谷子穗頂端敗育突變體sipaa1的表型分析和基因定位

薛紅麗，楊軍軍，湯沙，智慧，王蕊，賈冠清，喬治軍，刁現(xiàn)民

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谷子穗頂端敗育突變體的表型分析和基因定位

薛紅麗1,2，楊軍軍2，湯沙2，智慧2，王蕊2，賈冠清2，喬治軍3，刁現(xiàn)民2

（1山西大學(xué)生物工程學(xué)院，太原 030006；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081；3山西農(nóng)業(yè)科學(xué)院品種資源研究所，太原 030031）

【目的】穗發(fā)育對(duì)于農(nóng)作物產(chǎn)量至關(guān)重要，而穗頂端敗育是谷子產(chǎn)量下降的重要原因之一。通過挖掘谷子穗頂端敗育的相關(guān)基因，探求谷子穗頂端發(fā)育的生物學(xué)通路，以期為谷子穗發(fā)育遺傳機(jī)理研究提供理論基礎(chǔ)?！痉椒ā坷没瘜W(xué)誘變劑甲基硫酸乙酯（ethyl methyl sulfonate，EMS）對(duì)野生型豫谷一號(hào)（Yugu1）進(jìn)行誘變，在其后代中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可以穩(wěn)定遺傳的穗頂端敗育的突變體，命名為同時(shí)對(duì)該突變體的農(nóng)藝性狀進(jìn)行鑒定。以突變體母本，SSR41父本構(gòu)建的F2定位群體為材料進(jìn)行遺傳分析及圖位克隆，確定基因所屬染色體以及在該染色體上的位置。對(duì)突變體和野生型Yugu1的BC1F2進(jìn)行高通量測(cè)序，挖掘定位區(qū)間內(nèi)的候選基因，根據(jù)候選基因在谷子不同組織部位表達(dá)量的差異，找出在穗部高表達(dá)的候選基因。對(duì)孕穗期的Yugu1和進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，尋找差異表達(dá)基因并分析差異表達(dá)基因富集的生物學(xué)通路?！窘Y(jié)果】與Yugu1相比，突變體的平均株高略有增高，增幅不顯著，葉長(zhǎng)、葉寬分別降低了10.66%和5.08%。突變體的表型變異主要集中在穗部，最突出的表現(xiàn)是穗頂端小花發(fā)育異常，谷穗長(zhǎng)和谷穗粗分別降低了11.36%和16.12%，單株穗重、谷碼數(shù)、單穗粒重及千粒重分別降低了30.02%、32.58%、30.55%和18.18%。通過對(duì)×SSR41的F2代群體中正常株與突變株的遺傳分析表明該突變?yōu)殡[性單基因控制。經(jīng)圖位克隆將突變基因定位于第1染色體Indel標(biāo)記1-9.23與1-9.333之間約100 kb的范圍內(nèi)。結(jié)合高通量測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)，在該定位區(qū)間篩選到6個(gè)在穗部高表達(dá)的候選基因。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，在突變體與野生型之間存在2 768個(gè)上調(diào)表達(dá)基因，507個(gè)下調(diào)表達(dá)基因，且定位區(qū)間內(nèi)有2個(gè)差異表達(dá)基因主要與激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、外界脅迫響應(yīng)、植物-病原互作等生物學(xué)通路有關(guān)?！窘Y(jié)論】谷子穗頂端敗育突變體由隱性單基因控制,突變基因位于第1染色體Indel標(biāo)記1-9.23與1-9.333之間，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與基因功能分析發(fā)現(xiàn)了2個(gè)在穗部高表達(dá)且與植物花器官發(fā)育及脅迫響應(yīng)密切相關(guān)的候選基因，候選基因可能通過對(duì)激素、脅迫響應(yīng)，以及細(xì)胞程序性死亡等相關(guān)通路調(diào)控谷子穗頂端敗育。

