高效液相色譜儀用于肉制品氯霉素殘留檢測的探討

李夢琪 盧偉峰 褚應君 馬淑麗 于雪雙 李陽 馬悅 孫威 葛杰

[摘要] 該文通過對氯霉素藥物殘留檢測方法的建立及探討以期對我國食品（尤其是動物性食品）中氯霉素類藥物的殘留檢測方法提供一定的技術支持。該實驗通過建立高效液相色譜法（HPLC）市售禽畜肉氯霉素含量，以便了解市售禽畜肉氯霉素的殘留現(xiàn)狀并對檢測方法進行探討，為食品安全監(jiān)管部門提供檢測方法和信息。通過建立高效液相色譜法對禽畜肉食品中氯霉素殘留檢測，該方法可靠、準確、靈敏度高；線性范圍、回收率、精密度較好，同時參考其部分缺點應適當考慮聯(lián)合其他方法改進完善，建立更為高效、更為適合的禽畜肉食品中氯霉素殘留檢測方法。

[關鍵詞] 禽畜肉食品；抗生素；氯霉素；高效液相色譜

[中圖分類號] R1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1672-5654（2018）04（c）-0173-04

Study on High Performance Liquid Chromatography in the Test of Chloramphenicol Residue of Meat Products

LI Meng-qi， LU Wei-feng， CHU Ying-jun， MA Shu-li， YU Xue-shuang， LI Yang， MA Yue， SUN Wei， GE Jie

Qiqihar Medical College， Qiqihar， Heilongjiang Province， 161006 China

[Abstract] The paper provides a certain technological support by establishment of chloramphenicol residue test method. The paper establishes the chloramphenicol content of poultry and livestock meat for sales by HPLC in order to know the chloramphenicol residue status and study the test method thus providing test method and information for the food security supervision departments， and the method is reliable and accurate with high sensitivity， and better liner range， cycle rate and precision， at the same time， we should properly consider the improvement combined with the other methods according to some disadvantages， to establish the more effective and proper chloramphenicol residue of meat products.

[Key words] Poultry and livestock meat； Antibiotic； Chloramphenicol； HPLC

近年來，禽畜肉食品的安全問題已為社會所共同關注，而其中最常見和最重要的污染源為氯霉素。氯霉素的不規(guī)范使用極易導致動物體內(nèi)藥物的滯留、蓄積，并以殘留的方式通過食物鏈進入人體和生態(tài)系統(tǒng)。人們長期攝入含氯霉素的食品后，抗生素在人體內(nèi)不斷蓄積，當積累到一定程度后，就會對人體產(chǎn)生毒性作用，導致人的過敏反應、致畸、致突變和激素樣作用等方面的不利影響。

氯霉素檢測方法比較多，主要有微生物檢測技術、免疫檢測技術、理化檢測技術等，如高效液相色譜法、氣相色譜法、質譜法、TLC法聯(lián)用技術（常見的聯(lián)用技術有TLC-MS、GC-MS、LC-MS、CZE-MS、LC-NMR、SFC-MC）等等。該文采用高效液相色譜法測定市售禽畜肉氯霉素含量，參考《畜禽肉中氯霉素的測定（SB/T 10386—2004）》，并在此基礎上進行調整。

1 實驗材料

1.1 儀器

液相色譜系統(tǒng)[1]：LC-5510型高效液相色譜儀、紫外-可見光檢測器、P-101A高壓恒流泵、DW-101在線脫洗器、LC-5510色譜工作站；LDZ5-2低速自動平衡離心機；RE-5299旋轉蒸發(fā)器；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵；QL-861渦流振蕩器；KQ-500型超聲波清洗器；DS-1高速組織搗碎機；AL204電子天平；0.22 μm有機微孔濾膜；0.45 μm水相膜；5 mL注射器；10 μL微量進樣針；冰箱；各種玻璃儀器。

1.2 試劑

氯霉素標準品；乙酸乙酯；甲醇；正己烷。實驗用水均為超純水。甲醇為色譜級，其他試劑為分析純。

1.3 樣品

市售雞肉、豬肉和牛肉的肌肉組織樣品和雞肝臟、豬肝臟和牛肝臟樣品。

2 實驗方法

該實驗方法參考《畜禽肉中氯霉素的測定（SB/T 10386—2004）》，并在此基礎上進行調整。

2.1 標準溶液的配制

①氯霉素標準儲備液的配制。準確稱取0.010 g氯霉素標準品，置于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。此溶液濃度為0.10 mg/mL，置于冰箱中保存，有效期3個月。

