西藏一種芥菜型油菜PGIP基因的克隆與序列分析

龐博 劉何春

摘要 防治油菜菌核病的有效方法是培育抗菌核病的油菜品種。多聚半乳糖醛酸酶阻遏蛋白（polygalacturonase inhibiting protein，PGIP），是植物體內(nèi)一種重要的抗真菌蛋白。本研究根據(jù)NCBI中發(fā)表的PGIP基因序列設(shè)計(jì)引物，從芥菜型油菜‘藏油6號(hào)中克隆得到全長1 048 bp的PGIP 基因序列。其核酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中登錄的PGIP基因序列同源性為99%。該序列翻譯后得到的氨基酸序列與NCBI上公布的油菜PGIP序列同源性為99%。該蛋白質(zhì)序列中包含 8個(gè)亮氨酸重復(fù)區(qū) （leucine-rich repeat，LRR） 。過去研究結(jié)果顯示芥菜型油菜比甘藍(lán)型、白菜型油菜對(duì)菌核病的抗性普遍較高，但是未能搞清楚具體的原因，只是提出抗菌核病基因主要分布在芥菜型油菜中，其次是甘藍(lán)型油菜中。通過研究證實(shí)了芥菜型油菜上PGIP基因具有保守性、疏水性，而且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，具有多個(gè)信號(hào)肽，能夠高效地發(fā)揮其抗核盤菌的功能。今后在油菜育種上應(yīng)利用芥菜型油菜的優(yōu)勢，發(fā)揮其抗病育種的潛力。

關(guān)鍵詞 芥菜型油菜； PGIP基因； 基因克??； 生物信息學(xué)

中圖分類號(hào)： S435.654

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017204

Abstract The best way to prevent Sclerotinia is to cultivate varieties against Sclerotinia. PGIP is an important anti-Sclerotinia protein. The full-length of PGIP CDS （1 048 bp） was cloned from Brassica juncea No. 6 in Tibet based on sequence homology， showing 99% similarity with PGIP from B.napus. The protein sequence contained 8 LRRs （leucine-rich repeats）. Previous studies showed that B.juncea had higher resistance to S. sclerotiorum than B.napus and B.campestris， but the underlying mechanism was unknown， though it was known that S.sclerotiorum genes were mainly distributed in B.juncea. The PGIP gene in B.juncea is conservative， hydrophobic， and stable in structure with several signal peptides， which has the potential for resistance to S. sclerotiorum and disease resistance breeding.

Key words Brassica juncea； PGIP gene； gene cloning； bioinformatics

油菜是我國最主要的油料作物，油菜菌核病是危害我國油菜生產(chǎn)的常見病害，對(duì)油菜的產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴(yán)重的影響，選育抗菌核病油菜品種是防控菌核病最經(jīng)濟(jì)有效的途徑。油菜菌核病的病原菌為核盤菌Sclerotinia sclerotiorum （Lib.） de Bary，該菌分泌產(chǎn)生的多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase， PG）可降解植物細(xì)胞壁，參與多個(gè)植物致病信號(hào)的傳遞，是病原真菌重要的致病因子[1]。多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（polygalacturonase inhibiting proteins，PGIPs）是一種植物細(xì)胞壁糖蛋白，它能抑制真菌所分泌的PG水解植物細(xì)胞壁的活性，并在植物體內(nèi)積累能激活多種防御反應(yīng)，從而抑制真菌的侵染[24]。此外，PGIP與PG的相互作用使植物細(xì)胞壁形成有生物活性的寡聚半乳糖醛酸（oligogalacturonide，OG），能有效地激活植物體內(nèi)的防御系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)植物的抗病性響應(yīng)，使植物獲得系統(tǒng)抗病性[2，56]，維護(hù)了植物細(xì)胞的完整性，使病原真菌可利用的營養(yǎng)物質(zhì)減少，減緩了真菌生長繁殖速度[7]。芥菜型油菜 Brassica juncea L. 是中國重要的油料作物之一，在我國西部地區(qū)廣泛種植，芥菜型油菜具有耐熱、耐貧瘠、抗旱等特點(diǎn)[8]。目前甘藍(lán)型油菜PGIP基因的研究較多[1，910]，但是芥菜型油菜PGIP基因的研究還未見報(bào)道，本研究目的是通過對(duì)菌核病有一定抗性的芥菜型油菜PGIP基因進(jìn)行克隆和生物學(xué)分析，為油菜抗菌核病育種提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 植物材料