谷子；穗頂端敗育；表型分析；基因定位；轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

0 引言

【研究意義】伴隨著耕地面積的不斷減少和人口基數(shù)的不斷壯大，糧食短缺已成為制約中國(guó)生態(tài)與經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展的重要因素，在水資源嚴(yán)重缺乏的干旱與半干旱地區(qū)形勢(shì)更為嚴(yán)峻[1-3]，高產(chǎn)育種是解決當(dāng)前中國(guó)糧食短缺的重要途徑。谷子是起源于中國(guó)的古老栽培作物之一，同時(shí)也是中國(guó)北方重要的糧食作物[4-6]。谷子營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，具有適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)、耐旱、耐瘠薄等特點(diǎn)，是區(qū)域糧食安全的重要保障[6-7]。穗是禾本科作物最重要的生殖器官，也是作物產(chǎn)量的重要來源，因此，穗的發(fā)育狀況直接影響糧食作物產(chǎn)量，其中谷穗頂端敗育現(xiàn)象就是一個(gè)影響谷子產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】作物產(chǎn)量及其構(gòu)成因子是多基因控制的數(shù)量性狀，并受基因型和環(huán)境的共同影響。而穗是禾本科作物產(chǎn)量的形成器官，因此，穗頂端敗育是基因與環(huán)境互作的結(jié)果[8]。禾本科作物穗頂端敗育在玉米中研究較多，且多集中于穗敗育與環(huán)境因素以及激素水平、營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)等生理生化指標(biāo)的相互關(guān)系。相關(guān)研究表明，環(huán)境因素[9-10]、營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)[11]、內(nèi)源激素水平[12-13]等都會(huì)影響玉米果穗頂端敗育，但關(guān)于穗頂端敗育的遺傳規(guī)律和分子基礎(chǔ)的研究較少。孟昭東等[14]發(fā)現(xiàn)玉米中禿尖是質(zhì)量性狀，而禿尖程度是數(shù)量性狀。才源[15]發(fā)現(xiàn)玉米穗禿尖是由2對(duì)顯性基因控制的，穗禿尖長(zhǎng)短由2對(duì)主效基因和多個(gè)微效基因共同調(diào)控，通過SSR分子標(biāo)記技術(shù)，將控制玉米果穗敗育的基因定位在玉米第2和第7染色體。McSteen等[16]發(fā)現(xiàn)了一個(gè)葉腋分生組織缺陷型的突變體（），研究發(fā)現(xiàn)突變基因通過編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素的運(yùn)輸，最終導(dǎo)致沒有小穗和小花，只有裸露的花序軸的突變體性狀變異。Xiang等[17]發(fā)現(xiàn)一個(gè)穗發(fā)育異常的突變體，該突變體與具有一定的相似性，均表現(xiàn)為株高降低，第一級(jí)枝梗和第二級(jí)枝梗數(shù)減少，谷穗碼數(shù)大幅減少等，通過對(duì)該突變體進(jìn)行基因挖掘發(fā)現(xiàn)了調(diào)控突變體株高、穗型的，該基因在擬南芥過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系中的ABA敏感性以及耐旱性增強(qiáng)[18]。同時(shí)，刁現(xiàn)民研究組已經(jīng)在谷子中構(gòu)建了以全基因組測(cè)序品種Yugu1為遺傳背景且涵蓋了谷子株型、葉色、穗發(fā)育以及抗病性等多個(gè)農(nóng)藝性狀的突變體庫(kù)，如谷子矮稈突變體[19]、谷子黃綠葉突變體[20]、谷子穗發(fā)育異常突變體[21]和[22]、谷子耐旱耐ABA脅迫突變體[23]等，利用這些突變體成功克隆得到了谷子穗花粉發(fā)育相關(guān)基因、耐逆相關(guān)基因、葉色基因等。【本研究切入點(diǎn)】前人關(guān)于水稻、玉米中籽粒敗育的研究難以彌補(bǔ)谷子中該研究缺失的空白，同時(shí)玉米果穗、稻穗與谷穗有一定的差異，因此，挖掘谷子穗頂端敗育相關(guān)基因，探究基因是通過怎樣的生理機(jī)制調(diào)控穗頂端敗育。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究通過圖位克隆方法對(duì)突變基因進(jìn)行基因定位，尋找Yugu1和之間的差異表達(dá)基因以及相關(guān)生物學(xué)通路，找到可能調(diào)控穗頂端敗育的基因以及調(diào)控穗頂端敗育的相關(guān)生物學(xué)通路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

豫谷一號(hào)（Yugu1）是中國(guó)華北夏谷區(qū)主栽的綜合性狀優(yōu)良且最有影響的品種，具有豐產(chǎn)、抗病強(qiáng)、耐旱澇、對(duì)光溫不敏感、適應(yīng)性廣等特點(diǎn)，且Yugu1全基因組測(cè)序已經(jīng)完成[24]。利用EMS處理Yugu1，獲得穗頂端敗育突變體，命名為2013年夏，在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所順義試驗(yàn)站種植突變體（母本），分別與SSR41（父本）、Yugu1（父本）進(jìn)行雜交。2014年，對(duì)突變體與Yugu1雜交得到的F1代在北京順義和海南三亞連續(xù)回交兩代獲得BC1F1，2015年對(duì)BC1F1連續(xù)自交兩代獲得回交測(cè)序群體BC1F2。2014年，在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京順義試驗(yàn)站種植突變體與SSR41雜交得到的F1代，通過對(duì)穗部的觀察篩選出真雜種，再對(duì)真雜種植株進(jìn)行自交，得到F2代種子。2015年，在同一地點(diǎn)種植F2代群體，在抽穗后對(duì)穗頂端敗育植株的葉片分單株取樣，即為突變基因定位群體，并統(tǒng)計(jì)F2代群體中正常性狀和突變性狀植株的分離比例。所有試驗(yàn)群體的種植均采用條播法，田間管理按照國(guó)家谷子品種區(qū)試管理要求進(jìn)行。

