拮抗菌AL7的鑒定及其生防特性的初步研究

劉海洋 王琦 王偉 張仁福 韓萬里 姚舉

摘要 從新疆棉田中分離獲得一株細(xì)菌AL7， 利用形態(tài)觀察、生理生化性狀測(cè)定結(jié)合16S rDNA、gyrB序列分析對(duì)菌株AL7進(jìn)行種屬鑒定， 測(cè)定了菌株AL7及其揮發(fā)性氣體對(duì)棉花黃萎病菌Verticillium dahliae的拮抗能力， 利用酸沉淀法粗提菌株AL7的抑菌活性物質(zhì)， 并測(cè)定了該活性粗提物對(duì)棉花黃萎病菌生長及其孢子萌發(fā)的拮抗能力， 利用薄層層析法對(duì)活性物質(zhì)進(jìn)行了初步分離。結(jié)果表明， 菌株AL7為甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌Bacillus methylotrophicus， 該菌株對(duì)棉花黃萎病菌具有極強(qiáng)的抑制作用， 分泌在PDA平板中的抑菌物質(zhì)對(duì)病原菌的抑制持效期達(dá)14 d以上， 該菌株產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體對(duì)棉花黃萎病菌的抑制效果達(dá)59.2%； 菌株AL7的脂肽粗提物對(duì)棉花黃萎病菌抑制率達(dá)到82.8%， 能夠充分抑制大麗輪枝菌孢子的萌發(fā)， 抑菌圈直徑為36.1 mm， 生物自顯影分析表明， 菌株AL7分泌的抑菌活性物質(zhì)Rf值約為0.75～0.83， 該菌株在防治棉花黃萎病方面表現(xiàn)出較好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 拮抗菌； 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌； 抑菌活性物質(zhì)； 生物自顯影分析

中圖分類號(hào)： S 476

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017215

Abstract The bacterial strain AL7 was isolated from the cotton field in Xinjiang. It was identified through morphologic observation， physiological and biochemical character determination and 16S rDNA and gyrB gene sequence analysis. The antagonistic effect of strain AL7 and its volatile gas that suppresses Verticillium dahliae growth were tested by confrontation culture method. Anti-fungal active ingredients of strain AL7 were extracted by acidic precipitation. The antagonistic effect of the active ingredients suppressing V. dahliae growth and their spore germination activities were tested by Oxford-cup test and plating method. The active substances were preliminarily separated by thin-layer chromatography method. The results indicated that strain AL7， identified as Bacillus methylotrophicus， had strong antagonistic effect on the growth of V. dahliae， with an inhibition zone of 33 mm in diameter and a lasting period of 14 d. The antibacterial effect of its volatile gas was above 50%. The antibacterial effect of the active crude extracts of strain AL7 was above 80%， which could sufficiently suppress the spore germination of V. dahliae. The diameter of inhibition zone was 36.1 mm and the Rf value of the anti-fungal active ingredient was about 0.75 to 0.83. Our research suggests that strain AL7 has good development prospect for control of cotton Verticillium wilt.

Key words antagonistic bacterium； Bacillus methylotrophicus； antifungal active ingredient； bioautography analysis

隨著全國棉花種植重心向新疆轉(zhuǎn)移， 新疆棉區(qū)在我國棉花產(chǎn)業(yè)中的戰(zhàn)略地位愈加凸顯。棉種跨區(qū)調(diào)運(yùn)、病區(qū)秸稈還田、常年連作等突出問題導(dǎo)致棉花黃萎病在新疆發(fā)生加重而原因復(fù)雜[1]， 已成為新疆棉花產(chǎn)業(yè)發(fā)展的嚴(yán)重制約因素， 急需找到適合新疆棉區(qū)的控制棉花黃萎病措施。

