柑橘黃龍病常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)研究與初步應(yīng)用

梁亮 田志清 胡雪芳 張志民 王士奎

摘要 柑橘黃龍病是世界范圍具有毀滅性危害的柑橘細(xì)菌性病害，在我國(guó)大部分柑橘產(chǎn)區(qū)發(fā)生，嚴(yán)重制約了我國(guó)柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本文根據(jù)黃龍病病原物亞洲韌皮桿菌核糖體16S rRNA基因設(shè)計(jì)了1對(duì)PCR引物HLBF468/HLBR877，并以此為基礎(chǔ)建立了常規(guī)PCR反應(yīng)體系，確定了檢測(cè)體系的特異性和靈敏度。結(jié)果表明該體系的檢測(cè)靈敏度比先前報(bào)道的常規(guī)PCR方法有了明顯提高。利用建立的PCR體系完成了對(duì)廣東和廣西兩省區(qū)果園柑橘黃龍病的抽樣檢測(cè)。本研究建立的常規(guī)PCR方法可以作為一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于柑橘黃龍病的早期診斷。

關(guān)鍵詞 柑橘黃龍?。?亞洲韌皮桿菌； 常規(guī)PCR； 靈敏度； 早期診斷

中圖分類號(hào)： S 436.66

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017071

Abstract Citrus Huanglongbing （HLB） is a devastating bacterial disease on citrus in the world and seriously restricts the development of citrus industry in our country. Polymerase chain reaction （PCR） approach was established based on a pair of primers， HLBF468/HLBR877， designed from the ribosomal gene sequence of 16S rRNA of Candidatus Liberibacter asiaticus， and its sensitivity was obviously higher than that of the previous reported PCR approach. The samples infected by HLB were collected from Guangdong and Guangxi and were tested by this method. The results showed that this method could be applied for early diagnosis of HLB.

Key words citrus Huanglongbing （HLB）； Candidatus Liberibacter asiaticus； PCR； sensitivity； early diagnosis

柑橘黃龍?。╟itrus Huanglongbing，HLB）是世界范圍具有毀滅性危害的柑橘細(xì)菌性病害，在我國(guó)大部分柑橘產(chǎn)區(qū)發(fā)生，并造成巨大損失，嚴(yán)重制約了我國(guó)柑橘產(chǎn)業(yè)的生存與健康發(fā)展[12]。柑橘黃龍病的病原物已于1994年被確定為韌皮部桿菌屬類細(xì)菌“Candidatus Liberibacter spp.”，是一種限于篩管組織內(nèi)寄生的革蘭氏陰性細(xì)菌。根據(jù)耐熱性和地理分布分為三個(gè)種：亞洲種Candidatus Liberibacter asiaticus，非洲種Candidatus Liberibacter africanus和美洲種Candidatus Liberibacter americanus。在我國(guó)分布的是亞洲韌皮部桿菌Candidatus Liberibacter asiaticus。柑橘黃龍病的傳播與癥狀表現(xiàn)具有較長(zhǎng)的潛伏期（一般為3至8個(gè)月），這使得該病的防治和早期診斷工作變得十分困難[35]，為此，建立成本低廉、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果穩(wěn)定且可靠的快速的柑橘黃龍病早期診斷技術(shù)，對(duì)于防止柑橘黃龍病進(jìn)一步擴(kuò)散傳播，減少果農(nóng)經(jīng)濟(jì)損失具有重大意義。

PCR檢測(cè)靈敏度和可信度高，可批量進(jìn)行，除了能對(duì)顯癥的植物組織中的病原進(jìn)行定性和定量分析外，還能對(duì)未顯癥的植物材料、媒介昆蟲中的病原物進(jìn)行檢測(cè)，目前已成為植物病蟲害診斷的可靠方法之一[4]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究人員利用常規(guī)PCR檢測(cè)方法開(kāi)展了對(duì)柚、柑、橙、橘等果園主要栽培的蕓香科果樹(shù)品種的柑橘黃龍病診斷工作，一般情況下可以完成對(duì)黃龍病的快速準(zhǔn)確檢測(cè)[614]。但由于黃龍病病原菌在柑橘植株體內(nèi)含量較低且分布不均勻，常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果會(huì)出現(xiàn)假陰性，影響了其在黃龍病早期診斷中應(yīng)用的可靠性。本研究通過(guò)設(shè)計(jì)篩選黃龍病病原物特異性引物對(duì)，優(yōu)化常規(guī)PCR體系與反應(yīng)條件，以提高常規(guī)PCR檢測(cè)方法的靈敏度，以期為黃龍病早期診斷提供一種簡(jiǎn)便可靠的常規(guī)PCR檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