1.2 定位群體葉片樣本的選取

對(duì)親本（、SSR41）和F2（×SSR41）群體中的隱性單株葉片進(jìn)行取樣，從中共收獲592株隱性穗頂端敗育突變體株。

1.3 sipaa1的初步定位

1.3.1 谷子葉片總基因組DNA的提取 采用CTAB法[25]提取谷子葉片基因組總DNA。

1.3.2 篩選多態(tài)性Indel標(biāo)記 利用ZHANG等[26]設(shè)計(jì)的谷子通用Indel 標(biāo)記，篩選在正常野生型Yugu1和突變體之間具有多態(tài)性的標(biāo)記。

1.3.3 混池構(gòu)建 從592份F2（×SSR41）隱性單株中選取30株穗頂端敗育突變體葉片，提取總基因組DNA并檢測(cè)其濃度，將其中濃度相近的DNA等量混合均勻（不少于25株），即為定位群體DNA混池。

1.3.4 突變基因初定位 以定位群體DNA混池模板和兩親本間有多態(tài)性的Indel標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳確定突變基因所處的染色體和上下游Indel標(biāo)記。在上下游Indel標(biāo)記范圍內(nèi)選取更多具有多態(tài)性的標(biāo)記，利用該標(biāo)記對(duì)592份隱性單株葉片DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，經(jīng)銀染顯色后判斷其帶型。通過對(duì)不同Indel標(biāo)記的重組事件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，確定目標(biāo)基因所在的精確位置。利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見電子附表1。

1.4 農(nóng)藝性狀調(diào)查分析

選取成熟后的野生型Yugu1和突變體各5株，調(diào)查其株高、穗長(zhǎng)、穗粗、每穗粒數(shù)、千粒重等重要農(nóng)藝性狀。利用Excel軟件整理野生型Yugu1和突變體不同農(nóng)藝性狀的測(cè)量數(shù)據(jù)，并進(jìn)行檢驗(yàn)顯著性分析從而計(jì)算出值。在此基礎(chǔ)上利用GraphPad Prism 6.07軟件進(jìn)行作圖。

1.5 突變體sipaa1的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

利用RNA提取試劑盒（invitrogen）對(duì)孕穗期野生型Yugu1與突變體的幼穗進(jìn)行RNA提取，每個(gè)樣品包含3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，并交由北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建和RNAseq測(cè)序工作。RNAseq數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析通過百邁克云平臺(tái)完成（www.biocloud.net）。RNAseq原始數(shù)據(jù)已經(jīng)上傳至歐洲生物信息研究所核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)（www.ebi.ac.uk/ena/submit），ID：PRJEB25199（ERP107094）。

2 結(jié)果

2.1 突變體sipaa1表型特征及主要農(nóng)藝性狀分析

與野生型相比，突變體的穗部頂端在穗發(fā)育早期就已出現(xiàn)了明顯的敗育現(xiàn)象，一二級(jí)枝梗數(shù)顯著銳減，花器官異常發(fā)育（圖1）。野生型株高139.00 cm，較突變體株高（146.80 cm）略有升高，差異不顯著（圖1-A、圖2-A）；野生型葉長(zhǎng)45.33 cm，較突變體（40.50 cm）降低10.66%（圖2-B)；野生型葉寬3.54 mm，較突變體（3.36 mm）降低了5.06%，差異不顯著（圖2-C）。對(duì)穗部主要性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，野生型穗長(zhǎng)為23.67 cm，較突變體（20.98 mm）略有降低，二者差異不顯著（圖1-B、圖2-E）；野生型Yugu1穗粗30.64 mm，較突變體（25.70 mm）降低了16.12%（圖1-B、圖2-F）；野生型谷碼數(shù)為104.20，較突變體（70.25）減少了32.58%（圖1-D、圖2-H）；野生型千粒重為2.64 g，較突變體（3.12 g）增加18.18%（圖2-J）。總之，與野生型Yugu1相比，突變體的變化主要集中在穗部性狀，如穗粗、碼數(shù)、千粒重等，降幅均在10% 以上，而株高、葉寬等性狀則沒有明顯差異。