棉花黃萎病的病原為大麗輪枝菌Verticillium dahliae， 其具有致病力分化嚴(yán)重， 變異速度快的特點(diǎn)[2]， 現(xiàn)階段缺乏有效手段防治該病?；瘜W(xué)農(nóng)藥的減量施用已成為大勢(shì)所趨， 生物防治在棉花黃萎病的防控方面展現(xiàn)出巨大優(yōu)勢(shì)。前人篩選到大量對(duì)棉花黃萎病有較好抗菌效果的生防菌株[312]， 枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis NCD-2制劑對(duì)棉花黃萎病的防治效果可達(dá)70%[3]?？咕鞍住⒅念惪股?、環(huán)二肽等是生防細(xì)菌產(chǎn)生的主要抑菌活性物質(zhì)， 此類物質(zhì)能夠破壞病原菌細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使其變形和裂解， 抑制病原菌生長[1315]。

新疆地理環(huán)境獨(dú)特， 土壤鹽堿度高。實(shí)踐應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)， 利用國內(nèi)現(xiàn)有生防菌劑等產(chǎn)品防治棉花黃萎病時(shí)， 存在防治效果不穩(wěn)定的問題。而菌株AL7是自新疆嚴(yán)重發(fā)病棉田內(nèi)分離到的一株生防細(xì)菌， 對(duì)新疆地域生態(tài)環(huán)境高度適應(yīng)， 對(duì)棉花黃萎病菌的拮抗能力極強(qiáng)， 具有較好的應(yīng)用前景。擬通過本研究， 完成對(duì)菌株AL7的種屬鑒定， 測(cè)定該生防菌的抑菌活性物質(zhì)對(duì)棉花黃萎病菌的拮抗能力， 為研究菌株AL7的生防機(jī)制打下基礎(chǔ)， 為棉花黃萎病的防治提供生防資源， 為研制適應(yīng)新疆生態(tài)環(huán)境的棉花黃萎病生防產(chǎn)品提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及藥品

供試菌株： 細(xì)菌AL7從石河子市棉花黃萎病發(fā)生嚴(yán)重棉田土壤中分離； 棉花黃萎病菌Verticillium dahliae由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

培養(yǎng)基： 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基 （potato dextrose agar， PDA）； 肉湯培養(yǎng)基 （lysogeny broth agar， LB）； 可溶性淀粉培養(yǎng)基 （soluble starch agar）； 脫脂牛奶培養(yǎng)基 （skim milk agar）； 茯苓粉培養(yǎng)基 （tuckahoe powder agar， ABP）； 纖維素剛果紅培養(yǎng)基 （cellulose cong red agar）。以上培養(yǎng)基均添加去離子水至1 L， 自然pH， 121℃高壓蒸汽滅菌25 min。

供試試劑： 細(xì)菌DNA基因組試劑盒、三氯甲烷、甲醇、濃鹽酸、盧哥式碘液等。

供試儀器： 顯微鏡、高速冷凍離心機(jī)、PCR儀、牛津杯、TLC板、層析缸等。

1.2 菌株AL7的形態(tài)觀察、生理生化性狀測(cè)定及生防相關(guān)酶檢測(cè)

將菌株AL7接種于LB斜面上，35℃培養(yǎng)24 h，挑取少量菌體用無菌水稀釋，分別取10-4和10-5稀釋液100 μL涂布LB培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)；挑取LB斜面上35℃培養(yǎng)24 h的菌株AL7進(jìn)行革蘭氏染色，顯微觀察其菌體及芽胞形態(tài)；參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)菌株AL7分別進(jìn)行生長溫度等生理生化指標(biāo)測(cè)定[16]。淀粉酶檢測(cè)：取新活化的菌株AL7穿刺接種于含1%可溶性淀粉的平板上，30℃培養(yǎng)72 h，待形成明顯菌落后，在平板上滴加盧哥式碘液染色2 min， 然后快速用70%乙醇洗板， 觀察菌落生長處無色透明圈形成情況； 蛋白酶、葡聚糖酶、纖維素酶檢測(cè)： 取新活化的菌株AL7分別穿刺接種于脫脂牛奶瓊脂平板、ABP平板、剛果紅平板上， 30℃培養(yǎng)72 h后觀察菌落外圍透明圈形成情況。每處理均3次重復(fù)。

