花生網(wǎng)斑病不同病斑類型及其病原菌致病力差異

李紹建　高蒙　王娜　崔小偉　劉春燕　王振宇

摘要

本文描述了河南省發(fā)生日趨嚴重的花生網(wǎng)斑病在田間出現(xiàn)的一種新的病斑類型，并結(jié)合已報道的兩種病斑類型，對3種病斑類型的病原菌開展致病力差異研究。研究結(jié)果表明：田間新發(fā)現(xiàn)的花生網(wǎng)斑病病斑特征明顯，綜合分析后將花生網(wǎng)斑病病斑類型分別定為網(wǎng)紋型、類褐斑型和污斑型；同一花生品種上3種病斑類型病原菌菌株間存在明顯的致病力差異，同一病斑類型菌株對不同花生品種的致病力也表現(xiàn)出顯著差異。

關(guān)鍵詞

花生網(wǎng)斑??； 病斑類型； 病原菌； 菌株； 致病力差異

中圖分類號：

S 435.652

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017295

Different lesion types of peanut web blotch and virulence

differences of their pathogens

LI Shaojian， GAO Meng， WANG Na， CUI Xiaowei， LIU Chunyan， WANG Zhenyu

（Henan Key Laboratory of Crop Pest Control， Key Laboratory of Integrated Pest Management on

Crops in Southern Region of North China， Institute of Plant Protection，Henan Academy of

Agricultural Sciences， Zhengzhou 450002， China）

Abstract

A new lesion type of peanut web blotch caused by Peyronellaea arachidicola was described and the virulence differences of the pathogens resulting in different lesion types were investigated in this research. By a comprehensive analysis of the lesion features， three lesion types of peanut web blotch were sorted， including type of reticulate elongation， type of brown spot like and type of irregular stain. Furthermore， virulence test showed that virulence was significantly different not only among pathogens caused three lesion types on the same peanut cultivar， but also among the peanut cultivars caused by same pathogen with the same lesion type.

Key words

peanut web blotch； lesion type； pathogen； strain； virulence difference

花生Arachis hypogaea Linn.是重要的油料和經(jīng)濟作物，其生產(chǎn)遍布世界各大洲100多個國家。目前，中國是世界上最大的花生生產(chǎn)、消費和貿(mào)易出口國，花生在我國國民經(jīng)濟發(fā)展和對外貿(mào)易中占有重要地位[1]。河南省是中國傳統(tǒng)花生大省，其花生種植面積自2004年以來一直穩(wěn)居我國第一位[23]。近年來，河南省花生網(wǎng)斑病發(fā)生日趨嚴重，造成葉片提早脫落，影響花生后期灌漿成熟，嚴重影響產(chǎn)量。

花生網(wǎng)斑病最早于1972在美國德克薩斯州發(fā)現(xiàn)[4]。在我國，該病于1982年在山東、遼寧等省的花生主產(chǎn)區(qū)首次發(fā)現(xiàn)，隨后陜西、河南等省也相繼報道了該病[56]。目前，普遍被學者接受的花生網(wǎng)斑病病原菌為花生莖點霉Phoma arachidicola，這一名稱最早是由Marasas等[7]于1974年研究南非發(fā)現(xiàn)的花生網(wǎng)斑病時據(jù)其形態(tài)學特征而命名的。一直以來，花生網(wǎng)斑病病原菌的屬級分類地位較為混亂，出現(xiàn)了許多不同的命名，直至2010年Aveskamp等[8]對莖點霉屬Phoma進行系統(tǒng)發(fā)育分析，將原莖點霉屬下的派倫霉節(jié)（section）升為派倫霉屬，并將花生網(wǎng)斑病病原菌歸到此屬，因此本文沿用上述最新的名稱花生派倫霉Peyronellaea arachidicola。

截至目前，有關(guān)花生網(wǎng)斑病發(fā)生危害及防治的研究報道較多，而對于其病原菌致病力的系統(tǒng)研究較少。有鑒于此，結(jié)合本課題組在田間調(diào)查時新發(fā)現(xiàn)的一種花生網(wǎng)斑病病斑類型，本文對花生網(wǎng)斑病3種病斑類型進行特征區(qū)分，并進一步對3種病斑類型的病原菌致病力差異開展研究，以期指導田間病害識別，并為病害的深入研究及抗性品系篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及花生品種

花生網(wǎng)斑病不同病斑類型病葉分別采集于河南省南陽市新野縣高廟鄉(xiāng)仁橋村（網(wǎng)紋型）、新野縣北王莊（類褐斑型）及河南省農(nóng)業(yè)科學院原陽基地（污斑型），經(jīng)室內(nèi)組織分離并純化后保存菌株。

