棉蚜唾液腺蛋白armet基因的克隆及表達特性分析

任柯昱 張帥 雒珺瑜 呂麗敏 崔金杰 祝建波

摘要 armet是一種水溶性唾液蛋白，在蚜蟲取食過程中具有重要作用。本研究結合棉蚜的轉錄組分析結果，以注釋的armet基因轉錄本作為參考，克隆得到棉蚜的armet基因（GenBank登錄號KY612465）。armet基因的開放閱讀框為522 bp，編碼173個氨基酸。在其氨基酸序列的N端具有一個由21個氨基酸組成的信號肽。在其氨基酸序列的C-末端具有內質網(wǎng)滯留信號KDEL。運用RT-qPCR分析棉花型棉蚜和黃瓜型棉蚜的時間表達譜，結果表明，armet基因的表達量在除3日齡成蚜外的各個時期均穩(wěn)定表達，在兩種?；兔扪林斜磉_量相當，說明armet基因可能在棉蚜整個生命活動過程中均起重要作用。分別將棉花型棉蚜和黃瓜型棉蚜轉接到西葫蘆Cucurbita pepo L.后，通過熒光定量PCR檢測armet基因在轉接寄主前后表達量的變化，結果顯示armet基因在轉接第2代3日齡黃瓜型成蚜中的表達量顯著高于轉接前，在其他轉接試驗中轉接前后表達量有變化，但未達到顯著水平，說明armet基因在不同?；兔扪良闹鬓D接試驗的成、若蚜中發(fā)揮不同作用。

關鍵詞 棉蚜； 寄主?；?； armet； 寄主轉移； 表達譜

中圖分類號： S 433.39

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017062

Abstract ARMET is a water-soluble saliva protein thought to be crucial for Aphis feeding. In this study， the gene armet was cloned according to the annotated armet transcript sequence from the Aphis gossypii transcriptome （GenBank accession no. KY612465）. The open reading frame of armet was 522 bp， encoding 173 amino acids. It had a signal peptide sequence of 20 amino acid residues in N-terminal region. The C-terminus of its amino acid sequence had an ER retention signal that was KDEL. The temporal expression pattern of armet in aphids on Cucumis sativus and Gossypium hirsutum were studied by RT-qPCR analysis. The expression level of armet gene was stable in all stages except in 3-day-old aphids， and the expression level of armet gene in two biotypes of cotton aphids was similar， which indicated that armet gene might play an important role in the whole life of cotton aphid. The aphids were then transferred to Cucurbita pepo L. from C.sativus and G.hirsutum aphid and the expression of armet was detected by RT-qPCR. The results showed that the expression of armet gene in the 3-day-old aphids of the second generation on C.sativus was significantly higher than that before the transfer， but no significant differences were observed transferrin other transfer experiments， indicating that the armet gene played different roles in the host transfer process.

Key words Aphis gossypii； host biotype； armet； host transfer； gene expression profile

棉蚜Aphis gossypii屬半翅目刺吸式口器昆蟲，其生態(tài)適應性廣，為多食性昆蟲，在長期的進化過程中，已形成不同的寄主?；?。據(jù)研究報道，在世界上，棉蚜的寄主多達285種[1]。在中國，棉蚜主要分為黃瓜型棉蚜和棉花型棉蚜[23]，棉花型與黃瓜型的棉蚜相互轉接后其存活率及繁殖力均明顯下降且不能建立種群，棉花型棉蚜和黃瓜型棉蚜都能在西葫蘆上建立種群[4]。西葫蘆為棉花型棉蚜和黃瓜型棉蚜的重要中間寄主[5]。

