甘藍(lán)抗軟腐病離體鑒定方法探究

馬燕勤 李勤菲 司軍

摘要 通過(guò)分析不同因素對(duì)甘藍(lán)軟腐病離體接種后發(fā)病效率的影響，建立了一套甘藍(lán)軟腐病抗性的快速鑒定方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用濃度為6.4×10.8 cfu/mL的軟腐病液體培養(yǎng)基懸浮液，采用針刺法接種苗齡為5～7葉期植株的離體葉片，接種后空氣濕度為90%以上是最有利于軟腐病發(fā)病的方法。利用該方法鑒定27份栽培甘藍(lán)，發(fā)現(xiàn)高抗材料3份，抗病材料8份，耐病材料8份，感病材料8份。

關(guān)鍵詞 甘藍(lán)； 軟腐?。?離體抗性鑒定

中圖分類號(hào)： S 436.33

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017460

Abstract A multifactor experiment with three duplicates was established to investigate three different inoculation techniques （transaction inoculation， injection and pin prick） by using pathogenic isolates ofPectobacterium carotovorumsubsp.carotovorum in China against resistant and susceptible cabbage cultivars under controlled greenhouse conditions. It was found that the method with the pathogen suspended in the liquid NA medium at the density of 6.4×10.8cfu/mL， inoculating plants at the seedling age of 5-7-leaf old by pin prick in the growth chamber with a high moisture of over 90%， was suitable for the pathogen to infect the cabbage leaves. This method was used to identify resistance to soft rot in 27 cabbage cultivars， three of which showed high resistance， eight moderate resistance， eight tolerance and eight susceptibility to soft rot.

Key words cabbage； soft rot； resistance identification

甘藍(lán)軟腐病，又稱水爛、爛疙瘩，是甘藍(lán)包心后期的主要病害之一，可使甘藍(lán)嚴(yán)重減產(chǎn)，甚至絕收，而且在收獲、運(yùn)輸、儲(chǔ)藏、銷售等過(guò)程中還可繼續(xù)腐爛，造成極大損失[1]。病害從傷口部開(kāi)始發(fā)生，初期呈現(xiàn)浸潤(rùn)狀半透明，以后病部逐漸擴(kuò)展成明顯的水潰狀，表皮下陷，有污白色細(xì)菌溢膿，并散發(fā)出惡臭。重病植株的葉柄基部和根莖處組織完全腐爛，病株變得一踢即倒，一拎即起[2]。植物細(xì)菌性軟腐病的主要致病菌為果膠桿菌Pectobacterium spp.。該菌可侵染至少16種雙子葉植物和11種單子葉被子植物[3]。該屬目前被劃分成4個(gè)種，P.carotovorum（Pc），P.atrosepticum （Pa），P.betavasculorum（Pb）和P.wasabiae（Pw）[4]。與后三個(gè)種相比，Pc表現(xiàn)出高度多樣性[5]，可進(jìn)一步描述為3個(gè)亞種：P.c.subsp.carotovorum（Pcc），P.c.subsp.odoriferum（Pco）和P.c.subsp.brasilience（Pcb）[6]。

Pcc是自然條件下普遍存在的、寄主范圍和地理分布最為廣泛的植物病原菌[7]，能侵染溫帶和亞熱帶種植的馬鈴薯、白菜、甘藍(lán)等數(shù)百種蔬菜和某些花卉植物[8-9]，2011年馬來(lái)西亞學(xué)者報(bào)道稱甘藍(lán)軟腐病的致病病原菌為Pcc[10]。甘藍(lán)Brassica oleracea L.作為一種主要的蔬菜作物在我國(guó)各地廣泛栽培，近年來(lái)隨著國(guó)內(nèi)周年供應(yīng)需求及出口貿(mào)易的增加，甘藍(lán)種植面積逐年擴(kuò)大，現(xiàn)已達(dá)到了每年90萬(wàn)hm.2，成為占據(jù)國(guó)內(nèi)市場(chǎng)主導(dǎo)地位的蔬菜之一。對(duì)軟腐病的防治有多種方法，例如生物學(xué)方法防治，有報(bào)道稱乳酸菌[11]能有效防治田間軟腐??；物理防治，如γ射線[12]；而培育和選育抗病品種也是防治植物病害的重要措施，植物品種抗病性的鑒定是抗病育種的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)。