②氯霉素標準工作液的配制。準確吸取5.0 mL氯霉素標準儲備液于50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度。此溶液濃度10.0 μg/mL，置于冰箱保存。有效期半個月。臨用前取此液用甲醇稀釋成適當濃度的標準工作液。

③標準工作溶液系列的配制。用精密移液管分別吸取5、10、20、30、40、50 mL工作液于6個50 mL容量瓶中，分別用甲醇定容至刻度，混勻。配制為1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/mL標準工作溶液。

2.2 流動相的配制

將甲醇（色譜純）經(jīng)溶劑過濾器過濾兩遍，純水機取超純水經(jīng)溶劑過濾器過濾兩遍。準確吸取700 mL甲醇溶液，300 mL超純水，將甲醇溶液與超純水以70：30體積比混合。

2.3 樣品前處理方法

①提取。取200 g試樣絞碎，稱取20 g（精確至0.01 g）絞碎后的試樣，置于100 mL具塞三角瓶中，加入40 mL乙酸乙酯，振搖，超聲提取30 min，過濾，濾液放于另一三角瓶中。再加入20 mL乙酸乙酯于試樣中，超聲提取15 min，過濾，濾液合并，濾渣再加20 mL乙酸乙酯超聲提取15 min，過濾，濾液合并，全部濾液合并轉入濃縮瓶中[2]。

②凈化。將合并的濾液于52～55℃水浴旋轉蒸發(fā)儀上濃縮至干。準確加入1.0 mL甲醇溶液洗滌濃縮瓶中殘留物，再加入1 mL正己烷，振搖1 min，將全部溶液轉移至5.0 mL試管中，靜置分層，吸棄正己烷層，再加入2 mL正己烷提取脂肪，再吸棄正已烷層[3]。

③過濾。將樣品溶液過0. 45 μm有機微孔濾膜，直至溶液不分層、無渾濁為止，進行HPLC分析。

2.4 色譜條件

色譜柱：Symmetry C18，150 mm×4.6 mm，5 m；甲醇、超純水以體積比70：30混合；流動相流速為1.0 mL/min；進樣量10 μL；檢測波長280 nm；柱溫：20℃。

2.5 樣品測定

分別用進樣器吸取10 μL雞肉、豬肉和牛肉的肌肉組織樣品和雞肝臟、豬肝臟和牛肝臟樣品溶液和氯霉素標準系列溶液，進行單點和多點校準。根據(jù)溶液所得色譜圖，觀察每個色譜圖出峰的保留時間（結合最大吸收波長、峰純度、峰的匹配程度）以定性，依據(jù)峰面積積分值定量，保證雞肉、豬肉和牛肉的肌肉組織樣品和雞肝臟、豬肝臟和牛肝臟樣品溶液及標準系列溶液中氯霉素含量的響應值在儀器檢測的線性范圍內(nèi)。

2.6 計算公式

①樣品中氯霉素殘留量的計算，將標準曲線各點的濃度與對應的峰面積進行回歸分析，然后按照下式分別計算供試樣中氯霉素的含量。

式中：X——樣品中氯霉素的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）

c——被測液中氯霉素的含量，單位為微克每毫升（μg/mL）

V——被測液體積，單位為毫升（mL）

m——樣品質量，單位為克（g）

②精密度的計算。相對標準偏差（RSD）的計算公式為：

其中，SD（標準偏差）的計算公式為：

式中：Xi——單次分析數(shù)值；X——樣品分析結果的平均值； n——測量次數(shù)，n=1，2，3，...，n

③回收率的計算

式中測量值、添加量根據(jù)計算方法①（氯霉素殘留量的計算）、所測的峰面積以及所得的標準曲線獲得。

3 結果

3.1 工作曲線的繪制

按實驗方法配制1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/mL氯霉素標準系列工作溶液，進樣10 μL進行測定，每個濃度濃度進樣3次，3次進樣峰面積取平均值，將其所得的峰面積值與對應的標準溶液濃度作散點圖，依據(jù)散點圖確定標準曲線的線性范圍，進行定量分析。求得回歸方程為，決定系數(shù)為0.99 939，線性范圍是1～10 μg/mL。氯霉素標準系列溶液工作曲線見圖1。

圖1 氯霉素標準系列溶液工作曲線

3.2 精密度

取2 μg/mL和4 μg/mL氯霉素標準品溶液，在選定的色譜及質譜條件下，于0、1、2、3、4、5 h分別進樣測定，每次進樣10 μL，根據(jù)峰面積算得RSD分別為0.78%和0.85%（表1）。說明該方法的重現(xiàn)性良好。