1.3 菌株AL7的 16S rDNA、gyrB序列分析及脂肽類抗生素合成基因檢測(cè)

采用 DNA 提取試劑盒， 提取菌株AL7的總DNA， 進(jìn)行16S rDNA、gyrB序列[17]以及脂肽類抗生素合成基因ituC、ituA、ituD、fenB、fenD、fenACE、sfp、srfAA、bmyB、bymC、mycB擴(kuò)增[18]， 擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)， PCR 產(chǎn)物直接測(cè)序， 采用雙向測(cè)序方法， 測(cè)序工作由北京鼎國昌盛生物公司完成， 將測(cè)序得到的16S rDNA、gyrB序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列進(jìn)行BLAST分析， 從中獲取相近的序列， 利用MEGA 6 neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。本研究所用試劑盒、引物、Marker及反應(yīng)體系均購自北京鼎國昌盛生物公司。

1.4 菌株AL7對(duì)棉花黃萎病菌的拮抗能力測(cè)定

用直徑5 mm打孔器在棉花黃萎病菌菌落邊緣取菌塊接入PDA平板中心， 距中心30 mm處利用無菌牙簽點(diǎn)接或劃線接種菌株AL7， 以僅接種病原菌的平板作為對(duì)照， 待對(duì)照組病原菌長滿平板時(shí)測(cè)量菌株AL7對(duì)病原菌的抑菌帶寬度及病原菌生長量。每處理3次重復(fù)。

按上述方法利用無菌牙簽在PDA平板中央兩側(cè)點(diǎn)接菌株AL7， 培養(yǎng)10 d后， 為逐步排除活菌干擾，用無菌刀片將平板上一端生長有菌株AL7菌落的培養(yǎng)基去除， 繼續(xù)培養(yǎng)7 d后， 去除平板上另一端菌株AL7， 再培養(yǎng)7 d， 測(cè)量病原菌生長量變化情況， 用以測(cè)定菌株AL7分泌活性物質(zhì)的抑菌穩(wěn)定性。以僅接種病原菌的平板作為對(duì)照， 每處理3次重復(fù)。

將菌株AL7在LB平板上劃線培養(yǎng)， 將直徑5 mm的棉花黃萎病菌接種于PDA平板中心， 將以上2個(gè)平板對(duì)扣后用封口膜密封， 將空白LB平板與接種病原菌的PDA平板對(duì)扣處理為對(duì)照， 26℃培養(yǎng)， 15 d后測(cè)各處理病原菌生長量， 每處理3次重復(fù)。

1.5 菌株AL7活性物質(zhì)提取[19]及其拮抗能力測(cè)定

取新活化的菌株AL7接種于LB培養(yǎng)液中， 30℃， 160 r/min培養(yǎng)3 d， 8 000 r/min離心20 min去沉淀， 取上清液， 6 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至2.0， 靜置于4℃冰箱中過夜。后經(jīng)8 000 r/min， 4℃， 20 min離心收集沉淀， 將沉淀物在電熱鼓風(fēng)干燥箱中65℃烘干， 再用甲醇抽提， 抽提液用細(xì)菌過濾器 （d=0.2 μm）過濾， 將過濾后的抽提液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干， 得到脂肽粗提物（CLP）， 備用。