本試驗(yàn)參考大白菜軟腐病抗性鑒定方法[13-15]，通過(guò)對(duì)現(xiàn)有甘藍(lán)種質(zhì)資源的抗性進(jìn)行苗期室內(nèi)鑒定探究，旨在找到一種快速簡(jiǎn)單的甘藍(lán)軟腐病抗性鑒定方法，并對(duì)甘藍(lán)資源材料進(jìn)行初步鑒定，為甘藍(lán)抗軟腐病綜合育種工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株：Pectobacterium carotovorumsubsp.carotovorum（Pcc），采購(gòu)于中國(guó)微生物官網(wǎng)。

供試品種：由西南大學(xué)十字花科蔬菜研究室提供的有明顯抗性差異的3個(gè)材料R1、R2和R3，以及該實(shí)驗(yàn)室種質(zhì)資源圃自交系穩(wěn)定的24份材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 甘藍(lán)育苗

育苗工作在封閉完好的防蟲(chóng)玻璃溫室內(nèi)進(jìn)行。使用高溫滅菌的營(yíng)養(yǎng)土及4孔×8孔的穴盤(pán)育苗，選擇充實(shí)飽滿、發(fā)芽勢(shì)一致的種子，每穴2粒，覆土厚度0.8～1.0 cm。每個(gè)材料育30株，苗齡在5～6葉期時(shí)接種。

1.2.2 菌懸液的制備

在苗期抗性鑒定前2 d，用NA液體培養(yǎng)基制備菌懸液，菌懸液放在28℃的搖床上培養(yǎng)24 h，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)[16]，根據(jù)各試驗(yàn)的需要分別配制為含菌量6.4×10.7、6.4×10.8、6.4×10.9 cfu/mL的菌懸液，供接種鑒定用。

1.2.3 最佳接種濕度的確定

采用針刺法研究接種后不同濕度對(duì)甘藍(lán)軟腐病的影響。甘藍(lán)品種為‘京豐一號(hào)。在甘藍(lán)苗齡為 5～6葉期時(shí)取健康外葉，每個(gè)處理采摘10株，每株采摘3片葉，用流水沖洗1 min，然后用75%的乙醇溶液處理30 s，再用無(wú)菌水漂洗3遍，將處理后的離體甘藍(lán)葉片排入 20 cm×15 cm×6 cm的塑料盒中，用大小相同的針10根捆成一束在離體葉片的葉脈基部針刺，用移液管或槍吸取10 μL濃度為6.4×10.9cfu/mL的菌懸液緩慢地注入傷口表面，接種后置于空氣濕度分別為50%～60%、70%～80%、90%～100%的條件下，72 h后調(diào)查、記錄發(fā)病程度。

1.2.4 接種苗齡、方法和接種液的確定

以R2為材料，采用L9（3.4）正交設(shè)計(jì)[17-18]。分別設(shè)置接種苗齡、接種方法和接種液3個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平（表1），試驗(yàn)重復(fù)3次。接種用菌懸液濃度為64×10.9cfu/mL。

1.2.5 最佳接種濃度的確定

將Pcc菌懸液配制成6.4×10.7、6.4×10.8、6.4×10.9cfu/mL 3個(gè)不同濃度的菌懸液，利用篩選出的苗期人工離體接種方法、苗齡和接種液，接種3個(gè)有抗性差異的材料R1、R2、R3。相對(duì)濕度為確定的最佳接種濕度。