表1 2 μg/mL和4 μg/mL氯霉素標準品重復性實驗

3.3 回收率

在禽畜肉（雞肉、牛肉、豬肉各3份，每份20.00 g）樣品中，分別加入10 μg /mL氯霉素標準工作溶液，按測定0.5、0.75、1.0 mL 3個水平濃度添加混合標準液進行回收實驗。按照上述方法進行樣品前處理，HPLC測定，每個濃度樣品重復測定3次，分別計算回收率[5]，結果見表6。結果顯示：在雞肉、豬肉和牛肉中氯霉素的回收率分別是91.33%～93.8%，89.62%～90.33%，94.68%～96.24%。

3.4 樣品檢測

分別取不同樣品溶液（雞肉、豬肉和牛肉的肌肉組織樣品和雞肝臟、豬肝臟和牛肝臟樣品溶液）10 μL，注入高效液相色譜儀中，每一樣品進樣3次，測得的峰面積值帶入工作曲線計算出相應的氯霉素濃度。結果顯示，雞肉、豬肉和牛肉的肌肉組織樣品溶液均未在保留時間4.5 min左右出峰，而加入標準氯霉素后的樣品溶液在4.5 min左右均出峰。由此得知，樣品（雞肉、豬肉和牛肉的肌肉組織樣品）溶液中均未檢出氯霉素。

4 討論

4.1 實驗方法的優(yōu)缺點

高效液相色譜法兼分離、定量和定性于一體，特別適用于確證性分析。該法靈敏度高，抗干擾能力強，具有精確可靠、重復性好、靈敏度高、假陽性少等優(yōu)點[6]，它也是美國 FDA 推薦使用的氯霉素確證方法。

其缺點也同樣包括處理過程復雜、耗時長、成本高、分析速度慢、回收率偏低等諸多方面，運行成本高，檢測過程復雜，勞動強度大，不適合用于大規(guī)模的樣品檢測[7]。

4.2 實驗條件的優(yōu)化

①流動相的優(yōu)化。為了使物質分離較好和靈敏度高，需要對流動相條件進行選擇。該次實驗嘗試以甲醇-超純水（45：55）、甲醇-超純水（60：40）、甲醇-超純水（70：30）、甲醇-超純水（75：25）組成的流動相體系。結果發(fā)現(xiàn)，從保留時間與樣品雜峰的分離上考慮，以甲醇-超純水（70：30）作為流動相時，各組分得到較好的分離，減小樣品雜峰的干擾。

②檢測波長的優(yōu)化。根據(jù)相關等研究得知[6]，在230 nm，270 nm波長處氯霉素都有較好的吸收。在相同的分離條件下，分別用230 nm，270 nm波長對加標樣品進行檢測，實驗發(fā)現(xiàn)：在230 nm，270 nm波長處測定都未能有效分離，并共存干擾物的影響。由于該次實驗使用LC-5510型高效液相色譜儀，其最優(yōu)吸收波長為280 nm。嘗試將檢測波長調整為280 nm時，氯霉素吸收增大，能有效分離，并無共存干擾物的影響。因此，該實驗采用280 nm波長進行檢測。

③柱溫的優(yōu)化。柱溫是影響組分分離度的因素之一，該研究比較了氯霉素在流動相及流速固定條件下，柱溫分別為17、18、19、20℃時的保留時間和分離效果，柱溫為17℃和20℃時，各物質保留時間變異很小，且分離效果較好，出峰形狀良好；當柱溫升高到25℃時，其保留時間變短且分離度變差；柱溫20℃時，基線較平穩(wěn)，氯霉素與雜質分離效果較好，出峰形狀良好，并且有利于氯霉素信號的辨別，故該實驗柱溫選20℃。

④色譜柱的優(yōu)化。目前，是最普遍采用的柱填料是非極性烷基鍵合相。其中十八烷基硅烷鍵合相（octadecylsilyl，ODS）在反相液相色譜中起著舉足輕重的作用，它可完成高效液相色譜分析任務的70%～80%。反相液相色譜系統(tǒng)操作簡便，重復性與穩(wěn)定性較好，是一種通用型液相色譜分析方法。它可將極性、非極性；離子型、非離子型；水溶性、脂溶性；小分子、大分子等幾乎遍及所有類型的有機化合物作為分析對象；同時也能將具有官能團差別或分子量差別的同系物用反相液相色譜技術實現(xiàn)分離。因此氯霉素作為中等極性化合物，反相柱的分離方法可以適用。文獻中多用C18柱進行分離，根據(jù)現(xiàn)有實驗條件，采用Symmetry C18，150 mm×4.6 mm，5 μm液相色譜柱。