采用打孔法、平板涂抹法與管碟法測(cè)定菌株AL7脂肽粗提物對(duì)棉花黃萎病菌的拮抗能力。脂肽粗提物濃度為1 000 μg/mL （溶劑為2.5% DMSO）。將棉花黃萎病菌菌塊接入PDA平板中心， 在距PDA平板中心30 mm處直線兩端利用直徑5 mm打孔器打孔， 孔內(nèi)加入200 μL菌株AL7脂肽粗提物， 另一孔內(nèi)加入200 μL甲醇作對(duì)照， 測(cè)定病原菌的生長量； PDA培養(yǎng)液中接種棉花黃萎病菌， 27℃， 120 r/min培養(yǎng)7 d， 利用無菌紗布過濾后制成孢子懸浮液， 取500 μL孢子懸浮液在PDA平板上涂抹均勻， 之后放置牛津杯于此平板之上， 加入100 μL的菌株AL7脂肽粗提物， 測(cè)定對(duì)棉花黃萎病菌孢子的抑制情況； 將200 μL的菌株AL7脂肽粗提物涂抹于PDA平板之上， 將棉花黃萎病菌菌塊接入平板中心， 測(cè)定病原菌的生長量， 以未涂脂肽粗提物的平板處理為對(duì)照。以上試驗(yàn)處理及對(duì)照均3次重復(fù)。

1.6 菌株AL7活性物質(zhì)的生物自顯影分析[20]

在超凈工作臺(tái)中將TLC薄層層析板 （silica gel to 60， units 20 cm×20 cm HX083296）用滅菌剪刀剪成 10 cm長的鋁板。標(biāo)記樣品點(diǎn)樣位置， 樣品距層析板底部1 cm， 距兩邊2 cm， 點(diǎn)樣， 待樣品完全干燥后將鋁板垂直放入預(yù)先加有展開劑（三氯甲烷∶甲醇∶水體積比為65∶25∶4）的層析缸中（20 cm×20 cm）， 凡士林密封； 當(dāng)前沿流動(dòng)相移動(dòng)至約7～9 cm時(shí)， 取出層析板， 在超凈工作臺(tái)中吹干 （至少要干燥1 h以上）， 使有機(jī)溶劑揮發(fā)完全， 防止影響病原菌生長； 沿前沿處剪下， 后將條帶貼于涂有大麗輪枝菌孢子的培養(yǎng)基上， 室溫放置 2 h， 使樣品擴(kuò)散至培養(yǎng)基中。取下層析板， 25℃培養(yǎng)3 d， 觀察試驗(yàn)結(jié)果， 抑菌帶位置指示了通過TLC分離的抗菌物質(zhì)的位置。試驗(yàn)3 次重復(fù)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2010軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株AL7的形態(tài)觀察、生理生化性狀測(cè)定及生防相關(guān)酶檢測(cè)

菌株AL7在LB平板上生長良好， 菌落近圓形， 表面有明顯皺褶， 干燥， 不透明， 近白色，革蘭氏陽性， 菌體桿狀， 產(chǎn)芽胞。

生理生化試驗(yàn)結(jié)果如表1所示， 菌株AL7革蘭氏染色陽性， 耐鹽性強(qiáng)， 在12%的氯化鈉中可生長， 耐高溫， 能夠利用（NH4）2HPO4、KNO3、甘露糖、麥芽糖、可溶性淀粉， 有運(yùn)動(dòng)性， 能使明膠液化， 產(chǎn)H2S； 呈陽性反應(yīng)的有硝酸鹽還原、檸檬酸鹽、酪素水解、淀粉水解、葡萄糖氧化、接觸酶、脲酶、PHE脫氨酶、V-P反應(yīng)； 甲基紅反應(yīng)、吲哚試驗(yàn)呈陰性。與文獻(xiàn)報(bào)道中甲基營養(yǎng)型測(cè)定性狀相符， 而與文獻(xiàn)報(bào)道中解淀粉芽胞桿菌在麥芽糖和檸檬酸鹽利用、甲基紅反應(yīng)、酪素水解、吲哚試驗(yàn)、PHE脫氨酶、H2S產(chǎn)氣等方面存在不同。

綜合菌株AL7形態(tài)特征和生理生化特性， 參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行檢索， 初步鑒定菌株AL7為芽胞桿菌屬。