1.2.6 病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的制定

參考大白菜[17-18]和擬南芥[19]軟腐病單株分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，并根據(jù)預(yù)試驗(yàn)中甘藍(lán)離體葉片被軟腐病病原菌侵染后出現(xiàn)的表型，將病情劃分為6個(gè)級(jí)別。0級(jí)：接種點(diǎn)無(wú)侵染病癥；1級(jí)：病斑剛開(kāi)始形成，呈水浸狀；3級(jí)：病斑長(zhǎng)度<1 cm；5級(jí)：1 cm≤病斑長(zhǎng)度<2 cm；7級(jí)：2 cm≤病斑長(zhǎng)度<3 cm；9級(jí)：病斑長(zhǎng)度≥3 cm或者葉柄大部或全部腐爛。

1.2.7 群體分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照“九五”國(guó)家攻關(guān)組制定的病毒病和霜霉病的群體分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。免疫（I）： 病情指數(shù)為0.00；高抗（HR）： 0.00<病情指數(shù)≤11.11；抗?。≧）： 11.11<病情指數(shù)≤33.33；耐?。═）： 33.33<病情指數(shù)≤55.55；感?。⊿）： 55.55<病情指數(shù)≤77.77；高感（HS）： 77.77<病情指數(shù)≤100。

病情指數(shù)=100×∑（各級(jí)病株數(shù)×各級(jí)代表值）/（總株數(shù)×最高級(jí)代表值）。

1.2.8 27份材料的抗性鑒定

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)得出的最佳接種方法對(duì)27份現(xiàn)有的甘藍(lán)種質(zhì)資源進(jìn)行抗病性鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍(lán)軟腐病離體抗性鑒定方法

2.1.1 不同接種濕度對(duì)甘藍(lán)軟腐病發(fā)病的影響

采用針刺法研究接種后不同濕度對(duì)甘藍(lán)軟腐病發(fā)病的影響。對(duì)3個(gè)相對(duì)濕度下的病情指數(shù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明F值為26.94，F(xiàn)>F0.01=18.00， 因此需要對(duì)3個(gè)接種濕度做顯著差異性分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

從表中可以看出， 接種濕度在90%～100%時(shí)甘藍(lán)軟腐病的病情指數(shù)最高，極顯著高于接種濕度為70%～80%和 50%～60%的病情指數(shù)；接種濕度為70%～80%的病情指數(shù)顯著高于接種濕度為50%～60%的病情指數(shù)。由此可以得出：空氣相對(duì)濕度高有利于甘藍(lán)軟腐病的發(fā)生。

2.1.2 接種方法、苗齡、接種液對(duì)甘藍(lán)軟腐病發(fā)病的影響

從方差分析來(lái)看苗齡（A因素）、接種方法（B因素）的F值分別為12.19和20.62，達(dá)到極顯著水平，接種液（C因素）的F值為4.48，達(dá)到顯著水平。從表4還可以看出接種方法較苗齡和接種液而言，影響最大，苗齡次之，接種液的影響最小。由于試驗(yàn)前不能確定三因素間有無(wú)明顯交互作用，三因素的各水平間無(wú)法進(jìn)行差異比較，因此本試驗(yàn)主要是確定不同處理組合間的差異比較，對(duì)組合進(jìn)行新復(fù)極差檢驗(yàn)。

從表4可以看出，第9個(gè)處理組合（7～8片真葉，針刺法，50%無(wú)菌水+50%液體NA培養(yǎng)基菌懸液）和第6個(gè)處理組合（5～6片真葉，針刺法，接種液為無(wú)菌水菌懸液）的接種效果最好，病情指數(shù)累積值分別為222.41和212.33，兩者之間沒(méi)有顯著差異；其次在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)NA培養(yǎng)基菌懸液有利于其黏著在甘藍(lán)葉片表面，并且接種液對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響很小，所以最終選擇NA液體培養(yǎng)基菌懸液為最佳接種液。

