顯。蛋白胨與酵母粉含量交互作用的等高線圖接近圓形，表明交互作用不顯著。

圖3 培養(yǎng)時間（A）與酵母粉（C）交互作用對白僵菌產(chǎn)孢量的響應(yīng)面與等高線圖

Fig. 3 Surface and contour plot showing interactions between incubation time （A） and yeast powder concentration （C） on spore content of Beauveria bassiana

圖4 蛋白胨（B）與酵母粉（C）交互作用對白僵菌產(chǎn)孢量的響應(yīng)面與等高線圖

Fig. 4 Surface and contour plot showing interactions between peptone concentration （B） and yeast powder concentration （C） on spore content of Beauveria bassiana

2.3.4 模型驗證 通過BBD-RSM優(yōu)化得到利用廢棄煙梗發(fā)酵產(chǎn)白僵菌的最佳條件為：蛋白胨1.21%，酵母粉1.03%，培養(yǎng)時間9.40 d時，白僵菌孢子產(chǎn)量預(yù)測最優(yōu)值為1.17×1010個/g。以此條件進行發(fā)酵試驗，得到實際孢子產(chǎn)量為1.13×1010個/g（3次重復(fù)平均值），擬合度達到96.58 %，表明通過響應(yīng)面法對發(fā)酵廢棄煙梗產(chǎn)白僵菌工藝條件的優(yōu)化合理而有效，具有實際意義。

3 討 論

本試驗利用廢棄煙梗作為固態(tài)發(fā)酵白僵菌的主要基質(zhì)，通過添加適量的葡萄糖作為碳源，適量蛋白胨和酵母粉作為有機氮源，NH4NO3為無機氮源補充營養(yǎng)，并添加無機鹽NaH2PO4、MnSO4、FeSO4作為礦質(zhì)元素促進白僵菌孢子的萌發(fā)和產(chǎn)量的提高。通過Plackett-Burman試驗篩選出對白僵菌孢子產(chǎn)量影響最顯著的3個因素：培養(yǎng)時間、蛋白胨和酵母粉含量。其中培養(yǎng)時間對白僵菌孢子產(chǎn)量的影響度和模型貢獻率最高，表明廢棄煙梗發(fā)酵培

養(yǎng)基可以為白僵菌的生長提供充足的營養(yǎng)，在一定范圍內(nèi)隨著培養(yǎng)時間的延長，孢子產(chǎn)量呈現(xiàn)增加趨勢，但考慮到過程中孢子產(chǎn)量、變化幅度以及工業(yè)生產(chǎn)成本等方面，應(yīng)根據(jù)實際情況進行適當(dāng)?shù)目刂?。接種量是與發(fā)酵培養(yǎng)基利用率直接相關(guān)的參數(shù)，高的接種量盡管可以使菌體生長快、周期短，但后期可能因缺乏營養(yǎng)而無法提高孢子產(chǎn)量；而接種量太低則會造成營養(yǎng)利用不充分，導(dǎo)致發(fā)酵周期的延長，染菌機率增高[26]，本試驗中接種量的大小對白僵菌孢子產(chǎn)量的提高沒有明顯的促進作用，表明煙梗中營養(yǎng)成分豐富，可以滿足白僵菌的生長，而且接種量過高也會增加生產(chǎn)成本，因此選用5%的接種量進行后續(xù)試驗，結(jié)果表明白僵菌生長情況良好，孢子產(chǎn)量較高，因此在本試驗中不需要補充額外的糖類，而且糖類含量過高易使發(fā)酵前期產(chǎn)酸增加，導(dǎo)致發(fā)酵基質(zhì)pH降低，不利于白僵菌的生長。氮素是真菌合成核酸、氨基酸、細胞質(zhì)和蛋白質(zhì)的主要物質(zhì)，有機氮源蛋白胨和酵母粉比無機氮源NH4NO3更適合白僵菌的生長，氮源的添加可以改善煙梗發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮比，提高發(fā)酵性能，提升產(chǎn)品品質(zhì)[27]。在白僵菌的生長中，許多礦質(zhì)元素都直接參與細胞的組成、能量的轉(zhuǎn)移、維持原生質(zhì)的膠質(zhì)體系和滲透性，對菌體生長起著重要的作用[28]。本試驗中NaH2PO4、MnSO4、和FeSO4的影響度和模型貢獻率均較低，對孢子產(chǎn)量的提高影響不大，表明煙梗中無機鹽的種類和含量豐富，在固態(tài)發(fā)酵白僵菌的過程中不需要補充額外的無機鹽。

4 結(jié) 論

通過響應(yīng)面優(yōu)化，綜合分析得到廢棄煙梗發(fā)酵產(chǎn)白僵菌的最佳工藝條件為：發(fā)酵溫度28 ℃，起始pH 6.0，m（煙梗）∶m（水）=1∶3.5，蛋白胨1.21 %，酵母粉1.03 %，培養(yǎng)時間9.40 d。在此條件下，白僵菌產(chǎn)孢量理論值為1.17×1010個/g，實際孢子產(chǎn)量為1.13×1010個/g，擬合度達到96.58 %。本研究探究并優(yōu)化了廢棄煙梗固態(tài)發(fā)酵白僵菌的工藝條件，顯著提高了白僵菌產(chǎn)孢量，為廢棄煙梗的資源化利用、煙草生物防治領(lǐng)域的后續(xù)研究和開發(fā)提供理論

依據(jù)與技術(shù)支持。

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