⑤提取試劑的優(yōu)化。該實驗方法參考《畜禽肉中氯霉素的測定（SB/T 10386—2004）》，并在此基礎上進行調整。進過反復預實驗發(fā)現(xiàn)加入高氯酸溶液提取樣品后，進樣測得保留時間提前，高氯酸出現(xiàn)分離峰并遮擋氯霉素標準品出峰，經(jīng)過反復試驗改良，將高氯酸替換為甲醇進行標準系列濃度的配制和樣品前處理。結果繪制標準曲線滿意，濃度與峰面積線性關系良好，樣品出峰良好。

4.3 實驗方法優(yōu)化

①色譜-質譜聯(lián)用。采用色譜-質譜聯(lián)用的方法能夠同時發(fā)揮色譜和質譜的優(yōu)點。主要有氣相色譜-質譜聯(lián)用（gas chromatograph-mass spectrometer， GC-MS）和液相色譜串聯(lián)質譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS/MS）法。國標方法中氯霉素類藥物的檢測方法采用GC-MS和LC-MS/MS[8]。其中氣相色譜法采用負化學源，具有較高的靈敏度，CAP的檢出限為0.1 g/kg、FF以及TAP的檢出限為0.5 μg/kg。由此使液相色譜-質譜或質譜法三者的檢出限達到0.1 μg/kg。在孫雷等的研究中[9]牛乳、豬肝、豬肉中CAP、TAP、F F和FFa殘留檢測采用超高液相色譜-串聯(lián)質譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）分析方法。與其他方法不同的是，提取藥物殘留使用堿性的乙酸乙酯，再用正己烷去除基質中的脂肪，這樣可以省去固相萃取的步驟。這種方法能夠做到在2～500 μg/mL的質量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關系，保證檢測物質平均回收率均在70%～120%范圍內(nèi)。在楊成對等（2004）用 HPLC-MS 方法定量檢測對蝦中微量的氯霉素殘留[10]研究中。采用乙酸乙酯超聲提取對蝦組織中的氯霉素殘留，并以甲醇為流動相，氯霉素的檢測離子對的選擇被設計為m/z321/152，再利用多反應監(jiān)測（MRM）技術進行測定。做到檢測的線性范圍是 0.28～28.0 ug/L；相關系數(shù)為0.999 91。氯霉素的定量檢測下限是 0.07 ug/kg，保證平均回收率在 89% 以上。同單一高效液相色譜法檢測氯霉素殘留相比可以看出其靈敏度較高、準確性良好、檢測范圍較廣、應用性更強。

雖然采用色譜-質譜聯(lián)用的分析方法具有準確、靈敏、檢測限低等優(yōu)點，但同時樣品的前處理復雜、的大型精密儀器的要求較高、檢測費用居高不下，大大增加了檢測的復雜程度和推廣難度[11]。

②酶聯(lián)免疫法與液相色譜-質譜法聯(lián)用。在高效液相色譜法或質譜法測定動物源性食品中氯霉素殘留量實際操作過程中發(fā)現(xiàn)，在兩種方法的比較之下酶聯(lián)免疫法擁有操作簡便、靈敏度高、樣品預處理簡單的優(yōu)點，能夠進行批量檢測，分析成本低。但是酶聯(lián)免疫法缺點在于影響結果的因素較多，易出現(xiàn)假陽性結果，這種方法在檢出低含量樣品的時候尤其值得注意。另外，抗體批次不同， 測定結果也會出現(xiàn)差異等，但該法作為一種快速篩選手段，使得其在現(xiàn)場監(jiān)控和大規(guī)模篩選檢測中有廣闊的應用前景[12]。液相色譜 -質譜聯(lián)用技術兼分離、定量和定性于一體，特別適用于確證性分析。該法靈敏度高，抗干擾能力強，是美國FDA推薦使用的氯霉素確證方法，但是運行成本高，檢測過程復雜，勞動強度大。通過以上比較分析，在實際檢測工作中可采取先用酶聯(lián)免疫法作初步篩選，把檢出陽性反應的樣品進一步使用液質聯(lián)用法進行定性和定量，這種聯(lián)用的方法能夠大大減少檢測費用以及降低勞動強度[13]。

綜上所述，在現(xiàn)有的氯霉素殘留的檢測方法中，色譜法、色/質譜聯(lián)用法依舊是目前國際上公認的確證方法，但同時其仍需不斷地加以完善，以求簡化操作過程、改進儀器設備、降低檢測成本。作為半確證篩選方法的酶聯(lián)免疫吸附法，與色/質譜聯(lián)用技術等確證方法的配合使用，將是今后氯霉素殘留檢測的具有前景的發(fā)展趨勢[7]。

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（收稿日期：2018-01-22）