棉蚜在與寄主植物長期協(xié)同進化過程中，形成了復雜的互作關系。當棉蚜為害寄主植物時，棉蚜唾液中的特異性激發(fā)子被寄主植物細胞表面的受體識別，從而誘導植物產(chǎn)生免疫反應。而棉蚜通過唾液中的特異性效應子抑制寄主植物的免疫防御反應[6]。棉蚜為刺吸式口器昆蟲，在取食寄主植物韌皮部汁液的過程中，分泌凝膠唾液和水溶性唾液，其中水溶性唾液主要為唾液蛋白，具有引發(fā)和抑制寄主植物防御反應，促進棉蚜取食的作用[7]。

armet又稱為中腦星形膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子（MANF），具有內質網(wǎng)滯留信號，在內質網(wǎng)脅迫中，響應非折疊蛋白反應（UPR）[8]。在蚜蟲中，armet是一種鈣離子結合蛋白，是蚜蟲唾液腺中高表達蛋白之一[9]。armet隨唾液分泌到寄主植物中，與篩管中的Ca2+結合，從而防止Ca2+與Forisome蛋白結合，致使篩管無法被Forisome蛋白阻塞，抑制寄主植物的免疫防御反應，而利于蚜蟲取食[10]。

棉蚜的唾液蛋白是棉蚜與寄主植物相互作用的橋梁，在棉蚜寄主轉換及適應不同寄主的過程中具有重要作用。本文分別以棉蚜的兩種寄主?；停好藁ㄐ兔扪痢ⅫS瓜型棉蚜為研究對象，研究棉蚜唾液蛋白基因armet在棉蚜兩寄主?；椭械谋磉_譜，以及兩種寄主?；驮谥虚g寄主——西葫蘆上飼養(yǎng)4代后，armet基因表達量的變化。以期闡明棉蚜唾液蛋白基因armet在不同寄主?；兔扪林械谋磉_情況及棉蚜寄主轉移中的作用，為更進一步研究armet基因在棉蚜中的具體作用指明方向，為更加有效地防治棉蚜提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 供試植物

試驗所用棉花Gossypium hirsutum Linn.品種為‘中棉所49，由中棉所種質資源中期庫提供；黃瓜Cucumis sativus Linn.品種為‘新津優(yōu)一號，西葫蘆Cucurbita pepo Linn.品種為‘極早優(yōu)美，購于市場。將試驗所用植物材料種植于人工氣候室內，溫度（26±1）℃，濕度70%～80%，光周期L∥D=14 h∥10 h。

1.2 供試昆蟲

棉花型棉蚜和黃瓜型棉蚜分別采自中國農業(yè)科學院棉花研究所東場試驗田的棉花和黃瓜植株上，分別由一頭成蚜單獨飼養(yǎng)，繁殖獲得單克隆系。飼養(yǎng)條件：溫度（26±1）℃，濕度70%～80%，光周期L∥D=14 h∥10 h。

將棉花型棉蚜和黃瓜型棉蚜的成蚜分別接到放于培養(yǎng)皿中的離體棉花和黃瓜葉片的背面，葉柄用浸透水的脫脂棉包裹，以保持葉片的新鮮，24 h后去除成蚜，留若蚜于皿中，繼續(xù)飼養(yǎng)，每天觀察蚜蟲蛻皮情況，并適時更換葉片。分別收集棉花型棉蚜和黃瓜型棉蚜1、2、3、4齡若蚜和1、3、5、7日齡成蚜樣品，每個時期收集約30 mg為一組，共收集3組。將棉花型棉蚜和黃瓜型棉蚜的成蚜分別接于離體的西葫蘆葉片上，分別收集每一代棉花型棉蚜和黃瓜型棉蚜3齡若蚜和3日齡成蚜樣品，共收集4代，每個時期的蚜蟲取約30 mg為一組，收集3組。液氮速凍后保存于-70℃冰箱中備用。

1.3 棉蚜總RNA的分離及cDNA的合成

棉蚜總RNA的提取按照Trizol試劑（Ambion公司）說明書進行。運用Nanodrop 2000及瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA濃度、純度以及其完整性。利用TaKaRa公司的PrimeScriptTM RT Reagent Kit （Perfect Real Time）試劑盒，將以上不同時期棉蚜的總RNA反轉錄為單鏈的cDNA。