供試花生品種為‘開農(nóng)1760、‘興花6號、‘豫花9327、‘豫花22、‘豫花15、‘遠雜9102。

1.2 病害癥狀描述

根據(jù)花生網(wǎng)斑病田間危害癥狀特點進行描述記載。

1.3 病原菌鑒定

1.3.1 病原菌形態(tài)特征

刮取病原菌菌落，顯微觀察，并參考《中國真菌志》[9]及《The genera of hyphomycetes》[10]描述其形態(tài)特征；將純化的病原菌菌株用PDA平板活化，25℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，觀察菌落顏色、形狀以及菌絲疏密程度等。

1.3.2 柯赫氏法則驗證

選用有6～8片真葉的‘豫花22進行致病性測定。病原菌接種采用菌絲懸浮液涂抹法（菌絲片段長度約100～200 μm，濃度為1.6×10-3g/mL），以清水接種為對照。每處理3次重復，每次重復6片復葉。接種后每片復葉套自封袋保濕，花生植株均置于28℃條件下培養(yǎng)，逐日觀察并記錄接菌植株葉片發(fā)病情況。

1.3.3 病原菌rDNAITS序列分析

采用上海萊楓生物科技有限公司的真菌基因組DNA小量提取試劑盒提取菌株基因組DNA。選用真菌通用引物ITS1（5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′）和ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）對病原菌基因組DNA進行PCR擴增。

PCR反應(yīng)體系25 μL：2×Taq PCR Master Mix 12.0 μL，引物ITS1/ ITS4各1 μL， 模板DNA 1 μL，ddH2O 10 μL。PCR擴增反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸50 s，32個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對分析。

1.4 致病力測定

1.4.1 接種體制備

分別挑取3種病斑類型的病原菌菌株移植于PDA平板中，25℃的光照培養(yǎng)箱（L∥D=12 h∥12 h）中恒溫培養(yǎng)10 d，隨后在超凈工作臺內(nèi)分別將菌絲刮入裝有滅菌玻璃珠的2 mL PE離心管中，在離心管內(nèi)加入200 μL無菌水，于Bullet Blender STORM研磨儀（Next Advance）8檔研磨45 s，取出研磨液并稀釋至菌絲濃度為1.6×10-3g/mL，按0.15%加入吐溫20后搖勻備用。

1.4.2 接種及調(diào)查

選取長勢一致的花生幼苗（苗齡20～30 d），采用菌絲懸浮液涂抹法接種，用無菌棉簽蘸取菌絲懸浮液，均勻涂抹到葉片正面，接種完成后做好標記并將每片復葉套封口袋保濕，所有接種的花生植株置于25℃的人工氣候箱（L∥D=12 h∥12 h）內(nèi)培養(yǎng)，每個菌株接種設(shè)3次重復。

接種后14 d調(diào)查，記錄總?cè)~數(shù)、發(fā)病葉片數(shù)，所有的發(fā)病葉片拍照留存，計算發(fā)病率及病情指數(shù)。葉片發(fā)病分級方法如下：0級，無病斑；1級，病斑面積占整片葉面積的6%以下；3級，病斑面積占整片葉面積的6%～25%；5級，病斑面積占整片葉面積的26%～50%；7級，病斑面積占整片葉面積的51%～75%；9級，病斑面積占整片葉面積的75%以上[11]。病情指數(shù)計算公式為：

病情指數(shù)=[Σ（相對級值×各級發(fā)病葉片數(shù)）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×9）]×100。

1.5 數(shù)據(jù)分析

運用IBM SPSS Statistics 22軟件對文中數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，顯著性測驗選用LSD法。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀描述

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，河南省花生網(wǎng)斑病共可分為3種病斑類型：網(wǎng)紋型、類褐斑型和污斑型（圖1）。三者的病狀表現(xiàn)區(qū)分較為明顯，網(wǎng)紋型：病斑較大，直徑1～2 cm，在葉片正面形成邊緣網(wǎng)狀擴展，中間為褐色的病斑。病斑不規(guī)則，邊緣不清晰，一般不穿透葉片，田間發(fā)生往往多個病斑連在一起形成更大的病斑，嚴重時甚至可以遍布整片葉片（圖1a）；類褐斑型：病斑相對較小，直徑0.1～0.5 cm，近圓形，病斑中央黑褐色，邊緣清晰，周圍有黃色暈圈，可以穿透葉片（圖1b）；污斑型：病斑一般較類褐斑型大，直徑0.4～1 cm，病斑不規(guī)則形，黑褐色，邊緣清晰，周圍無黃色暈圈，可以穿透葉片（圖1c）。

