鋪散亞菊揮發(fā)油化學(xué)成分組成及其對馬鈴薯莖線蟲的毒殺作用

王思敏 朱婕妮 張迪 康濤 李佳玲 梁俊玉

摘要 馬鈴薯莖線蟲是造成當(dāng)歸麻口病的主要原因。本試驗研究了鋪散亞菊揮發(fā)油的化學(xué)組成及其對馬鈴薯莖線蟲的毒殺作用。采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，GC/MS分析了揮發(fā)油的成分及其相對含量；貝曼漏斗法從當(dāng)歸中分離馬鈴薯莖線蟲，以灰葡萄孢培養(yǎng)線蟲；藥液浸泡法測定揮發(fā)油的殺線蟲活性。結(jié)果顯示：從鋪散亞菊揮發(fā)油中鑒定出25種化合物，占揮發(fā)油總成分的98.44%，其主要成分為樟腦（13.20%）、桉葉油醇 （13.16%）、百里香酚（10.96%）、β-水芹烯（9.66%）、傘柳酮（9.40%）、4-乙基-1-（1-甲基乙基）-二環(huán)[3.1.0]-2-戊烯（7.60%）和側(cè)柏酮（6.18%）。鋪散亞菊揮發(fā)油對馬鈴薯莖線蟲的LC50為3.83 mg/mL，而陽性對照35%甲基異柳磷乳油的LC50為0.14 mg/mL。鋪散亞菊揮發(fā)油對當(dāng)歸莖線蟲有較好的毒殺作用，能夠為鋪散亞菊揮發(fā)油防治馬鈴薯莖線蟲提供一定的理論依據(jù)，對提高當(dāng)歸的質(zhì)量和產(chǎn)量有一定意義。

關(guān)鍵詞 鋪散亞菊； 揮發(fā)油； 馬鈴薯莖線蟲； 殺線蟲活性

中圖分類號： S 435.32

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017185

Abstract Ditylenchus destructor is one of the main causes for Makou disease of Angelica sinensis. Here the nematicidal activity of Ajania khartensis essential oils against D.destructor was investigated. The essential oils were extracted by steam distillation method， and the compositions of A.khartensis essential oils were analyzed by GC-MS. D.destructor was obtained by using the Berman funnel method from A.sinensis infected with Makou disease. The nematicidal activity of A.khartensis essential oils against D.destructor was tested by liquid immersion method. The results showed that 25 compounds were identified and the sum of their contents accounted for 98.44% of the essential oils. The main components of A.khartensis essential oils were camphor （13.20%）， eucalyptol （13.16%）， thymol （10.96%）， β-phellandrene （9.66%）， umbellulone （9.40%）， 4-ethyl-1-（1-methyl ethyl）-bicycto[3.1.0]-2-pentene （7.60%） and thujone （6.18%）. The essential oils of A.khartensis showed certain nematicidal activity （LC50=3.83 mg/mL） compared with the positive control isofenphos-methyl 35% EC （LC50=0.14 mg/mL） against D.destructor. These results can provide the theoretical basis for controlling D.destructor by using A.khartensis essential oils.

Key words Ajania khartensis； essential oil； Ditylenchus destructor； nematicidal activity

當(dāng)歸是傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis的干燥根，味甘平，性溫，具有補血活血，調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便的功效[1]。我國當(dāng)歸產(chǎn)地主要分布于甘肅、云南、貴州等地。近幾年來，在甘肅當(dāng)歸主產(chǎn)區(qū)岷縣，由馬鈴薯莖線蟲Ditylenchus destructor引起的當(dāng)歸麻口病發(fā)病率高，嚴(yán)重影響到當(dāng)歸的質(zhì)量和產(chǎn)量[25]。目前馬鈴薯莖線蟲的防治主要以化學(xué)藥劑防治為主，但長期使用化學(xué)合成藥劑會出現(xiàn)農(nóng)藥殘留、害蟲耐藥性增加以及環(huán)境污染等諸多問題[6]。植物揮發(fā)油作為一種次生代謝產(chǎn)物，表現(xiàn)出多種生物活性，同時具有對環(huán)境和非目標(biāo)生物體低毒、易降解的特點。所以植物揮發(fā)油對線蟲的防治作用已成為研究者尋找化學(xué)殺蟲劑替代物的新方法之一[711]。