菌株AL7能夠產(chǎn)生多種與生防相關(guān)的酶， 該菌株在可溶性淀粉平板上30℃培養(yǎng)72 h后， 滴加盧哥式碘液染色后形成了平均直徑25.6 mm的明顯透明圈 （圖1 a）， 具有較強(qiáng)的產(chǎn)淀粉酶能力； 在脫脂牛奶平板上30℃培養(yǎng)72 h后， 形成了平均直徑21.2 mm的明顯透明圈 （圖1b）， 具有較強(qiáng)的產(chǎn)蛋白酶能力； 同時(shí)， 菌株AL7具有產(chǎn)葡聚糖酶和纖維素酶的能力， 其在茯苓粉平板 （圖1c）、剛果紅平板 （圖1 d）上培養(yǎng)72 h后， 形成了較小的透明圈。

2.2 菌株AL7的16S rDNA與gyrB序列分析

將菌株AL7的16S rDNA 序列進(jìn)行BLAST 分析， 選擇序列相似性高的序列， 采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。菌株AL7與模式菌株甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌B.methylotrophicus（登錄號(hào)：EU194897.1）和解淀粉芽胞桿菌B.amyloliquefaciens（登錄號(hào)：HM107806.1）歸為一個(gè)分支（圖2a）， 16S rDNA序列分析結(jié)果可將菌株AL7確定為芽胞桿菌屬， 但未直接鑒定到種。

以菌株AL7的gyrB基因序列與文獻(xiàn)報(bào)道[32]的模式菌株的gyrB基因序列比對(duì)結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹， 菌株AL7與甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌B.methylotrophicus（登錄號(hào)：JN896940.1）可歸為一支， 親緣關(guān)系最近且遺傳距離一致（圖2b）， 利用gyrB基因序列鑒定菌株AL7為甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌。2株解淀粉芽胞桿菌（登錄號(hào)：KC311724.1、JX014631.1）歸為一支。

綜合該菌株的形態(tài)特征、生理生化特性及16S rDNA 序列與gyrB 基因序列分析結(jié)果， 將菌株AL7鑒定為甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌。

2.3 菌株AL7對(duì)棉花黃萎病菌的拮抗能力測(cè)定

在PDA平板上將菌株AL7與棉花黃萎病菌對(duì)峙培養(yǎng)20 d， 菌株AL7在PDA平板上生長良好， 形成直徑約20.1 mm的菌落， 其對(duì)棉花黃萎病菌表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑制作用， 抑菌帶寬平均為13.2 mm， 充分抑制了棉花黃萎病菌在培養(yǎng)基上的生長， 致使其菌落呈梭形（圖3a）。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 菌株AL7發(fā)酵上清液對(duì)大麗輪枝菌菌落生長及其孢子萌發(fā)沒有明顯的抑制效果， 為測(cè)定菌株AL7活性物質(zhì)抑菌持久性， 在PDA平板上將菌株AL7與棉花黃萎病菌進(jìn)行兩側(cè)對(duì)峙培養(yǎng)，10 d后菌株AL7明顯抑制了棉花黃萎病菌的生長，接種AL7處理病原菌菌落直徑分別為17.6 mm、10.5 mm，而空白處理病原菌菌落直徑為44.3 mm；去除病原菌單側(cè)的菌株AL7記為AL7 R處理，將其繼續(xù)培養(yǎng)7 d，此時(shí)， 接種AL7處理病原菌菌落直徑為19.0 mm，增加1.4 mm； AL7 R處理中病原菌菌落直徑為10.5 mm， 未增加； 而空白處理病原菌菌落直徑為62.0 cm； 去除AL7 R處理中病原菌另一側(cè)的菌株AL7后再繼續(xù)培養(yǎng)7 d， 此時(shí)， 接種AL7處理病原菌菌落直徑為19.7 mm， 繼續(xù)增加0.7 mm， AL7 R處理中病原菌菌落直徑為11.5 mm， 較7 d前增加1.5 mm， 而空白處理病原菌菌落長滿全皿， 直徑為84.7 mm。結(jié)果表明， 隨著AL7菌株的移除， AL7處理14 d病原菌直徑增加2.1 mm， AL7 R處理14 d病原菌直徑增加1.0 mm， 棉花黃萎病菌沒有明顯恢復(fù)生長， 其分泌在培養(yǎng)基中的活性物質(zhì)具有較好的抑菌持久性， 能夠長期抑制病原菌的生長（圖4）。