材料選擇在大田種植對(duì)菌核病表現(xiàn)有抗性的芥菜型油菜‘藏油6號(hào)。

1.2 儀器與試劑

S1000 Thermal Cycler PCR擴(kuò)增儀、臺(tái)式冷凍離心機(jī)、SIGMA1-14小型離心機(jī)、瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)、高壓滅菌鍋、恒溫水浴鍋、超凈工作臺(tái)、搖床，北京六一電泳槽、電泳儀。TaKaRa ExTaqDNA聚合酶、10×Ex Taq Buffer （20 mmol/L Mg2+ plus）、dNTP Mixture （各2.5 mmol/L）、TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA提取試劑盒、TaKaRa 凝膠回收試劑盒、TaKaRa AgaroseD-5瓊脂糖凝膠、100 bp DNA Ladder （Dye Plus）、GoldView核酸染料、酵母提取物、TaKaRa 6×Loading Buffer。有機(jī)試劑均為化學(xué)分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 油菜DNA的提取及PGIP基因的克隆

采用CTAB法提取油菜總DNA。根據(jù)NCBI上已經(jīng)公布的油菜PGIP基因序列設(shè)計(jì)引物Pf/Pr，Pf：TCATCTCCCTAACCATAT，Pr：GTATTCG-TCCTTATTCTTC，引物由北京華大公司合成。Pf/Pr的目的片段長度為1 048 bp，編碼全長的PGIP基因。以提取的油菜總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系（25 μL）： ddH2O 16 μL；10×PCR Buffer （Mg2+ Plus）3 μL；dNTP（各2.5 mmol/L） 2 μL；上游和下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL；Taq DNA聚合酶（5 U/μL）1 μL；DNA Templet 2 μL。將PCR管內(nèi)的反應(yīng)液用槍頭輕輕吹打混勻，用小型離心機(jī)瞬時(shí)離心1次，放置于PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性3 min；94℃ 變性30 s；55℃ 退火30 s，72℃ 延伸1 min；35次循環(huán)；72℃終末延伸10 min。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，并將剩余產(chǎn)物保存于4℃冰箱。

1.3.2 PCR產(chǎn)物的回收、測序、核酸序列分析及其蛋白結(jié)構(gòu)分析和預(yù)測

回收1.3.1所得的PCR產(chǎn)物并送交華大基因公司進(jìn)行測序。使用NCBI BLAST分析PCR產(chǎn)物序列的同源性、并對(duì)核酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)功能上的分析，推導(dǎo)其氨基酸序列。使用軟件DNAstar對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行分析，確定其分子量、等電點(diǎn)、各氨基酸在蛋白中的比例，以及各種極性氨基酸、帶電氨基酸、疏水性氨基酸的組成。使用SignalP 4.1 Server對(duì)PGIP氨基酸序列進(jìn)行信號(hào)肽分析。使用Protscale軟件預(yù)測蛋白質(zhì)分子的疏水性和親水性。通過ProtComp Version9.0軟件預(yù)測PGIP蛋白的亞細(xì)胞定位，使用在線分析軟件SOPMA 和Swiss-Model分析預(yù)測蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR結(jié)果分析與比對(duì)

以芥菜型油菜DNA作為PCR反應(yīng)模板進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，引物Pf/Pr擴(kuò)增出1 048 bp的目的條帶（圖1）。

2.2 BLAST分析結(jié)果

擴(kuò)增得到1 048 bp長度的PGIP序列，將測序得到的核酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中登錄號(hào)為EU142023.1的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，同源性為99%。根據(jù)PCR產(chǎn)物推導(dǎo)出的氨基酸序列與NCBI上公布的甘藍(lán)型油菜Brassica napus（NP_001303064）序列同源性為99%。