2.1.3 不同接種濃度對(duì)甘藍(lán)軟腐病發(fā)病的影響

從表5可知，用6.4×10.7 cfu/mL濃度接種后72 h，3個(gè)材料均表現(xiàn)為抗性（R），用6.4×10.8 cfu/mL濃度接種后有一個(gè)材料表現(xiàn)為抗性（R），兩個(gè)材料表現(xiàn)為耐?。═），而用6.4×10.9cfu/mL濃度接種后有一個(gè)材料表現(xiàn)為耐?。═），兩個(gè)材料表現(xiàn)為感?。⊿），雖然從數(shù)據(jù)上看6.4×10.8cfu/mL的接種濃度未能將不同抗性的材料區(qū)分開(kāi)，但是在試驗(yàn)圖片中是可以將三者區(qū)分開(kāi)的（圖片未展示），因此認(rèn)為菌液孢子含量6.4×10.8cfu/mL是最佳接種濃度， 接種后72 h調(diào)查最佳。

2.2 甘藍(lán)種質(zhì)資源抗性鑒定

采用上述方法對(duì) 27份西南大學(xué)十字花科研究所的甘藍(lán)種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定。結(jié)果篩選出高抗材料3份，抗病材料8份，耐病材料8份，感病材料8份，無(wú)免疫和高感材料（表6）。

3 小結(jié)與討論

3.1 小結(jié)

通過(guò)對(duì)接種苗齡、接種方法和接種液進(jìn)行3因素3水平的正交試驗(yàn)，得出最佳接種苗齡為5～7葉期、最佳接種方法是針刺法、適宜接種液為液體培養(yǎng)基菌懸液，最佳接種濃度為6.4×10.8 cfu/mL，病情指數(shù)調(diào)查均在接種后72 h，葉片反面接種，接種部位為葉片主脈中部并且接種的最佳保濕條件為空氣相對(duì)濕度 90%以上。

3.2 接種濕度是離體接種鑒定方法的重要條件

據(jù)報(bào)道，空氣濕度[20-21]是影響大白菜軟腐病發(fā)生程度的重要條件，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，甘藍(lán)離體葉片接種后軟腐病的發(fā)生也需要相對(duì)濕度達(dá)到較高的水平，只有空氣相對(duì)濕度保持在90%以上時(shí)才能導(dǎo)致軟腐病斑的形成。

3.3 接種方法、苗齡和接種液對(duì)軟腐病發(fā)病的影響

在探究接種方法、苗齡和接種液對(duì)軟腐病發(fā)病的影響時(shí)本試驗(yàn)采用了正交設(shè)計(jì)，這樣既減少了試驗(yàn)內(nèi)容，同時(shí)也能夠?qū)舛取⒚琮g和接種方法3個(gè)因素同時(shí)進(jìn)行考察。試驗(yàn)表明，用大小相同的針10根捆成一束在離體葉片的葉脈基部針刺法是離體接種軟腐病菌的最佳接種方法。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用刀片橫切法接種，傷口發(fā)病程度較輕，可能原因是傷口太大，傷口木栓化不利于發(fā)病并且刀切法在試驗(yàn)中不好控制，最后無(wú)法判斷是否是因?yàn)楦腥静【鴮?dǎo)致的發(fā)病；注射法也不好控制，而且由于傷口較小，不利于軟腐病菌侵染。關(guān)于苗齡對(duì)接種的影響，作者認(rèn)為苗齡太小，不利于發(fā)病，而苗齡在5～6片葉和7～8片時(shí)接種并沒(méi)有表現(xiàn)出太大的區(qū)別。所以最終確定接種鑒定的苗齡期為5～7片真葉期。本文結(jié)果表明，3種不同接種液對(duì)軟腐病發(fā)病的影響差異不顯著，但采用液體NA培養(yǎng)基菌懸浮液接種時(shí)軟腐病發(fā)病程度好于其他兩種方法，可能是因?yàn)槭且后wNA 培養(yǎng)基有利于病菌黏附在甘藍(lán)離體葉片表面。

3.4 接種濃度對(duì)離體鑒定的影響

接種體的菌懸液濃度是影響軟腐病發(fā)生的重要因素，本研究表明，菌懸液中病菌含量為64×10.8cfu/mL是最佳接種濃度。

參考文獻(xiàn)

[1] 董金皋.農(nóng)業(yè)植物病理學(xué)[M].第2版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2007.

[2] 李志.十字花科蔬菜軟腐病發(fā)生特點(diǎn)及防治技術(shù)[J].河北農(nóng)業(yè)，2008（9）：25.