A：成熟期的植株；B—E：成熟期的穗

A：株高；B：葉長(zhǎng)；C：葉寬；D：莖節(jié)數(shù)；E：穗長(zhǎng)；F：穗粗；G：?jiǎn)沃晁胫?；H：谷碼數(shù)；I：?jiǎn)嗡肓Ｖ?；J：千粒重

2.2 突變體的突變基因定位

突變體連續(xù)多代自交能夠保持穩(wěn)定遺傳，且×SSR41的子一代（F1）谷穗正常發(fā)育，子二代（F2）開始出現(xiàn)性狀分離。經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)2中出現(xiàn)1 783株正常株，592株突變株，其分離比符合3﹕1，經(jīng)卡方（χ2）檢驗(yàn)，χ2=0.0068＜3.841（χ20.05(1)=3.841），表明該突變由隱性單基因控制。

在谷子9條染色體上均勻選取了180對(duì)Indel引物，檢測(cè)其多態(tài)性，最終找到76個(gè)可用的Indel標(biāo)記。利用這76個(gè)標(biāo)記分別擴(kuò)增父本SSR41、母本和隱性混池DNA，發(fā)現(xiàn)在第1染色體上有一個(gè)與目標(biāo)基因緊密連鎖且在父母本間有顯著多態(tài)性的Indel標(biāo)記In1-8.77（圖3、表1）。進(jìn)一步在In1-8.77標(biāo)記的上下游尋找標(biāo)記，最后選出6個(gè)可用的多態(tài)性標(biāo)記，分別為In1-6.02、In1-7.35、In1-9.8、In1-10.143、In1-16.2和In1-24.0（表1）。用兩端的標(biāo)記In1-6.02、In1-24.0以及In1-8.77分別檢測(cè)收取的592株突變體葉片的DNA，根據(jù)電泳檢測(cè)結(jié)果，將突變基因定位于Indel 1-8.77與Indel 1-9.8之間。同時(shí)將其中顯示H帶（混池DNA既有父本帶又有母本帶）的單株挑選出來，共計(jì)80株。

為了進(jìn)一步縮小區(qū)間，在In1-8.77與In1-9.8之間設(shè)計(jì)20個(gè)Indel標(biāo)記，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其中7個(gè)標(biāo)記在父本（SSR41）和母本（）之間有多態(tài)性，分別為In1-9.11、Ind1-9.123、Inl1-9.23、In1-9.322、In1-9.333、In1-9.36和In1-9.42。以7對(duì)多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行PCR檢測(cè)上述80株隱性突變體單株的帶型，將突變基因定位在In1-9.23與In1-9.322之間約100 kb范圍內(nèi)（圖3和圖4）。繼續(xù)在該范圍內(nèi)設(shè)計(jì)多態(tài)性引物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在592株突變體F2隱性單株后代中沒有了交換株，難以再進(jìn)一步縮小區(qū)間，因此，最終定位目的基因在In1-9.23與In1-9.322區(qū)間內(nèi)。

♂：父本SSR41；♀：母本sipaa1；P：F2隱性單株混池

2.3 突變體sipaa1差異表達(dá)基因鑒定

對(duì)突變體與野生型Yugu1的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了差異表達(dá)基因（DEGs，differential expressed genes）鑒定（圖5）。通過統(tǒng)計(jì)Mapped Reads在基因組的CDS（編碼區(qū)）、5’UTR區(qū)（前導(dǎo)序列區(qū)）、3’UTR區(qū)（尾隨序列區(qū)）、Intron（內(nèi)含子區(qū)）、Intergenic（基因間區(qū)）等區(qū)域的分布分別為79%、3%、13%、2%和3%，大部分的Mapped Reads集中在基因的CDS區(qū)（圖5-A），測(cè)序結(jié)果符合轉(zhuǎn)錄組特征。圖5-B為突變體和Yugu1各3個(gè)生物學(xué)重復(fù)樣品間的相關(guān)性。相關(guān)系數(shù)的大小代表樣品之間表達(dá)模式的相似度。相似度越高（越接近1），樣品之間差異越??；同理，相似度越低（越接近0），樣品之間差異越大。野生型Yugu1 3個(gè)重復(fù)樣品WT.1、WT.2和WT.3間的相關(guān)系數(shù)約為0.92，突變體間相關(guān)系數(shù)約為0.96，說明突變體與野生型的生物學(xué)重復(fù)樣本之間具有較高的相關(guān)性；而突變體與野生型Yugu1的相關(guān)系數(shù)介于0.78—0.81，即突變體和野生型間的差異顯著，表明RNAseq的樣本選擇合理且試驗(yàn)數(shù)據(jù)可重復(fù)性及一致性好（圖5-C）。在突變體與野生型Yugu1之間存在3 275個(gè)差異基因，上調(diào)基因2 768個(gè)，上調(diào)基因遠(yuǎn)多于下調(diào)基因（507個(gè)），約為其5.5倍（圖5-D）。