2.4 菌株AL7產(chǎn)揮發(fā)性氣體對(duì)棉花黃萎病菌的抑制能力

在PDA平板上將菌株AL7與棉花黃萎病菌對(duì)扣培養(yǎng)15 d， 菌株AL7對(duì)扣處理的大麗輪枝菌的菌落直徑平均為30.2 mm， 而空白處理大麗輪枝菌的平均菌落直徑為74.5 mm， 經(jīng)計(jì)算， 菌株AL7揮發(fā)性氣體對(duì)大麗輪枝菌抑菌效果為59.2%， 表明菌株AL7產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體對(duì)棉花黃萎病菌的生長有明顯的抑制作用（圖5）。

2.5 菌株AL7的活性粗提物對(duì)棉花黃萎病菌的拮抗能力

菌株AL7抑菌活性粗提物的平板打孔法測(cè)定結(jié)果顯示 （圖6a）， 菌株AL7的抑菌活性粗提物致使棉花黃萎病菌菌絲生長異常， 菌落出現(xiàn)明顯褶皺， 棉花黃萎病菌完全不能向含有活性粗提物的一側(cè)生長， 顯示出明顯的拮抗效果； 平板涂抹法 （圖6c）測(cè)定菌株AL7的活性粗提物對(duì)棉花黃萎病菌的平均抑制率達(dá)到82.8%； 牛津杯法測(cè)定菌株AL7活性粗提物對(duì)棉花黃萎病菌孢子萌發(fā)抑制的結(jié)果表明， 菌株AL7活性粗提物能夠充分抑制大麗輪枝菌孢子的萌發(fā)， 形成的抑菌圈直徑平均為36.1 mm （圖6d）。

2.6 菌株AL7脂肽類抗生素相關(guān)合成基因檢測(cè)

經(jīng)PCR檢測(cè)， 拮抗菌株AL7含有ituA、ituD、fenB、sfp、srfAA、bmyB、bymC 7種參與脂肽類抗生素合成的基因（圖7）。其中， ituA和ituD為伊枯草素合成酶基因， fenB為豐原素合成酶基因， sfp和srfAA為表面活性素合成調(diào)控基因， bmyB和bymC為芽胞菌霉素合成酶基因。

2.7 菌株AL7活性物質(zhì)的生物自顯影分析

拮抗菌株AL7的脂肽類抗生素粗提物生物自顯影分析表明， 菌株AL7的活性粗提物只產(chǎn)生了一條明顯的抑菌帶， 該物質(zhì)能夠顯著抑制大麗輪枝菌孢子的萌發(fā) （圖8）， 經(jīng)計(jì)算， 該活性物質(zhì)的Rf值約0.73～0.83。

3 討論

研究表明， 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌對(duì)多種植物病害具有較好的防治效果， 劉偉等篩選到2株分別對(duì)番茄灰霉病菌Botrytis cinerea、煙草青枯病菌Ralstonia solanacearum等多種病原菌有較強(qiáng)生防效果的甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌LW-6-1[22]和LW-4[33]， LW-6-1對(duì)番茄灰霉病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制率分別為95.34%和93.98%； LW-4菌懸液對(duì)煙草青枯病菌的防治效果為70.37%， 對(duì)煙草有明顯的促生作用。王洪梅等從土壤中篩選出一株甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌N5， 具有產(chǎn)生鐵載體、β-1，3-葡聚糖酶、纖維素酶、蛋白酶以及多種脂肽類抗菌物質(zhì)的能力， 該菌與有機(jī)肥二次發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)番茄青枯病菌R. solanacearum盆栽防效達(dá)69%[34]。謝學(xué)文等篩選得到一株對(duì)黃瓜炭疽病菌Colletotrichum orbiculare具有較強(qiáng)拮抗活性的甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌WF-3， 該菌株活體盆栽條件下對(duì)黃瓜炭疽病的防治效果為66.48%， 田間防效最高達(dá)73.70%[17]， 以上研究表明甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌具有較為廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。