亞菊屬植物具有清熱解毒、消炎止癢、驅(qū)蚊殺蟲等多種功效，且多數(shù)亞菊屬植物含有揮發(fā)油[12]。文獻(xiàn)報道灌木亞菊Ajania fruticulosa揮發(fā)油對赤擬谷盜Tribolium castaneum和嗜卷書虱Liposcelis bostrychophila具有明顯的觸殺、熏蒸和趨避活性[13]。鋪散亞菊Ajania khartensis產(chǎn)于寧夏、甘肅、青海等地[14]，在藏藥典籍《晶珠本草》中記載為蒿阿仲，主要用于治療肺熱癥[15]。當(dāng)前植物揮發(fā)油對線蟲的活性研究主要集中在根結(jié)線蟲和松材線蟲，對馬鈴薯莖線蟲的報道很少。關(guān)于鋪散亞菊揮發(fā)油殺線蟲活性也未見文獻(xiàn)報道。本試驗研究鋪散亞菊揮發(fā)油的化學(xué)成分及其對馬鈴薯莖線蟲的毒殺作用，以期為馬鈴薯莖線蟲病的綠色防治提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料的收集和揮發(fā)油提取

植物材料于2016年9月采于甘肅省夏河縣（經(jīng)緯度34°94′97″N，102°87′92″E，海拔2 900 m）。由西北師范大學(xué)晏民生副教授鑒定為鋪散亞菊Ajania khartensis。稱取1 000 g陰干的鋪散亞菊地上部分粉碎，采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油。蒸餾6～8 h后收集揮發(fā)油，用無水硫酸鈉干燥，得到鋪散亞菊揮發(fā)油，計算得油率和比重。將提取得到的揮發(fā)油放至玻璃瓶中密封置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 馬鈴薯莖線蟲的培養(yǎng)

采用貝曼漏斗法[16]從患麻口病的當(dāng)歸中分離線蟲。用3%雙氧水對分離得到的線蟲懸浮液消毒，離心，底部留2 mL左右液體，得到無菌線蟲懸浮液。用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)灰葡萄孢，4 d后將無菌線蟲懸浮液接種到此PDA平板上，正置放到25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d左右。然后在培養(yǎng)皿底部加入1～2 mL無菌水，再倒置培養(yǎng)，1～2 d后吸出含線蟲的無菌水，即得大量線蟲懸浮液，備用。

1.3 鋪散亞菊揮發(fā)油的GC-MS分析

采用Agilent 7890B氣相色譜和Agilent 5977A質(zhì)譜儀分析鋪散亞菊揮發(fā)油化學(xué)組分。色譜柱為石英毛細(xì)管柱HP-5MS （30 m×0.25 mm×0.25 μm）。氣相色譜升溫程序為：初始溫度為60℃，保持2 min，以10℃/min升溫速率升至180℃，保持1 min，再以20℃/min升溫速率升至260℃，保持15 min。氣相色譜控制參數(shù)為：汽化室溫度250℃，載氣為高純氦氣，進樣量為1 μL，流速為1.0 mL/min，分流比為100∶1。質(zhì)譜參數(shù)：電離方式為EI電離，電子能量為70 eV，離子源溫度230℃，質(zhì)量掃描范圍20～550 m/z。與質(zhì)譜NIST 2.0數(shù)據(jù)庫比對，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，鑒定化合物種類。采用峰面積歸一化法，計算出各化學(xué)成分在揮發(fā)油中的相對百分含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。

1.4 鋪散亞菊揮發(fā)油室內(nèi)毒殺活性測定（藥液浸泡法）[17]

將鋪散亞菊揮發(fā)油用適量吐溫-80混合后加水配制成一定濃度的乳油樣品備用。通過預(yù)試驗，尋找合適的測試濃度范圍。將90 μL不同濃度的揮發(fā)油樣品注入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的樣品孔內(nèi)，再加入10 μL馬鈴薯莖線蟲懸浮液（含50～100條線蟲），共計100 μL。以不加藥物的吐溫-80和水混合液為陰性對照?；旌暇鶆蚝笾糜?5℃，濕度為80%～90%的培養(yǎng)箱中。以35%甲基異柳磷乳油作為陽性對照。每個處理重復(fù)5次，處理48 h后分別檢查各組的線蟲死亡/存活情況，計算線蟲死亡率和校正死亡率，采用IBM SPSS V 20.0統(tǒng)計軟件的Probit analysis計算半致死濃度LC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 鋪散亞菊揮發(fā)油的GC-MS 分析結(jié)果