表1 部分隱性單株Indel標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果

S：母本突變體帶型；H：同時(shí)具有母本突變體和父本SSR41帶型

S: The strip of mutant; H: The individuals with the strips of parents

2.4 差異表達(dá)基因的GO分類與富集分析

將突變體的RNAseq數(shù)據(jù)與谷子蛋白組進(jìn)行BLASTP比對(duì)，并對(duì)DEGs進(jìn)行功能GO注釋（圖6），根據(jù)GO注釋結(jié)果，將差異表達(dá)基因歸屬于細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物過程（biological process，BP）三大生物學(xué)通路，且各自的差異表達(dá)基因通路分別有142、299和1 092條。以校正后的-Value（FDR)進(jìn)行篩選（FDR≤0.001）發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞組分、分子功能和生物過程三類注釋得到的差異表達(dá)基因通路分別有15、5和99條。根據(jù)各通路差異基因的富集程度及其層級(jí)關(guān)系，從中選出了3個(gè)具有代表性的細(xì)胞組分注釋和15個(gè)具有代表性的生物過程的注釋。由圖中可以看出，差異基因主要富集在生物及非生物脅迫的響應(yīng)（response to water deprivation、defense response to bacterium）、激素響應(yīng)（response to jasmonic acid stimulus、salicylic acid biosynthetic process、response to abscisic acid stimulus、salicylic acid mediated signaling pathway）、細(xì)胞程序性死亡（regulation of programmed cell death）以及轉(zhuǎn)錄因子活性（transcription factor activity）這四類通路上。

圖4 穗頂端敗育突變基因sipaa1的定位

圖6 突變體sipaa1與野生型Yugu1差異基因GO功能富集分析

2.5 差異表達(dá)基因的KEGG分類與富集分析

利用KOBAS軟件對(duì)差異表達(dá)基因的KEGG代謝途徑進(jìn)行分析，選取其中富集程度最高的前20條pathway（圖7）。從圖中可以看出，差異表達(dá)基因（differential expresed genes，DEGs）大多存在于植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物-病原互作、苯丙素的生物合成、淀粉和蔗糖代謝四大通路中，分別有56、49、48和43個(gè)；其次主要集中于糖酵解和糖異生作用、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝、類胡蘿卜素的生物合成、苯丙氨酸代謝等，在次生物質(zhì)代謝通路，如類黃酮生物合成、泛醌和其他萜類醌生物合成、角質(zhì)，木栓質(zhì)和蠟質(zhì)生物合成等中的差異表達(dá)基因也有富集，而次生代謝產(chǎn)物對(duì)植物脅迫響應(yīng)和抵抗病原侵襲有重要作用。由此推斷，很可能是突變體中生物或非生物脅迫引發(fā)細(xì)胞程序化死亡，最終導(dǎo)致了穗頂端敗育的表型。

2.6 候選基因在谷子中的表達(dá)與分析

根據(jù)Phytozome的對(duì)比結(jié)果，在定位區(qū)間In1-9.23與In1-9.322之間約100 kb范圍內(nèi)確定了6個(gè)穗部高度表達(dá)的候選基因，對(duì)6個(gè)候選基因的基因位置、基因長(zhǎng)度、基因功能以及其在擬南芥和水稻中的同源基因進(jìn)行了注釋（表2）。同時(shí)，對(duì)6個(gè)候選基因在谷子不同組織部位（包括萌芽期的幼苗、成苗期的葉、莖、根、穗）中的表達(dá)量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)（圖8），結(jié)果差異顯著，而、與則表現(xiàn)為極顯著。

該圖表示差異基因富集程度最高的前20條pathway，橫軸表示富集的程度（用P-Value表示，該值越小表示富集程度越高），縱軸表示富集的KEGG Pathway Term。圓點(diǎn)大小表示該通路包含的差異基因數(shù)目