將該段序列與其他9種植物上的PGIP蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示與不同種屬植物深山擬南芥Arabidopsis lyrata、醉蝶花Tarenaya hassleriana、山葵Eutrema salsugineum、棉花Gossypium、可可Theobroma cacao、李Prunus persica、蘿卜Raphanus sativus、黃瓜屬Cucumis和木薯Manihot esculenta的相似度分別為70%、67%、82%、63%、65%、62%、68%、60%、61%。由PCR產(chǎn)物推導(dǎo)出的該段氨基酸序列富含亮氨酸重復(fù)序列，PGIP的亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域（LRR）保守性很高，其除個(gè)別堿基替換、插入或缺失外，序列高度保守（圖2）。用BLAST2GO對(duì)該段富含亮氨酸的序列進(jìn)行功能分析（表1），結(jié)果表明，這段亮氨酸重復(fù)區(qū)包含酪氨酸激酶受體、細(xì)胞黏附分子，毒力因子和細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合蛋白，表明該蛋白很可能參與了細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞黏附、細(xì)胞膜通道、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞免疫反應(yīng)等多種生物功能。

2.3 軟件DNAstar對(duì)PGIP蛋白氨基酸序列分析結(jié)果

擴(kuò)增得到的PGIP基因編碼的蛋白包含342個(gè)氨基酸（表2），其理論分子量為38.2 kDa，等電點(diǎn)為8.2。pH為7時(shí)，電荷為4.5，堿性氨基酸（KR）36個(gè)，占總分子量12.7%，占?xì)埢倲?shù)的10.53%。酸性氨基酸（DE）32個(gè)，占總分子量的9.91%，占氨基酸殘基總數(shù)的9.36%，疏水氨基酸（AILFWV）119個(gè)，占總分子量的35.65%，占氨基酸殘基總數(shù)34.8%，極性氨基酸（NCQSTY）108個(gè)，占總分子量的30.76%，占氨基酸殘基總數(shù)的31.58%。其中亮氨酸的比例最高，占總分子量的16.25%，占氨基酸殘基總數(shù)16.08%。氨基酸序列的理化性質(zhì)分析表明，PGIP蛋白為穩(wěn)定類蛋白。

2.4 SignalP 4.1 Server對(duì)PGIP氨基酸序列信號(hào)肽分析結(jié)果

信號(hào)肽一般位于蛋白質(zhì)的N端，與蛋白的定位有關(guān)，有助于蛋白本身向細(xì)胞內(nèi)特定區(qū)域移動(dòng)，在蛋白質(zhì)合成結(jié)束之前被切除，一般具有16～26個(gè)氨基酸殘基，其中包括疏水核心區(qū)、信號(hào)肽的C端和N端。通過SignalP 4.1 Server分析表明，PGIP蛋白上有22個(gè)氨基酸屬于信號(hào)肽。這些信號(hào)肽可以引導(dǎo)PGIP順利的合成、加工、運(yùn)輸?shù)教囟ㄎ恢眯惺构δ躘1112]。

2.5 PGIP蛋白的親水性和疏水性分析

使用在線軟件Protscale預(yù)測蛋白質(zhì)分子的親水性和疏水性（圖4）[13]。通常根據(jù)蛋白平均疏水值（GRAVY）來計(jì)算蛋白的親水性和疏水性。GRAVY值在3～-2之間，橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)氨基酸殘基的序號(hào)，縱坐標(biāo)表示殘基的疏水親水的特性。若是正值表明此蛋白為疏水蛋白，且值越大越疏水，若是負(fù)值表明為親水蛋白，值越大越親水。從Protscale工具統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果，GRAVY值為+0.45（最小值： -2.127，最大值：3.027），說明蛋白具有較強(qiáng)的疏水性，且在N末端有一典型的疏水區(qū)域。疏水性在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、構(gòu)象及與其他蛋白質(zhì)的相互作用等方面具有重要作用，并且被認(rèn)為與蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)密切相關(guān)。PGIP的疏水性與蛋白質(zhì)間的相互作用、形成蛋白功能結(jié)構(gòu)域、維持PGIP蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)及信號(hào)肽的組成有關(guān)。

2.6 PGIP蛋白亞細(xì)胞定位

通過ProtComp Version9.0軟件預(yù)測PGIP蛋白的亞細(xì)胞定位，4種預(yù)測方法（LocDB、NEuralNes、Pentames、Integral）權(quán)重值最高值均顯示是胞外，由此將此蛋白定位于胞外，說明該蛋白是由細(xì)胞分泌到胞外并與PG結(jié)合，保護(hù)植物細(xì)胞壁不被降解（表3）。