1.4 基因克隆

以本實驗室得到的棉蚜轉錄組數(shù)據(jù)庫為基礎，并結合NCBI數(shù)據(jù)庫，利用BLAST比對，獲得棉蚜的armet基因序列。運用Primer Premier 5.0設計引物。armet的上游引物為5′-CGAACATTTACTGAAGAAGATTG-3′，下游引物為5′-TTATAACTCATCTTTGACGAAAG-3′。PCR反應體系為：PrimeSTAR Max DNA聚合酶（TaKaRa公司）25 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，加ddH2O至50 μL。PCR反應條件為：98℃變性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)。

PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收純化，按照 pEASY-T3 Cloning Kit試劑盒（全式金公司）的說明書將其連接到T載體上，然后轉化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆，進行測序。

1.5 序列分析

運用SignalP4.1在線軟件（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測信號肽。運用ExPASy在線軟件（http：∥web.expasy.org/protparam/）分析編碼蛋白質的理化性質。在NCBI上，通過BLAST比對搜索同源基因，運用軟件DNAMAN進行氨基酸序列比對。運用MEGA 5.05軟件中的UPGMA法進行1 000次重復，構建進化樹。

1.6 熒光定量PCR

根據(jù)armet基因的序列設計定量引物，選取棉蚜的ACTIN和DIMT作為內參基因。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

熒光定量PCR反應使用Promega公司的GoTaq qPCR Master Mix熒光定量試劑盒，反應體系為：上下游引物各0.85 μL，qPCR MasterMix 10 μL，cDNA模板1.0 μL，最后加ddH2O補齊至20 μL，混勻，離心放入熒光定量PCR儀中擴增。反應程序為95℃變性2 min；接著進行40個循環(huán)，循環(huán)條件為95℃，15 s；60℃，1 min。每個樣品做3次技術重復。使用儀器為Eppendorf公司的Mastercycler ep realplex熒光定量PCR儀。反應結束后，根據(jù)Ct值，采用2-△△Ct法[11]進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 armet基因的克隆與序列分析

通過基因克隆的方法得到棉蚜的armet基因（GenBank登錄號為KY612465）（圖1）。其開放閱讀框全長為522 bp，編碼173個氨基酸，推測其蛋白質的分子質量為20.3 kD，等電點為6.62，具有8個保守的半胱氨酸位點，通過SignalP4.1預測其蛋白信號肽為21個氨基酸。在氨基酸序列的C-末端具有內質網(wǎng)滯留信號位點KDEL。

經(jīng)BLAST比對后，我們選取豌豆蚜Acyrthosiphon pisum（GenBank登錄號：XP_001949541.1）、麥雙尾蚜Diuraphis noxia（GenBank登錄號：XP_015365890.1）、中華按蚊Anopheles sinensis（GenBank登錄號：KFB4-0515.1）、家蠅Musca domestica（GenBank登錄號：XP_005185002.2）、家蠶Bombyx mori（GenBank登錄號：XP_004921981.1）armet基因編碼的氨基酸序列，與棉蚜的氨基酸序列進行同源性比對（圖2），其中豌豆蚜與棉蚜armet基因編碼的氨基酸序列同源性最高，為95%。可以看出該基因在昆蟲的進化過程中是高度保守的。

運用MEGA5.0軟件，采用UPGMA法對包括棉蚜在內的21種昆蟲的armet基因編碼的氨基酸序列進行系統(tǒng)進化樹的構建。從系統(tǒng)進化樹的分析結果可以看出，棉蚜的armet基因與蚜科昆蟲的同源性較高，而與其他昆蟲的同源性較低，分屬不同分支（圖3）。

2.2 armet基因的時間表達譜

2.2.1 黃瓜型棉蚜的armet基因的時間表達譜

運用熒光定量PCR檢測armet基因在黃瓜型棉蚜不同發(fā)育時期的相對表達量，結果顯示armet基因在黃瓜型棉蚜生長發(fā)育的各個時期均有表達，在若蚜的早期及中期（1～3齡）表達量相對較低，4齡表達量有所上升，但差異不顯著，1日齡成蚜與4齡若蚜基因的表達量相同，1日齡成蚜基因的表達量顯著降低，5日齡成蚜基因表達量再次上升（圖4）。