黃龍病陽(yáng)性樣品：采自廣東康士生物科技股份有限公司江門市新會(huì)果園內(nèi)具有典型黃龍病斑駁癥狀的柑橘樹(shù)葉片。

黃龍病陰性樣品：為廣州市齊美植物保護(hù)有限公司提供的柑橘脫毒苗葉片。

特異性測(cè)試對(duì)照樣品：包括筆者從柑橘葉面分離培養(yǎng)的腐生菌，以及由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。

空白對(duì)照樣品：DNase/RNase-Free去離子水（RT121），購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索亞洲韌皮部桿菌Candidatus Liberibacter asiaticus及其同屬其他菌種序列長(zhǎng)度大于1 000 bp的16S rRNA基因同源序列（GenBank登錄號(hào)分別為：DQ432005.1、AB038369.1、AY-919311.1、AJ542545.1、KF926817.1和KT273280.1），對(duì)獲得的所有基因片段序列用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，尋找亞洲韌皮部桿菌的保守位點(diǎn)，同時(shí)該保守位點(diǎn)又能特異地區(qū)分同屬其他種類，在該位點(diǎn)人工設(shè)計(jì)引物，利用Oligo 7.0軟件對(duì)引物進(jìn)行評(píng)估。通過(guò)預(yù)試驗(yàn)篩選出最佳引物對(duì)HLBF468/HLBR877（HLBF468：5′-GCGATTAAGTTAGAG-GTGA-3′；HLBR877：5′-TACCATCTCTGATAT-CGTCCTATA-3′），預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為433 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2 DNA提取

柑橘葉片組織：分別稱取0.1 g柑橘葉中脈及葉柄置于2.0 mL的離心管中，使用Bullet Blender GOLD24組織細(xì)胞破碎儀進(jìn)行樣品粉碎，然后使用植物基因組DNA提取試劑盒[DP305， 天根生化科技（北京）有限公司]進(jìn)行基因組DNA提取，具體操作流程參照試劑盒說(shuō)明書。

菌液：分離培養(yǎng)的柑橘葉面腐生菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒[DP302， 天根生化科技（北京）有限公司]進(jìn)行基因組DNA提取，具體操作流程參照試劑盒說(shuō)明書。

1.2.3 PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物測(cè)序

使用篩選出的引物對(duì)HLBF468/HLBR877進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)不斷調(diào)整PCR反應(yīng)試劑用量以及退火溫度、時(shí)間等，最終確定PCR反應(yīng)體系總體積為30 μL，具體包括：2×Taq PCR MasterMix [KT201， 天根生化科技（北京）有限公司] 15.0 μL，10 μmol/L上下游引物各1.0 μL，ddH2O 11 μL，模板2.0 μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3 min后進(jìn)行40次PCR循環(huán)：95℃變性30 s，55℃退火延伸30 s，72℃延伸30 s；最后72℃延伸3 min，PCR產(chǎn)物保存于4℃。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠（已加入SYBGreen熒光染料）上進(jìn)行電泳檢測(cè)，在紫外燈下觀察結(jié)果。將出現(xiàn)條帶的PCR產(chǎn)物委托上海生工生物工程有限公司純化并進(jìn)行雙向測(cè)序，返回的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)，以確定擴(kuò)增產(chǎn)物是否為目的基因片段。

1.2.4 引物HLBF468/HLBR877的特異性檢測(cè)

分別以黃龍病陽(yáng)性樣品、黃龍病陰性樣品、柑橘葉面腐生菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的DNA為模板，以DNase/RNase-Free去離子水為空白對(duì)照，利用引物對(duì)HLBF468/HLBR877，按照1.2.3的反應(yīng)體系進(jìn)行特異性檢測(cè)。

1.2.5 引物對(duì)HLBF468/HLBR877的靈敏度檢測(cè)

使用大量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒[DP210， 天根生化科技（北京）有限公司]回收純化目的條帶，具體操作流程參照說(shuō)明書。用NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度，得到的DNA濃度為11.7 ng/μL，用于后續(xù)的靈敏度檢測(cè)。