2.7 PGIP蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

使用軟件SOPMA對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析[14]。結(jié)果顯示PGIP氨基酸序列顯示在二級(jí)結(jié)構(gòu)中主要由29.53%的α螺旋22.8%的延伸鏈區(qū)和41.8%的無規(guī)則卷曲構(gòu)成，凸面結(jié)構(gòu)主要是無規(guī)則卷曲，第90個(gè)氨基酸出現(xiàn)“LxxLxxLxLxxLxxL”對(duì)稱序列（圖5），芥菜型油菜PGIP具有8個(gè)亮氨酸重復(fù)序列（圖6），LRR被認(rèn)為是參與了PG蛋白質(zhì)與PGIP蛋白相互識(shí)別和相互作用的區(qū)域[1516]。這樣的序列保證了芥菜型油菜PGIP的功能，使其在與PG互作時(shí)能保持較高的活性和穩(wěn)定性。使用Swiss-Model預(yù)測蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，三級(jí)結(jié)構(gòu)是由α螺旋和延伸鏈通過Loop環(huán)連接形成一個(gè)馬蹄形分子（圖7）。

蛋白質(zhì)氨基酸序列中，半胱氨酸殘基對(duì)蛋白質(zhì)二、三級(jí)結(jié)構(gòu)的形成起著重要的作用，幾乎所有蛋白質(zhì)中都存在著半胱氨酸。位于同一蛋白質(zhì)鏈或者不同蛋白質(zhì)鏈的兩個(gè)半胱氨酸通過共價(jià)關(guān)聯(lián)形成二硫鍵。二硫鍵對(duì)維持蛋白質(zhì)的正確折疊、維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定與生物活性具有重要作用。二硫鍵的形成可導(dǎo)致同一或不同肽鏈的不同區(qū)域的氨基酸殘基靠攏集合在一起，由此肽鏈進(jìn)行折疊并形成穩(wěn)定的空間拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，具有疏水性的氨基酸殘基圍繞著二硫鍵形成局部的疏水中心，通過防止水分子的進(jìn)入來保護(hù)氫鍵[17]，從而有利于形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。在芥菜型油菜PGIP的氨基酸序列中，在N端55、56氨基酸位置和C端的317、319氨基酸位置各有2個(gè)半胱氨酸，它們之間形成二硫鍵的可能性較大。因?yàn)橛羞@樣的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)使得芥菜型油菜上的PGIP能穩(wěn)定發(fā)揮其功能作用。

3 結(jié)論與討論

過去研究結(jié)果顯示芥菜型油菜比甘藍(lán)型、白菜型油菜對(duì)菌核病的抗性普遍較高，但是未能搞清楚具體的原因，只是推測抗菌核病基因主要分布在芥菜型油菜和甘藍(lán)型油菜中[1819]。而PGIP在油菜抵抗菌核病過程中發(fā)揮了重要的作用。本文第一次在芥菜型油菜cDNA中克隆得到PGIP的完整氨基酸編碼區(qū)序列。從生物信息學(xué)角度，以芥菜型油菜為主要分析對(duì)象對(duì)其PGIP基因的核苷酸及氨基酸序列的構(gòu)成、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、生物學(xué)功能、生化特性、二、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測和分析。PGIP蛋白結(jié)構(gòu)具有典型的亮氨酸重復(fù)序列（LRR）結(jié)構(gòu)，在多種不同種屬的植物上都能找到這段蛋白質(zhì)序列，并且具有保守性，說明這段序列在植物進(jìn)化中或許扮演了非常重要的角色。通過分析，其在植物的防御系統(tǒng)中起著重要作用，能夠識(shí)別外源分子、轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)引起植物體作出免疫反應(yīng)。對(duì)PGIP進(jìn)行亞細(xì)胞定位結(jié)果表明 PGIP定位于胞質(zhì)外，其具有多個(gè)信號(hào)肽也印證了它具有的功能。芥菜型油菜上PGIP蛋白具有保守性、疏水性、而且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、具有多個(gè)信號(hào)肽，能夠高效地發(fā)揮其功能。同時(shí)有研究報(bào)道PGIP提取物除了對(duì)核盤菌有抑制作用，對(duì)小麥禾谷鐮刀菌Fusarium graminearum、玉米大斑病菌Exserohilum turcicum、水稻稻瘟病菌Pyricularia oryzae均有抑制作用[20]，由此可見PGIP蛋白對(duì)病原真菌可能具有廣譜抗性。今后在抗菌核病的油菜新品種培育上應(yīng)該多利用芥菜型油菜PGIP基因的優(yōu)勢，發(fā)揮其抗病育種上的潛力。