表2 候選基因功能分析

圖8 6個(gè)候選基因在植物不同組織部位的表達(dá)量

圖9 候選基因在Yugu1和sipaa1中的表達(dá)量

結(jié)合基因功能注釋、候選基因在谷子不同組織部位表達(dá)量以及候選基因在Yugu1和之間的表達(dá)差異結(jié)果進(jìn)行綜合分析發(fā)現(xiàn)，在穗部高表達(dá)時(shí)會(huì)生產(chǎn)較多過氧化物酶體，過氧化物酶體能夠?qū)⒐夂献饔玫母碑a(chǎn)物乙醇酸氧化為過氧化氫，大量過氧化氫在植物體內(nèi)累積導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡，表現(xiàn)出谷穗敗育的性狀。而是一種鈣結(jié)合EF手型家族蛋白基因，該基因編碼形成的蛋白質(zhì)多參與植物體內(nèi)脅迫反應(yīng)，例如鈣依賴蛋白激酶CDPKs即為典型的EF手型家族蛋白，有研究證實(shí)該蛋白參與多種光、干旱等環(huán)境脅迫。這與RNAseq功能富集結(jié)果相符合。因此，預(yù)測(cè)候選基因和可能與突變體穗頂端敗育的形成有關(guān)。

3 討論

3.1 穗頂端敗育突變體sipaa1的表型比較分析

谷子的穗是一個(gè)由三級(jí)分枝及其上著生的小穗構(gòu)成的頂生圓錐花序；每個(gè)小穗由兩朵小花組成，第一朵小花敗育，第二朵小花正常發(fā)育結(jié)實(shí)[27]。而突變體的穗頂端一級(jí)枝梗（分枝、谷碼）數(shù)顯著減少，第二小花不發(fā)育或發(fā)育不完全，導(dǎo)致谷碼數(shù)大幅減少，單穗粒重顯著降低。與谷子相比，玉米敗育的研究更為透徹。玉米敗育包括花敗育和粒敗育兩類?；〝∮〝∮ê臀词芫ǎ蚜∮ㄎ垂酀{型敗育粒和已灌漿型敗育粒[28]。按照該分類標(biāo)準(zhǔn)，突變體在幼穗分化早期就已出現(xiàn)了頂端穗敗育的表型，生長(zhǎng)錐發(fā)育異常導(dǎo)致穗頂端一級(jí)枝梗數(shù)大幅減少，小穗原基難以形成正常的小穗，因此，的敗育可歸為花不發(fā)育或者發(fā)育不全導(dǎo)致的穗頂端敗育。一般來說，幼穗分化、以及籽粒形成始于穗的中下部，以后由此處向上或向下同時(shí)進(jìn)行，最后在頂部結(jié)束。頂部的小花或受精胚常因外界環(huán)境條件不適或自身遺傳因素的影響造成養(yǎng)分供應(yīng)不足從而敗育，在谷穗頂端形成禿尖。

3.2 RNAseq分析表明突變體sipaa1中致變基因與脅迫響應(yīng)及細(xì)胞死亡有關(guān)

據(jù)報(bào)道，穗頂端敗育是遺傳因素和植物生理作用二者互作的結(jié)果。因此，突變體穗頂端敗育既是其自身遺傳作用的結(jié)果，也是外界環(huán)境作用的結(jié)果[8]。徐云姬等[13]發(fā)現(xiàn)玉米中脫落酸（ABA）、吲哚乙酸（IAA）等與籽粒發(fā)育呈正相關(guān)，赤霉素（GA3）為負(fù)相關(guān)。張秀梅等[29]發(fā)現(xiàn)BR（表油菜素內(nèi)酯）與玉米敗育呈顯著負(fù)相關(guān)。本研究中，GO功能富集中差異表達(dá)基因主要在JA和ABA等激素應(yīng)答通路中富集。同時(shí)，GO和KEGG分析表明差異表達(dá)基因富集于干旱脅迫或植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，這與前人的研究結(jié)果基本一致。也有研究指出，植物在干旱條件下代謝異常，導(dǎo)致植物中可利用的蔗糖含量減少，這種外部傷害會(huì)激活衰老基因?qū)е录?xì)胞程序化死亡，進(jìn)而導(dǎo)致籽粒敗育[30]。由此可以推斷，該突變體穗頂端敗育與脅迫響應(yīng)及激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)。高學(xué)曾等[31]發(fā)現(xiàn)與正常籽粒相比，敗育玉米籽粒中的過氧化氫酶及其同工酶表現(xiàn)出更高的活性。高素偉[32]通過DAB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過氧化氫的累積可能導(dǎo)致穗發(fā)育受阻，顯示小穗敗育可能是細(xì)胞程序性死亡的一種表現(xiàn)，本研究RNAseq的數(shù)據(jù)分析結(jié)果也符合這一猜想。因此，對(duì)過氧化氫與籽粒敗育關(guān)系的研究有待進(jìn)一步深入。