將濃度為11.7 ng/μL的DNA用DNase/RNase-Free去離子水按照10倍梯度依次稀釋為 1.17、0.117、1.17×10-2、1.17×10-3、1.17×10-4、1.17×10-5、1.17×10-6、1.17×10-7、1.17×10-8和1.17×10-9 ng/μL。以每種稀釋液為模板，水為陰性對(duì)照，用引物對(duì)HLBF468/HLBR877分別對(duì)不同濃度的模板DNA按照1.2.3中的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.6 引物對(duì)HLBF468/HLBR877與CQULA03F/ CQULA03R[15]的靈敏度對(duì)比

胡浩等[15]利用引物對(duì)CQULA03F/CQULA03R進(jìn)行黃龍病常規(guī)PCR檢測(cè)，該引物對(duì)的靈敏度為4.39×10-1 pg/μL，為國(guó)內(nèi)記載的最高靈敏度。將CQULA03F/CQULA03R和本研究篩選出的引物對(duì)HLBF468/HLBR877進(jìn)行靈敏度檢測(cè)比較。

按1.2.2的方法提取黃龍病陽(yáng)性柑橘樹(shù)葉片的基因組DNA，并將其按10倍梯度進(jìn)行稀釋，以各感病葉片組織基因組DNA稀釋液為模板，分別用引物對(duì)CQULA03F/CQULA03R按照胡浩等[15]的PCR反應(yīng)體系和本研究的引物對(duì)HLBF468/HLBR877按照1.2.3的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.7 檢測(cè)體系的應(yīng)用

2016年6月，在廣西恭城陳德全果園選取具有明顯黃龍病紅鼻子果癥狀，已確診感染柑橘黃龍病的2株砂糖橘老樹(shù)作為應(yīng)用效果檢驗(yàn)的陽(yáng)性樣本；在廣西恭城新建無(wú)黃龍病疫情的金燕子合作社和廣東新會(huì)果園，分別選取2株紅心柚樹(shù)和1株檸檬樹(shù)作為應(yīng)用效果檢驗(yàn)的陰性樣本。檢測(cè)時(shí)分別選取2株感病砂糖橘樹(shù)上未表現(xiàn)柑橘黃龍病癥狀的新生葉和其他3株作為陰性樣本的果樹(shù)新生葉提取樣本的DNA，然后應(yīng)用本研究建立的PCR檢測(cè)方法進(jìn)行柑橘黃龍病早期診斷，驗(yàn)證本研究建立體系的檢測(cè)效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物測(cè)序與相似性比對(duì)結(jié)果

委托上海生工生物工程有限公司對(duì)預(yù)期位置出現(xiàn)特異性條帶的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和雙向測(cè)序，反饋回來(lái)的測(cè)序文件經(jīng)過(guò)DNAMAN進(jìn)行正反向序列拼接后所得序列信息在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）。比對(duì)結(jié)果顯示擴(kuò)增片段序列與GenBank中登記的亞洲韌皮部桿菌16S rRNA基因片段（DQ432005.1、AB038369.1、AY919311.1）信息相似度為100%，證明擴(kuò)增出來(lái)的基因片段即為預(yù)期擴(kuò)增的目的基因片段。

2.2 引物對(duì)HLBF468/HLBR877的特異性檢測(cè)結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)后黃龍病陽(yáng)性樣品在433 bp位置出現(xiàn)特異片段；陰性樣品、其他菌種樣品和空白對(duì)照未出現(xiàn)該特異片段（圖1），表明設(shè)計(jì)的引物HLBF468/HLBR877特異性好。

2.3 引物對(duì)HLBF468/HLBR877的靈敏度檢測(cè)結(jié)果

靈敏度檢測(cè)結(jié)果表明，本研究確定的PCR反應(yīng)體系可檢測(cè)出稀釋108倍的PCR純化產(chǎn)物，即目的片段濃度達(dá)到1.17×10-7 ng/μL的情況下，可以檢測(cè)出黃龍病陽(yáng)性樣品（圖2）。

2.4 HLBF468/HLBR877與CQULA03F/CQULA03R[15]的靈敏度對(duì)比結(jié)果

按照胡浩等[15]的PCR反應(yīng)體系和本研究確定的PCR反應(yīng)體系分別進(jìn)行反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。結(jié)果顯示前者在感病葉片組織基因組DNA稀釋10倍的情況下出現(xiàn)特異性條帶；后者可在感病葉片組織基因組DNA稀釋1 000倍的情況下出現(xiàn)特異性條帶。