[3] MA Bing， HIBBING M E， KIM H S， et al. Host range and molecular phylogenies of the soft rot enterobacterial generaPectobacterium andDickeya [J].Phytopathology，2007，97（9）：1150-1163.

[4] GARDAN L， GOUY C， CHRISTEN R， et al. Elevation of three subspecies ofPectobacterium carotovorum to species level：Pectobacterium atrosepticumsp. nov.，Pectobacterium betavasculorum sp. nov. andPectobacterium wasabiae sp. nov[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2003，53（2）：381-391.

[5] AVROVA A O， HYMAN L J， TOTH R L， et al. Application of amplified fragment length polymorphism fingerprinting for taxonomy and identification of the soft rot bacteriaErwinia carotovoraandErwinia chrysanthemi[J].Applied and Environmental Microbiology，2002，68（4）：1499-1508.

[6] 田宇，馬亞麗，何付新，等.北京地區(qū)芹菜細(xì)菌性軟腐病菌鑒定及其致病力分析[J].植物病理學(xué)報(bào)，2016，46（4）：433-442.

[7] CHARKOWSKI A O. The soft rot Erwinia [M]∥ Plant-Associated Bacteria. Springer Netherlands， 2007：423-505.

[8] 王茜，張寶海，趙亮，等.一株芹菜（Apium graveolens L.）軟腐病菌Pectobacterium carotovorumsubsp.odoriferum的特征[J].植物病理學(xué)報(bào)，2015，45（4）：418-424.

[9] WANG Jing， WANG Yihong， ZHAO Tingchang， et al. Characterization of the pathogen causing a new bacterial vein rot disease in tobacco in China [J]. Crop Protection， 2017， 92： 93-98.

[10]NAZERIAN E， SIJAM K， ZAINAL A， et al. First report of lettuce soft rot caused byPectobacterium carotovorumsubsp.carotovorumin Malaysia[J]. Journal of Plant Pathology. 2011， 93（4）：491-491.

[11]TSUDA K， TSUJI G， HIGASHIYAMA M， et al. Biological control of bacterial soft rot in Chinese cabbage byLactobacillus plantarum strain BY under field conditions [J]. Biological Control， 2016， 100： 63-69.

[12]JEONG R D， CHU E H， PARK D H， et al. Control of postharvest bacterial soft rot by gamma irradiation and its potential modes of action [J].The Plant Pathology Journal，2016，32（2）： 157-161.

[13]張鳳蘭. 白菜對(duì)軟腐病的室內(nèi)抗性鑒定方法及抗源篩選[J]. 蔬菜， 1992（4）：20.

[14]張光明， 王翠花. 大白菜抗軟腐病接種鑒定方法的初步研究[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 1995（5）：39-40.

[15]臧威， 崔崇士， 張耀偉. 大白菜軟腐病苗期抗性鑒定方法的研究[J]. 北方園藝， 2003（3）：57-58.

[16]方中達(dá). 植病研究方法[M]. 北京： 農(nóng)業(yè)出版社， 1979.

[17]史國(guó)立， 崔崇士， 張耀偉. 大白菜對(duì)軟腐病抗性的快速鑒定方法研究[J]. 植物保護(hù)， 2006， 32（6）：135-138.

[18]楊曉紅， 徐文玲， 張曉明，等. 大白菜抗軟腐病接種鑒定及抗源篩選研究[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2009（5）：67-69.

[19]葉雪凌， 曹鳴慶， 馬榮才. 擬南芥對(duì)細(xì)菌性軟腐病抗性變異分析[J]. 中國(guó)生物工程雜志， 2008， 28（11）：36-42.

[20]BURR T J， SCHROTH M N. Occurrence of soft rotErwinia spp. In soil and plant material [J]. Phytopathology，1977，77（11）：1382-1387.

[21]DYE D W. A taxonomic study of the genusErwinia. I. The “amylovora” group [J]. New Zealand Journal of Agricultural Research， 1968， 11：590-607.

（責(zé)任編輯：楊明麗）