2014年-2016年對花生網(wǎng)斑病的采樣結(jié)果顯示，在河南省境內(nèi)，花生網(wǎng)斑病的3種病斑類型以網(wǎng)紋型分布最廣，類褐斑型次之，污斑型分布最少。類褐斑型與污斑型分布地區(qū)相對重合，目前僅在新鄉(xiāng)、焦作、洛陽和南陽四市范圍內(nèi)采集到病害樣本（圖2）；對不同地區(qū)3種病斑類型的發(fā)病率調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，3種病斑類型在河南省境內(nèi)均分別表現(xiàn)為由南向北發(fā)病率逐漸升高的趨勢，并且隨2014年至2016年的時間順序，3種病斑類型田間發(fā)病率均分別逐年降低（表1）。

2.2 病原菌鑒定結(jié)果

2.2.1 病原菌菌落形態(tài)特征

3種病斑類型的病原菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落特征存在差異。網(wǎng)紋型病原菌菌絲致密，灰白色，菌落邊緣內(nèi)側(cè)有輪紋；類褐斑型病原菌菌絲較稀疏，菌落中央菌絲淺綠色，外圍灰白色，菌落邊緣菌絲生長茂盛，內(nèi)側(cè)有輪紋；污斑型病原菌菌絲致密，灰白色，菌落中央氣生菌絲茂盛，菌落邊緣菌絲生長茂盛，內(nèi)側(cè)無輪紋（圖3）。在實驗室內(nèi)相同條件分別繼代培養(yǎng)后，3種病斑類型的病原菌菌落特征穩(wěn)定。

2.2.2 柯赫氏法則驗證結(jié)果

3種病斑類型的病原菌均引起花生葉片發(fā)病，而相應(yīng)的清水對照處理的葉片均未發(fā)病。接種15 d后，3種病斑類型病原菌接種的花生葉片均分別表現(xiàn)出與原病斑類型一致的癥狀；分別取3種病斑類型的葉片進行再次分離，均獲得了與原菌株相同的病原菌，證明3個類型的菌株均為花生網(wǎng)斑病的致病菌且回接后葉部癥狀表現(xiàn)與原病斑類型一致。

2.2.3 病原菌rDNAITS序列分析結(jié)果

利用引物ITS1/ITS4分別對3種病斑類型的病原菌進行rDNAITS序列擴增，均擴增出大小為530 bp的條帶（圖4）。將測序所得序列上傳至NCBI進行BLAST比對分析，結(jié)果顯示，3種病斑類型的病原菌均與GenBank登錄號為JX898682的花生派倫霉Peyronellaea arachidicola，即目前普遍被學者接受的花生莖點霉Phoma arachidicola序列相似性達到99%，因此鑒定3種病斑類型的病原菌均為花生派倫霉Peyronellaea arachidicola。

基于3種病斑類型病原菌的ITS序列，用Clustal X（1.83）[12]多序列對位排列程序?qū)?個序列進行對位排列，由分析結(jié)果可知，3種病斑類型病原菌的ITS序列完全一致。

2.3 不同病斑類型病原菌菌株的致病力

通過菌絲懸浮液涂抹接種法，將花生網(wǎng)斑病3種不同病斑類型的病原菌菌株分別接種在6個河南省花生主栽品種上，對菌株的致病性進行測定。接種7 d后，網(wǎng)紋型病原菌菌株接種葉片上顯現(xiàn)不規(guī)則的黑色小病斑，病斑邊緣不明顯且呈不規(guī)則網(wǎng)狀延伸；類褐斑型病原菌菌株接種葉片上顯現(xiàn)近圓形褪綠斑，隨著病斑發(fā)展，病斑中央褐色，周圍有黃色暈圈；污斑型病原菌菌株接種葉片上顯現(xiàn)不規(guī)則的黑色病斑，病斑中央黑色，邊緣分界明顯。

不同病斑類型的病原菌菌株對不同的花生品種表現(xiàn)出不同的致病力（表2）。接種網(wǎng)紋型菌株的6個花生品種全部發(fā)病，其中發(fā)病率最高為‘豫花9327，達95.00%，病情指數(shù)最高為‘開農(nóng)1760（17.78），發(fā)病率與病情指數(shù)最低均為‘遠雜9102；接種類褐斑型菌株的花生品種中，除‘興花6號沒有發(fā)病外，其他5個品種均發(fā)病，‘遠雜9102上的發(fā)病率與病情指數(shù)分別為10.00%和0.56，相較其他品種均較低，發(fā)病率與病情指數(shù)最高均為‘豫花22；接種污斑型菌株的6個花生品種全部發(fā)病，其中發(fā)病率與病情指數(shù)最高均為‘開農(nóng)1760，分別為90.00%和22.22，最低均為‘遠雜9102，分別為50.00%和9.36。另外，除接種類褐斑型菌株的‘豫花22上發(fā)病率與病情指數(shù)均高于接種網(wǎng)紋型的菌株外，其他品種上均表現(xiàn)為接種類褐斑型菌株的發(fā)病率和病情指數(shù)最低。