2.5 檢測(cè)體系應(yīng)用效果驗(yàn)證結(jié)果

應(yīng)用本研究建立的柑橘黃龍病檢測(cè)方法對(duì)廣西恭城、廣東新會(huì)等地果園的果樹(shù)進(jìn)行柑橘黃龍病早期診斷。結(jié)果如圖5所示，檢測(cè)結(jié)果與被測(cè)5株果樹(shù)實(shí)際情況一致，初步說(shuō)明本檢測(cè)方法能夠從未表現(xiàn)癥狀的感染黃龍病的果樹(shù)的新生葉組織中檢測(cè)出柑橘黃龍病病原物，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)柑橘黃龍病的早期診斷和監(jiān)測(cè)預(yù)警。同時(shí)根據(jù)我們的檢測(cè)結(jié)果建議當(dāng)?shù)毓麍@負(fù)責(zé)人及時(shí)對(duì)感病樹(shù)進(jìn)行防治，防止柑橘黃龍病的傳播蔓延，以減少經(jīng)濟(jì)損失。

3 結(jié)論與討論

本研究針對(duì)我國(guó)柑橘黃龍病，通過(guò)對(duì)病原物亞洲韌皮桿菌特異性引物的設(shè)計(jì)篩選、常規(guī)PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化，結(jié)合使用適當(dāng)?shù)闹参锘蚪MDNA提取方法，建立了一種能夠高效檢測(cè)柑橘黃龍病菌的常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)體系，為柑橘黃龍病的早期診斷提供了一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠的檢測(cè)方法。

PCR技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)，在植物病原微生物的檢測(cè)鑒定方面已得到廣泛應(yīng)用。但柑橘黃龍病病原菌主要寄生于寄主植物的維管束細(xì)胞中，在寄主體內(nèi)含量較少且分布不均勻，同時(shí)無(wú)法通過(guò)離體培養(yǎng)的方式進(jìn)行繁殖，使得提取到的病原微生物DNA太少，造成PCR檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陰性。因此，常規(guī)PCR技術(shù)的靈敏度高低決定了該方法檢測(cè)柑橘黃龍病結(jié)果的可靠性，但目前國(guó)內(nèi)多數(shù)報(bào)道的黃龍病常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)缺乏靈敏度的檢驗(yàn)[1618]，本研究設(shè)計(jì)篩選出的引物對(duì)HLBF468/HLBR877對(duì)我國(guó)柑橘黃龍病病原物亞洲韌皮桿菌具有較高的特異性及更高的靈敏度，檢測(cè)靈敏度比國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)記載的黃龍病菌常規(guī)PCR檢測(cè)方法的靈敏度有了明顯的提高。靈敏度的提高將有效避免應(yīng)用常規(guī)PCR檢測(cè)出現(xiàn)假陰性的情況，能夠滿足黃龍病早期診斷的需要。

雖然黃龍病的巢式PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法相較于常規(guī)PCR的靈敏度更高[1924]，但是巢式PCR完成一次檢測(cè)需要進(jìn)行兩輪PCR反應(yīng)，檢測(cè)所用時(shí)間及成本至少為常規(guī)PCR方法的2倍。而實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)過(guò)程涉及一些較高端的儀器設(shè)備，檢測(cè)成本也較高，更適合作為監(jiān)測(cè)黃龍病病原物動(dòng)態(tài)變化的研究方法。我們認(rèn)為基于基因片段序列差異而設(shè)計(jì)的種特異性引物的常規(guī)PCR檢測(cè)方法，具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，只要引物設(shè)計(jì)合理，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度適中，就能獲得較好的效果，更適于推廣應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

[1] 陳凱男， 李充壁. 柑橘黃龍病研究概況[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2015， 56（7）： 10481050.

[2] 李雪燕， 項(xiàng)宇， 胡文召. 中國(guó)柑橘黃龍病發(fā)生情況及防治現(xiàn)狀[J]. 中國(guó)植保導(dǎo)刊， 2011， 31（4）： 1416.

[3] COLETTA-FILHO H D， CARLOS E F， ALVES K C S， et al. In planta multiplication and graft transmission of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus revealed by real-time PCR [J]. European Journal of Plant Pathology， 2010， 126（1）： 5360.

[4] 許美容， 陳燕玲， 鄧曉玲. 柑橘黃龍病癥狀與“Candidatus Liberibacter asiaticus” PCR檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性分析[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 2016， 46（3）： 367373.