3.3 候選基因初步探索

在Indel1-9.23與Indel1-9.322之間約100 kb范圍的定位區(qū)間內(nèi)找到12個(gè)候選基因，通過分析候選基因在谷子不同組織部位的表達(dá)量差異，發(fā)現(xiàn)其中6個(gè)候選基因在突變體穗部的表達(dá)量明顯高于根、莖、葉等其他組織器官，分別為、、、、、。在數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)候選基因進(jìn)行查找發(fā)現(xiàn)，編碼過氧化物酶體的膜周邊或整合蛋白（peroxin-16，PEX16），該基因在擬南芥中的同源基因?yàn)榍乙驯豢寺?，其缺失突變體種胚中沒有正常的過氧化物酶體，導(dǎo)致種子油脂和蛋白質(zhì)含量將低，種子皺縮等現(xiàn)象，因此又被稱為（shrunken seed protein）[33-34]。為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（Cyclin dependent kinase 2，CDK2），在水稻中的同源基因是，推測(cè)其可能編碼細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶A2（cyclin-dependent kinase A-2，CDKA2），屬于細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶，該類基因控制細(xì)胞周期各個(gè)環(huán)節(jié)的起始，從而調(diào)控胚和胚乳的發(fā)育。是精氨酸/絲氨酸富集剪接因子4/5/6（splicing factor, arginine/serine-rich 4/5/6，SFRS4_5_6），參與RNA前體剪接過程；在擬南芥中的同源基因是，具有4個(gè)轉(zhuǎn)錄本、、和，該基因編碼RRM型結(jié)構(gòu)域的RNA結(jié)合家族蛋白（RRM/RBD/RNP RNA-binding family proteins，RRM RBPs），在植物開花時(shí)間轉(zhuǎn)換、花發(fā)育、ABA信號(hào)通路、逆境響應(yīng)、生物節(jié)律與染色質(zhì)修飾等生長(zhǎng)發(fā)育過程中起重要作用[35]。編碼EF手型鈣結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白（EF- HAND CALCIUM-BINDING DOMAIN CONTAINING PROTEIN），該基因在水稻中的同源基因是，屬于EF手型家族蛋白，該類基因參與植物體內(nèi)鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控植物的花發(fā)育（成花誘導(dǎo)、花芽分化和開花調(diào)控）、有性生殖（花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)）、逆境生理等[36]。該基因的功能與突變體頂端敗育的性狀可能有一定的相關(guān)性。在擬南芥中的同源基因是，該基因編碼分子伴侶J-蛋白，該類蛋白參與植物重力信號(hào)過程和對(duì)外界多種刺激的響應(yīng)[37]。編碼轉(zhuǎn)錄起始因子3J（translation initiation factor 3 subunit J，EIF3J），屬于轉(zhuǎn)錄起始因子家族，調(diào)節(jié)植物轉(zhuǎn)錄起始。綜合圖位克隆、RNAseq以及候選區(qū)間基因基因功能分析結(jié)果，和相關(guān)研究有待進(jìn)一步深入。

4 結(jié)論

與Yugu1相比，突變體穗頂端較早的出現(xiàn)了敗育的表型，一、二級(jí)枝梗數(shù)驟減，谷碼數(shù)、千粒重等穗部性狀有顯著差異。谷子穗頂端敗育由隱性單基因控制，并將控制穗敗育表型的候選基因定位在谷子第1染色體標(biāo)記In1-9.23與In1-9.322之間約100 kb范圍內(nèi)，在該定位區(qū)間內(nèi)的候選基因和參與了激素、干旱脅迫以及過氧化氫毒害等生理生化反應(yīng)，而外界脅迫和過氧化氫累積與細(xì)胞程序性死亡密切相關(guān)。因此，谷子頂端小穗敗育可能是細(xì)胞程序性死亡的一種典型表現(xiàn)。