3 結(jié)論與討論

目前，文獻報道的花生網(wǎng)斑病田間表現(xiàn)型通常有兩種：一是污斑型，病斑較小，近圓形，周圍有黃色暈圈；另一種是網(wǎng)紋型，病斑較大，病斑網(wǎng)紋狀或星芒狀，病斑不規(guī)則形，邊緣不清晰，周圍無黃色暈圈[13]。本研究通過田間采樣調(diào)查，發(fā)現(xiàn)一種新的花生網(wǎng)斑病的病斑類型，病狀表現(xiàn)為病斑相對較小，不規(guī)則形，邊緣清晰，周圍無黃色暈圈。經(jīng)室內(nèi)分離、柯赫氏法則驗證及ITS測序，證實新發(fā)現(xiàn)病斑類型確為花生網(wǎng)斑病所致病癥。文獻表述的污斑型周圍有黃色暈圈，在田間識別時與花生褐斑病難以區(qū)分；本文新發(fā)現(xiàn)病斑類型周圍雖無明顯黃色暈圈，但其余特征均與文獻報道污斑型病狀相似。因此，為更好指導田間花生網(wǎng)斑病識別，本文擬將之前文獻報道原污斑型改為類褐斑型，新發(fā)現(xiàn)病斑類型擬定為污斑型，網(wǎng)紋型保持不變，即花生網(wǎng)斑病病斑的3種表現(xiàn)類型：網(wǎng)紋型、類褐斑型和污斑型?；诒狙芯恐?014年至2016年花生網(wǎng)斑病病斑類型的調(diào)查數(shù)據(jù)，3種病斑類型在河南省境內(nèi)3年內(nèi)均分別表現(xiàn)為由南向北發(fā)病率逐漸升高的趨勢，說明花生網(wǎng)斑病近3年來在河南省的發(fā)病規(guī)模正不斷擴大，對3種病斑類型在地理上的發(fā)病趨勢還有待進一步深入研究。

一直以來，關(guān)于花生網(wǎng)斑病病原菌的屬級分類比較混亂。自1974年西方學者Marasas等在南非發(fā)現(xiàn)花生網(wǎng)斑病并據(jù)其形態(tài)學特征將該菌定名為莖點霉屬一新種——花生莖點霉Phoma arachidicola Marasas， Pauer & Boerema[7]以來，針對該菌曾陸續(xù)有過Mycosphaerella arachidicola Chochrjakov， M. argentinensis Frezzi， Didymella arachidicola （Chochrjakov） Tomilin， D. arachidicola （Chochrjakov） Taber， Pettit & Philley和Didymosphaeria arachidicola （Chochrjakov） Alcorn， Punithalingam & McCarthy的不同命名[14]。隨著近代分子生物學技術(shù)的發(fā)展，2010年Aveskamp等[8]通過對莖點霉屬真菌進行系統(tǒng)發(fā)育分析，將原來莖點霉屬Phoma下的派倫霉Peyronellaea節(jié)（section）及另外一些節(jié)的真菌歸類并升為派倫霉屬，花生網(wǎng)斑病病原菌即被劃至此屬內(nèi)。因此，本文中花生網(wǎng)斑病病原菌使用拉丁學名為Peyronellaea arachidicola。