菌株AL7經(jīng)鑒定為甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌B.methylotrophicus， 翟楓等曾初步報(bào)道了甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 LW-4在棉花黃萎病防治上的應(yīng)用[35]， 但并未對(duì)該菌株抗菌活性物質(zhì)進(jìn)行研究。劉偉等報(bào)道甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌LW-4的抑菌物質(zhì)對(duì)煙草青枯病菌R. solanacearum的抑菌圈直徑達(dá)37.8 mm[33]。本文研究表明， 菌株AL7高度耐鹽， 能產(chǎn)大量的淀粉酶和蛋白酶， 其活菌體對(duì)棉花黃萎病菌V. dahliae具有極強(qiáng)的抑菌能力， 該菌株產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體對(duì)棉花黃萎病菌的抑制效果達(dá)50%以上。利用涂抹法、打孔法測(cè)定發(fā)現(xiàn)， 拮抗菌AL7發(fā)酵液對(duì)大麗輪枝菌菌絲生長和孢子萌發(fā)沒有明顯抑制作用， 但是， 利用酸沉淀法提取的菌株AL7分泌的抑菌活性粗提物對(duì)棉花黃萎病菌的菌絲生長抑制率達(dá)到80%以上， 并能夠充分抑制該菌孢子的萌發(fā)， 抑菌圈直徑為36 mm， 抑菌效果明顯， 與黃霄等[21]研究結(jié)論一致， 表明菌株 AL7抑菌能力主要是菌體競爭。

拮抗作用是芽胞桿菌防治植物病害的一個(gè)重要機(jī)制， 其通過產(chǎn)生抗菌代謝產(chǎn)物抑制病原菌的生長繁殖或直接殺死病原菌， 從而達(dá)到防治植物病害的目的[36]。芽胞桿菌分泌的抗菌代謝產(chǎn)物主要有蛋白類物質(zhì)[3738]、脂肽類抗生素[3942]及其他類別物質(zhì)[4344]。吳燕燕等研究發(fā)現(xiàn)， 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌抗菌肽能夠延長羅非魚片的保質(zhì)期4 d以上[45]。呂倩等首次報(bào)道從海洋中分離得到一株甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌SHB114， 分離純化得到了具有較強(qiáng)抑制活性的bacillomycin Lc類脂肽， 對(duì)黃瓜炭疽病菌C.orbiculare、立枯絲核菌Rhizoctonia solani、黃瓜枯萎病菌Fusarium oxysporium f.sp. cucumeris等植物病原真菌的抑制作用較強(qiáng)[46]。菌株AL7經(jīng)檢測(cè)含有伊枯草素、表面活性素、豐原素等多種脂肽類抗生素合成基因， 利用酸沉淀法提取到的菌株AL7的脂肽類抑菌粗提物對(duì)棉花黃萎病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)抑制作用明顯， 生物自顯影分析表明該活性物質(zhì)Rf值約為0.75～0.83， 其揮發(fā)性氣體中同樣含有對(duì)棉花黃萎病菌具有明顯抑制作用的物質(zhì)， 具體是何種物質(zhì)還需進(jìn)行深入研究。

菌株AL7自新疆棉區(qū)嚴(yán)重發(fā)生黃萎病棉田內(nèi)健康棉株根際土壤中分離獲得， 其能夠更好地適應(yīng)新疆農(nóng)田生態(tài)環(huán)境， 具有較好的在新疆開發(fā)應(yīng)用的前景， 下一步通過液相色譜、制備HPLC等分析化學(xué)手段解析菌株AL7產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)， 深入研究菌株AL7的生防機(jī)制， 為該菌株的開發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：田 喆）