2.2.2 棉花型棉蚜的armet基因的時間表達譜

運用熒光定量PCR檢測armet基因在棉花型棉蚜不同發(fā)育時期的表達水平。在棉花型棉蚜的若蟲期，armet基因的表達量呈現(xiàn)出升高趨勢，但差異不顯著。在成蟲期，armet基因的表達量呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢。在棉花型棉蚜的整個發(fā)育時期，3日齡成蚜的表達量最低，顯著低于3、4齡若蚜和7日齡成蚜（圖5）。

2.3 寄主轉接后基因armet表達量的變化

2.3.1 黃瓜型棉蚜轉接西葫蘆前后基因armet表達量的變化

將黃瓜型棉蚜轉接到中間寄主西葫蘆上后，各代3齡若蚜armet基因的表達量均高于轉接前取食原寄主黃瓜的表達量。轉接后，基因armet的表達量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，其中轉接后第二代3齡若蚜表達量最高，但各代之間差異不顯著（圖6）。

將黃瓜型棉蚜轉接到中間寄主西葫蘆上后，armet基因的表達量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，其中第1、2、3代3日齡成蚜armet基因的表達量均高于轉接前的，且第2代3日齡成蚜armet基因的表達量顯著高于轉接前（圖7）。

2.3.2 棉花型棉蚜轉接西葫蘆前后基因armet表達量的變化

將棉花型棉蚜轉接到中間寄主西葫蘆上后，各代3齡若蚜armet基因的表達量均低于轉接前取食原寄主棉花的表達量。轉接后，基因armet的表達量呈現(xiàn)逐代降低趨勢，各代之間基因表達量差異不顯著（圖8）。

轉接到中間寄主西葫蘆上后的棉花型棉蚜，各代3日齡成蚜armet基因的表達量均高于轉接前取食原寄主棉花的表達量。轉接后，基因表達量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。轉接前后差異不顯著（圖9）。

3 討論

armet是蚜蟲唾液腺分泌蛋白，對蚜蟲的取食具有積極促進作用。本研究首次克隆了棉蚜的唾液蛋白相關基因armet的cDNA序列，并對該基因編碼的氨基酸序列進行了生物信息學分析。分析結果表明，該基因具有armet的典型特征，具有8個保守的半胱氨酸位點。armet基因編碼的氨基酸序列的N端具有一個由21個氨基酸組成的信號肽，這與唾液蛋白為外分泌蛋白的特征一致。在氨基酸序列的C端具有內質網(wǎng)滯留信號位點：KDEL，預測該基因參與內質網(wǎng)脅迫的相關反應。從系統(tǒng)進化樹的分析結果可以看出，棉蚜的armet基因與蚜科昆蟲的同源性較高，而與其他昆蟲在進化樹上分屬不同分支，說明在功能上已與其他昆蟲的armet產(chǎn)生了一定的分化。

昆蟲的寄主?；允侵咐ハx對特定寄主取食的專一性反應，即對不同種類的寄主植物和不同的取食部位的嗜食程度[12]。在昆蟲與寄主植物長期協(xié)同進化的過程中，昆蟲為了適應寄主植物和不斷變化的自然環(huán)境，會導致同一物種不同種群間適應性的改變，因而分化出不同的寄主?；?。雖然棉蚜為多食性昆蟲，但其對廣泛寄主長期的適應過程中，已形成了相對嚴格的寄主?；蚚13]。

通過熒光定量的方法對棉蚜的兩個寄主?；停好藁ㄐ兔扪梁忘S瓜型棉蚜中的armet基因的時間表達譜進行了研究，研究發(fā)現(xiàn)，armet基因在棉蚜的兩個寄主?；蜕L發(fā)育的各個時期均有表達，且表達量都具有先升高后降低再升高的變化趨勢。在若蟲的晚期及成蟲的初期armet基因的表達量出現(xiàn)一個峰值，這與赤擬谷盜中的研究結果一致[14]。說明armet基因在棉蚜的不同寄主?；椭械谋磉_量的變化趨勢是大體相同的，但具體到每個時期，又具有各自的特異性。