對不同病斑類型菌株致病力研究結(jié)果表明，同一病斑類型菌株對不同花生品種的致病力差異明顯。以田間危害范圍最廣的網(wǎng)紋型菌株為例，網(wǎng)紋型菌株對‘開農(nóng)1760、‘興花6號和‘豫花9327的致病力相對較強，而對‘豫花22、‘豫花15和‘遠雜9102的致病力相對較弱。綜合分析3種病斑類型對不同品種的致病力，可知‘遠雜9102為對3種病斑類型菌株抗性均較好的花生品種。此外，不同病斑類型菌株對同一花生品種的致病力差異也十分明顯，在‘開農(nóng)1760、‘豫花15及‘遠雜9102上均表現(xiàn)為污斑型>網(wǎng)紋型>類褐斑型；在‘興花6號和‘豫花9327上表現(xiàn)為網(wǎng)紋型>污斑型>類褐斑型；而在‘豫花22上，污斑型菌株的致病力最強，類褐斑型次之，網(wǎng)紋型最弱。這說明在供試的6個花生品種中，除‘豫花22外，污斑型和網(wǎng)紋型的致病力均明顯大于類褐斑型。董煒博等鑒定了來自中國山東、河南、遼寧、湖北和美國的20多個花生品種（系）對花生葉部病害的抗性[15]，袁虹霞等測定了河南13個花生品種（系）對褐斑病、黑斑病和網(wǎng)斑病的抗性[16]，結(jié)果均表明供試品種中缺乏免疫和高抗花生網(wǎng)斑病的花生品種（系）。近年來，花生網(wǎng)斑病的發(fā)生危害規(guī)模逐漸增大，危害程度逐年加深，加之抗性品種（系）相對缺乏，因此生產(chǎn)上急需一批抗性良好的花生品種（系）來改善花生生產(chǎn)現(xiàn)狀。本文結(jié)合花生網(wǎng)斑病病斑類型分布特點，分病斑類型進行花生抗性品種（系）的篩選，將為花生抗性品種（系）選育及品種推廣提供一種新的思路。

本文研究結(jié)果明確了田間花生網(wǎng)斑病的3種不同病斑類型以及其在河南省各地區(qū)的分布情況，這極大地方便了花生網(wǎng)斑病的田間識別調(diào)查。同時還創(chuàng)造性地對3種不同病斑類型病原菌菌株開展了致病力差異研究，為更好地研究花生網(wǎng)斑病發(fā)生發(fā)展規(guī)律、田間防治及花生品種推廣提供了重要的理論依據(jù)。

參考文獻

[1] 劉博文，劉曉庚.淺談中國花生產(chǎn)業(yè)發(fā)展的優(yōu)勢與策略[J].糧食科技與經(jīng)濟，2011，36（1）：911.

[2] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.中國農(nóng)業(yè)年鑒[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，20012015.

[3] 中華人民共和國統(tǒng)計局.中國統(tǒng)計年鑒[M].北京：中國統(tǒng)計出版社，20112016.

[4] 李君彥，李有志.陜西省花生網(wǎng)斑病病原菌的研究[J].花生科技，1991，9（1）：16.

[5] 徐秀娟，石延茂.不同時期使用農(nóng)抗120控制花生網(wǎng)斑病侵染的試驗研究[J].生物防治通報，1993，9（4）：167169.

[6] 徐秀娟，石延茂.花生網(wǎng)斑病主要發(fā)生因子的關(guān)聯(lián)性研究[J].山東農(nóng)業(yè)大學學報，1992，23（4）：430434.

[7] MARASAS W F O， PAUER G D， BOEREMA G H. A serious leaf blotch disease of groundnuts （Arachis hypogaea L.） in Southern Africa caused by Phoma arachidicola sp. nov [J]. Phytophylactica，1974，6（3）：195202.

[8] AVESKAMP M M， DE GRUYTER J， WOUDENBERG J H C， et al. Highlights of the Didymellaceae： A polyphasic approach to characterise Phoma and related pleosporalean genera[J]. Studies in Mycology，2010，65：160.

[9] 郭英蘭，劉錫琎.中國真菌志（第二十卷）[M].北京：科學出版社，2003.

[10]KEITH S， GARETH M J， WALTER G， et al. The genera of Hyphomycetes[M]. The Netherlands： CBSKNAW Fungal Biodiversity Center： 2011： 145147， 303304， 331332.

[11]郭小強，李翔，趙志強，等. 不同殺菌劑對花生葉斑病防治效果及產(chǎn)量影響的研究[J]. 花生學報， 2014， 43（1）： 5660.

[12]THOMPSON J D， GIBSON T J， PLEWNIAK F， et al. The CLUSTAL_X windows interface： Flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools [J]. Nucleic Acids Research， 1997，25（24）：48764882.

[13]徐秀娟.中國花生病蟲鼠害（第二章）[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2009.

[14]VAN WYK P S， DE JONG F M， MARASAS W F O， et al. Ultrastructure of ascus development in the teleomorph of Phoma arachidicola[J].1987，89（2）：260263.

[15]董煒博，石延茂，趙志強.花生品種（系）葉部病害綜合抗性鑒定[J].中國油料作物學報，2000，22（3）：7174.

[16]袁虹霞，孫炳劍，李洪連，等.花生品種（系）對葉斑病的抗性鑒定[J].河南農(nóng)業(yè)科學，2004（12）：3538.

（責任編輯：楊明麗）