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（責(zé)任編輯 李莉）

附表1 試驗(yàn)所用引物

Table S1 All primers involved in the article

引物名稱Primer name上游引物Forward primer (5′-3′)下游引物Reverse primer (5′-3′) In1-4.73GAGCAAGCCTCACGCCTCGGCATCAGTG In1-6.02TGGCATTTCTACACCTGGACCTCTATTCGTGCTGATT In1-7.35TAGGTAACAACGGGAAGTAGAAAGAGCAGGACCAT In1-8.77GCAGCCATCAGGCAAATCAGCCAGACAAGGAAGTAAAA In1-9.11GCGTGACGATAAATGAAACATAACACCTGCCATT In1-9.123GGGCTGTTGGTTTCTTGTCCTATTCCCACCGTTT In1-9.23TCCACGGTTGAAAGAGGCTGCACGAAGATGACAATAAA In1-9.322AGAACATACACCGAGGCTGGGAGGAGGTTGAAGAA In1-9.333CTAAAGCCTACTCCCTCTCTCCATATCATGCCTC In1-9.36ATTACGCAATCGTTCGGCCATAGGGAGCTGAGGG In1-9.42GGTTTATTTGTGCTGCCTGAAGAAGTGGCGATGGTGGG In1-9.80CGAATAGAATGCCCTCACAACGCAAACACGATAAGAC In1-10.143CAGAGTTTGGTTTGGGTGGATTGTCGTCGTCTTCG In1-16.2GCTAAACGGCAAGATACCCGTCACATCG In1-20.60CTTCACGGACACCTCATGGTAGAGTAGCAGGTAGGCAAT In1-24.0TATGGCATTTATTAGGAGTCTGTCTGAACATTGCGTAT

Morphological Characterization and Gene Mapping of a Panicle Apical Abortion Mutant () in Foxtail Millet

XUE Hongli1,2, YANG Junjun2, TANG Sha2, ZHI Hui2, WANG Rui2, JIA Guanqing2, QIAO Zhijun3, DIAO Xianmin2

(1College of Biological Engineering, Shanxi University, Taiyuan 030006;2Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081;3Institute of Crop Germplasm Resources, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030031)

【Objective】Panicle development determines crop yield, and panicle apical abortion is one of the major limitation that affects the grain yield of foxtail millet. Our study explored the genes and biological pathways related to panicle apical abortion in foxtail millet, which provided a theoretical basis for the genetic mechanism of foxtail millet panicle development.【Method】A foxtail millet panicle apical abortion mutant, induced from Yugu1 by EMS treatment, was genetically identified. Agronomic traits of the mutant were investigated. The F2segregating population of× SSR41 was used for gene mapping. Based on differential expressed levels of candidate genes in five different tissues of foxtail millet, some genes highly expressed in the panicle was identified. Transcriptome sequencing of Yugu1 andyoung panicle at booting stage was conducted to find differential expressed genes and to analyze the biological pathways.【Result】The mutant exhibited thinner panicle, shorter leaf, less spikelets per panicle, lower spikelet numbers, as well as lower 1000-grain weight, compared with wildtype Yugu1. The agronomic traits of mutants showed that mutant leaf length, leaf width, panicle length, panicle diameter, panicle weight per plant, spikelet number per panicle, grain weight per spikelet and 1000-grain weight were decreased 10.66%, 5.08%, 11.36%, 16.12%, 30.02%, 32.58%, 30.55%, 18.18%, respectively. Genetic analysis showed that segregating ratio of wild type to mutant plants were 3:1 in×SSR41 F2generation, suggesting that the panicle apical abortion trait ofwas controlled by a single recessive nuclear gene. By map-based cloning, the candidate gene was mapped into a region between Indel markers In1-9.23 and In1-9.333 in chromosome 1, which contains a 100 kb interval. Combined with transcriptome sequencing, some candidate genes were found. Six candidate genes highly expressed in the panicle were further identified. Moreover, transcriptome sequencing showed that there were 2 768 up-regulated genes and 507 down-regulated genes between mutant and wild type. The differential expressed genes were mainly enriched in hormone signal transduction, external stress responses, plant-pathogen interaction.【Conclusion】Casual gene was limited into a 100 kb region between Indel markers 1-9.23 and 1-9.333 on chromosome 1 of foxtail millet. Combined transcriptome sequencing and gene function analysis, we identified two candidate genes that are highly expressed in panicle, and reported to participate in plant floral development and stress responses. Panicle apical abortion may be regulated by hormone, stress responses, and programmed cell death pathway.

; panicle apical abortion; phenotypic analysis; gene mapping; RNAseq

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.002

2018-02-08；

2018-03-06

國(guó)家自然科學(xué)基金（31501324）、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（Y2016XT05）、國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS07-13.5-A02）、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程雜糧團(tuán)隊(duì)、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)科英才特資計(jì)劃

薛紅麗，E-mail：1729284709@qq.com。

喬治軍，E-mail：nkypzs@126.com。通信作者刁現(xiàn)民，E-mail：diaoxianmin@caas.cn