將棉花型棉蚜轉移到中間寄主西葫蘆上培養(yǎng)4代，轉接后，armet基因在各代3齡若蚜中的表達量具有先升高后降回轉接前表達量的趨勢，在3日齡成蚜中也有相同的趨勢。將黃瓜型棉蚜轉接到西葫蘆上后，armet基因無論在若蚜還是成蚜中的表達量都具有逐代降低的趨勢，但各代之間armet基因的表達量變化差異不顯著，與轉接寄主前變化差異也不顯著。說明armet基因在棉蚜的不同寄主專化型之間具有不同的變化趨勢，相同寄主?；椭性诔裳梁腿粞林械淖兓厔菹嗤?，但armet基因在寄主轉換過程中發(fā)揮的作用并不相同，這可能由于西葫蘆與黃瓜的親緣關系近于西葫蘆與棉花的親緣關系，轉接后承受的植物防御壓力也不同。

研究表明，蚜蟲中armet基因表達蛋白為鈣離子結合蛋白[9]，能夠阻斷響應鈣離子激活篩管閉合機制中的forisome蛋白形成締結而阻塞篩管缺口[10]，具有直接抑制植物防御反應的作用。本研究的結果表明，armet基因在各個生物型棉蚜原始寄主上整個生命活動過程中均起重要作用，在不同?；兔扪良闹鬓D接試驗的成、若蚜中發(fā)揮不同作用，為下一步研究armet基因在棉蚜中的具體作用和功能奠定了重要基礎。

參考文獻

[1] FENG Guolei， ZHAO Zhangwu， LI Mei， et al. Relationship between esterase activities of the cotton aphid （Aphis gossypii） and overwintering host plants [J]. Acta Entomologica Sinica， 2001， 44（3）：304310.

[2] 孟玲， 李保平. 新疆棉蚜生物型的研究[J]. 棉花學報， 2001， 13（1）：3035.

[3] 劉向東， 張立建， 張孝羲， 等. 棉蚜對寄主的選擇及寄主?；脱芯縖J]. 生態(tài)學報， 2002， 22（8）：12811285.

[4] 王麗， 張帥， 雒珺瑜， 等. 安陽棉蚜寄主?；图捌湫纬蓹C制初步分析[J]. 棉花學報， 2015， 27（4）：372378.

[5] 鄭彩玲， 劉向東， 翟保平. 棉花型和黃瓜型棉蚜（Aphis gossypii Glover）的寄主適應性及轉移通道[J]. 生態(tài)學報， 2007， 27（5）：18791886.

[6] 禹海鑫， 葉文豐， 孫民琴， 等. 植物與植食性昆蟲防御與反防御的三個層次[J]. 生態(tài)學雜志， 2015， 34（1）：256262.

[7] MILES P W. Aphid saliva [J]. Biological Reviews， 1999， 74（1）：4185.

[8] MIZOBUCHI N， HOSEKI J， KUBOTA H， et al. ARMET is a soluble ER protein induced by the unfolded protein response via ERSEII element[J]. Cell Structure & Function， 2007， 32（1）：4150.

[9] CAROLAN J C， CARAGEA D， REARDON K T， et al. Predicted effector molecules in the salivary secretome of the pea aphid （Acyrthosiphon pisum）： A dual transcriptomic/proteomic approach [J]. Journal of Proteome Research， 2011， 10（4）：15051518.

[10]WILL T， TJALLINGII W F， THNNESSEN A， et al. Molecular sabotage of plant defense by aphid saliva[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2007， 104（25）：1053610541.

[11]LIVAK K J， SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method [J]. Methods， 2001， 25（4）：402408.

[12]陳文勝，古德就，李衛(wèi)，等. 煙蚜寄主專化性的研究[J]. 華南農業(yè)大學學報，1997，18（4）：5458.

[13]劉向東，翟保平，張孝羲，等. 棉花型和黃瓜型棉蚜對寄主植物的適合度[J]. 生態(tài)學報，2004，24（6）：11991204.

[14]HEERMAN M C.Analysis of ESTs encoding pea aphid Acyrthosiphon pisum C002 & the effect of armet transcript knockdown in Tribolium castaneum [D]. USA：Kansas State University，2012.

（責任編輯：田 喆）