[5] 高玉霞，盧占軍，鐘八蓮，等.柑桔黃龍病常規(guī)PCR檢測(cè)4對(duì)引物的特異性和靈敏度[J].中國(guó)南方果樹(shù)，2014，43（1）：58.

[6] 歐陽(yáng)冬梅， 蔣軍喜， 宋水林， 等. 應(yīng)用PCR和測(cè)序技術(shù)診斷吉安和撫州兩地區(qū)的柑橘黃龍病[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2009， 31（6）： 10351038.

[7] 張利平， 陳國(guó)慶， 王海琴， 等. 浙江柑橘黃龍病病原β-操縱子核糖體蛋白基因的PCR檢測(cè)及其序列比對(duì)[J]. 植物保護(hù)， 2010， 36（1）： 8082.

[8] 王春梅， 張秋明， 王紅. 湖南岳陽(yáng)地區(qū)柑橘黃龍病PCR檢測(cè)[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2014，30（10）： 303306.

[9] 郭麗英，郭雁君，麥麗瑤，等.肇慶、云浮地區(qū)砂糖橘黃龍病PCR快速檢測(cè)技術(shù)的建立[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（6）：9698.

[10]楊毅，車海彥， 曹學(xué)仁， 等. 海南柑橘黃龍病PCR檢測(cè)分析[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)， 2015（24）： 5051.

[11]胡龍嬌， 伍建榕， 葉維雁， 等. 云南普文葡萄柚黃龍病病原分子檢測(cè)及鑒定[J]. 中國(guó)南方果樹(shù)， 2015， 44（2）： 1417.

[12]王紅， 張秋明， 王春梅. 湘南地區(qū)柑橘黃龍病的PCR檢測(cè)[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2007， 33（2）： 164166.

[13]DO CARMO TEIXEIRA D， DANET J L， EVEILLARD S， et al. Citrus Huanglongbing in Sao Paulo State， Brazil： PCR detection of the ‘Candidatus Liberibacter species associated with the disease [J]. Molecular and Cellular Probes， 2005， 19（3）： 173179.

[14]TEIXEIRA D C， LOPES S A， YAMAMOTO P T， et al. PCR detection of the two Liberibacter species associated with citrus huanglongbing in So Paulo State， Brazil [C]//HILF M E， DURAN-VILA N， ROCHA-PEA M A. 16th International Organization of Citrus Virologist Conference Proceedings. IOCV， Riverside， CA. 2005： 432438.

[15]胡浩， 殷幼平， 張利平， 等. 柑桔黃龍病的常規(guī)PCR及熒光定量PCR檢測(cè)[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2006， 39（12）： 24912497.

[16]孟祥春， 鐘云， 劉巖， 等. 柑桔黃龍病PCR快速檢測(cè)技術(shù)的建立與應(yīng)用[J]. 西北植物學(xué)報(bào)， 2007， 27（7）： 14611463.

[17]張偉. 柑橘黃龍病PCR檢測(cè)技術(shù)研究[J]. 生物災(zāi)害科學(xué)， 2012， 35（2）： 164168.

[18]王春梅， 張秋明， 王紅. 柑橘黃龍病PCR檢測(cè)技術(shù)研究[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013（15）： 1315.

[19]LI Wenbin， HARTUNG J S， LEVY L. Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus Huanglongbing [J]. Journal of Microbiological Methods， 2006， 66（1）： 104115.

[20]KAWAI T， KIKUKAWA K， SASAKI T， et al. Technique for detection of Huanglongbing using nested-PCR [J]. Research Bulletin of the Plant Protection Service （Japan）， 2007（43）： 2732.

[21]DENG Xiaoling， ZHOU Gen， LI Huaping， et al. Detection of Candidatus Liberibacter asiaticus from Wampee （Clausena lansium Skeels） by nested PCR [J]. Plant Health Progress， 2007， 10： 1094.

[22]鄧崇嶺，陳傳武，趙小龍，等.用Nested-PCR檢測(cè)廣西黃皮與九里香黃龍病病原[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（17）：273276.

[23]肖遠(yuǎn)輝， 陳國(guó)平， 傅翠娜. 柑橘黃龍病實(shí)時(shí)熒光PCR鑒定技術(shù)研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011， 39（6）： 33393340.

[24]黃宏明， 王茜， 徐寧， 等. 廣西砂糖橘黃龍病亞洲種的Nested-PCR檢測(cè)[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2013， 44（12）： 19972000.

（責(zé)任編輯：楊明麗）