通過水蒸氣蒸餾法收集到鋪散亞菊揮發(fā)油10 mL，得率為1.0%，比重為0.98。揮發(fā)油氣相色譜總離子流圖和GC-MS分析結(jié)果見圖1、表1。

由表2可見，從鋪散亞菊揮發(fā)油中鑒定出了25種化合物，占總揮發(fā)油的98.44%。其主要成分為樟腦（13.20%）、桉葉油醇 （13.16%）、百里香酚（10.96%）、β-水芹烯（9.66%）、傘柳酮（9.40%）、4-乙基-1-（1-甲基乙基）-二環(huán)[3.1.0]-2-戊烯（7.60%）和側(cè)柏酮（6.18%）。張興旺等[18]采集于青海省的鋪散亞菊揮發(fā)油的主要成分為4-甲基-1-[1-甲基乙基]-二環(huán)[3.1.0]己烯3-酮（32.42%）、樟腦（15.73%）、3，7，7-三甲基-二環(huán)[4.1.0]-3-庚烯（9.39%）、1-甲基-4-甲基乙基-1，4-環(huán)己二烯（7.99%）、2，4（10）-thujadiene（6.50%）、側(cè)柏酮（6.09%）。本研究與上述文獻(xiàn)比較，揮發(fā)油中都含有樟腦和側(cè)柏酮，且含量很接近。除了相同的組分外，兩種揮發(fā)油也含有很多不同的組分。這和植物材料采集的地點、時間有一定的關(guān)系。達(dá)洛嘉等[19]采用超臨界CO2萃取法分離鋪散亞菊中的物質(zhì)，該物質(zhì)經(jīng)GC-MS鑒定，主要化合物為亞油酸、棕櫚酸等脂肪酸類，與本研究的結(jié)果差異很大。這些成分不屬于植物揮發(fā)油組成，它們更多存在于植物種子中。推測達(dá)洛嘉等采集的植物材料中含有較多的種子。

2.2 鋪散亞菊揮發(fā)油殺線蟲活性

鋪散亞菊揮發(fā)油和陽性對照35%甲基異柳磷乳油對馬鈴薯莖線蟲的毒殺作用見表2。

由表2可以看出，在處理24 h以后，鋪散亞菊揮發(fā)油對馬鈴薯莖線蟲的LC50為3.83 mg/mL，陽性對照35%甲基異柳磷乳油的LC50為0.14 mg/mL。從處理時間來看，與處理24 h的殺線蟲活性相比較，處理48 h后，鋪散亞菊揮發(fā)油對馬鈴薯莖線蟲的觸殺活性幾乎沒有變化；而處理72 h后，鋪散亞菊揮發(fā)油對馬鈴薯莖線蟲的觸殺活性有所增強，但是增強不明顯。說明揮發(fā)油對馬鈴薯莖線蟲的觸殺活性與處理時間的關(guān)聯(lián)不是很明顯。

3 討論

鋪散亞菊揮發(fā)油主要成分為單帖和倍半萜，相關(guān)研究表明萜類化合物對馬鈴薯莖線蟲通過胃毒方式產(chǎn)生毒殺作用，并能降低神經(jīng)組織乙酰膽堿的含量，阻斷神經(jīng)肌肉的傳導(dǎo)，從而使線蟲出現(xiàn)攣縮性麻痹的中毒癥狀。同時萜類化合物對莖線蟲來說是一種良好的阻食劑，可通過阻食引起線蟲死亡[20]。鋪散亞菊揮發(fā)油的殺線蟲活性與其主要成分桉葉油醇、樟腦、百里香酚等是否有關(guān)聯(lián)還需進一步研究。甲基異柳磷禁止在中藥材中使用，本文僅利用其強殺蟲效果作為對照，與樣品進行對比，確定揮發(fā)油及其組分的殺線蟲活性。

植物源農(nóng)藥是一種環(huán)保型農(nóng)藥，將鋪散亞菊揮發(fā)油及其活性成分開發(fā)為新型植物型熏蒸劑或防護劑用于馬鈴薯莖線蟲防治具有一定意義。但目前對亞菊屬植物抗蟲活性成分的研究較少，對其具有揮發(fā)作用的活性物質(zhì)、毒殺機制等還有待于進行深入的研究。從目前來看，植物源農(nóng)藥具有廣闊的應(yīng)用前景，在不久的將來，它的研究和開發(fā)將會取得更大的進展。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）