參考文獻(xiàn)

[1] 彭琦，陳松，張維，等.甘藍(lán)型油菜PGIP基因家族新成員PGIP18的克隆及序列分析[J].分子植物育種，2014，12（4）：687693.

[2] 陳瑞，李金晶，關(guān)瑞攀，等.三七多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因的克隆及表達(dá)分析[J]. 中草藥，2016（24）：44204427.

[3] 周立. 小麥多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白對(duì)幾種病原真菌抑制作用的研究[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 1998，28（2）：107112.

[4] DOVIDIO R， MATTEI B， ROBERTI S， et al. Polygalacturonases， polygalacturonase-inhibiting proteins and pectic oligomers in plant-pathogen interactions[J]. Biochimica et Biophysica Acta， 2004，1696（2）：237244.

[5] JUGE N. Plant protein inhibitors of cell wall degrading enzymes [J]. Trends in Plant Science， 2006， 11（7）：359.

[6] 朱佩佩，李艷梅，侯泳志，等.基于PGIP基因的薔薇科植物分子進(jìn)化樹構(gòu)建與分析[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，55（21）：56725676.

[7] DE LORENZO G， DOVIDIO R， CERVONE F. The role of polygalacturonase-inhibiting proteins （PGIPs） in defense against pathogenic fungi [J].Annual Review of Phytopathology，2001， 39： 313335.

[8] 劉淑艷，劉忠松，官春云，等. 芥菜型油菜種質(zhì)資源研究進(jìn)展[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2007，8 （3）： 351358.

[9] 皇甫海燕. 甘藍(lán)型油菜PGIP2的原核表達(dá)、蛋白功能及其遺傳轉(zhuǎn)化的研究[D].長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[10]馬田田. 甘藍(lán)型油菜抗菌核病QTL定位及相關(guān)基因表達(dá)分析[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[11]彭佳師，龔繼明.信號(hào)肽與蛋白質(zhì)的分選轉(zhuǎn)運(yùn)[J].植物生理學(xué)報(bào)，2011，47（1）：917.

[12]DYRLOV B J， NIELSEN H H G， BRUNAK S. Improved prediction of signal peptides： SignalP 3.0 [J]. Journal of Molecular Biology， 2004， 340（4）：783795.

[13]董嬌，周軍， 辛培堯，等. 不同植物L(fēng)DOX/ANS 基因的生物信息學(xué)分析[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2010，29（5）： 815822.

[14]GEOURJON C， DELEAGE G.SOPMA： Significant improvement in protein secondary structure prediction by consensus prediction from multiple alignments [J].Bioinformatics，1995，11（6）：681684.

[15]SHANMUGAM V. Role of extracytoplasmic leucine rich repeat proteins in plant defence mechanisms [J]. Microbiological Research， 2005， 160（1）：8394.

[16]KAJAVA A V， VASSART G， WODAK S J. Modeling of the three-dimensional structure of proteins with the typical leucine-rich repeats [J]. Structure， 1995， 3（9）：867.

[17]劉坤. 基于蛋白質(zhì)序列信息預(yù)測二硫鍵的新方法研究[D].南京：南京理工大學(xué)，2017.

[18]王璐璐. 貴州地方油菜種質(zhì)資源菌核病的抗性鑒定與評(píng)價(jià)[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（4）：4246.

[19]晏立英，周樂聰，談?dòng)羁。? 油菜菌核病拮抗細(xì)菌的篩選和高效菌株的鑒定[J]. 中國油料作物學(xué)報(bào)，2005，27（2）：5557.

[20]GOMATHI V， GNANAMANICKAM S S. Polygalacturonase-inhibiting proteins in plant defence [J].Current Science， 2004， 87（9）：12111217.

（責(zé)任編輯：田 喆）