水稻短穗小粒突變體sps1的鑒定與基因精細定位

謝佳，張孝波，陶怡然，熊毓貞，周倩，孫瑩，楊正林，鐘秉強，桑賢春

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水稻短穗小粒突變體的鑒定與基因精細定位

謝佳，張孝波，陶怡然，熊毓貞，周倩，孫瑩，楊正林，鐘秉強，桑賢春

（西南大學水稻研究所/轉基因植物與安全控制重慶市重點實驗室，重慶 400715）

【目的】通過對一個水稻短穗小粒突變體的鑒定與基因精細定位，為水稻等禾本科作物的籽粒發(fā)育及分子改良奠定基礎?！痉椒ā吭谒綞MS誘變體庫中鑒定到一個短穗小粒突變體，暫命名為（）。成熟期觀察野生型和的形態(tài)變化，考察株高、節(jié)間長、穗實粒數、結實率和千粒重等農藝性狀；對野生型和籽粒外稃內外表皮中部進行掃描電鏡觀察，并利用石蠟切片進一步分析野生型和籽粒的形態(tài)變化；配制縉恢10號/雜交組合進行遺傳分析，并利用其F2群體進行基因精細定位；對野生型和兩葉一心期的葉鞘進行油菜素內酯（brassinolide，BR）敏感性試驗；抽穗期分析在水稻根、莖、葉、鞘和穗中的表達，并對籽粒發(fā)育相關基因和BR相關基因進行qPCR分析?！窘Y果】穗和倒1、2、3的節(jié)間長度均極顯著短于野生型，導致株高半矮化；此外，穗枝梗數、結實率和千粒重也顯著降低；掃描電鏡觀察發(fā)現外稃中部內外表皮細胞長度極顯著小于野生型，寬度則極顯著變大，石蠟切片觀察進一步證實了籽粒寬短是由細胞變短、變寬造成的；籽粒發(fā)育相關基因qPCR分析發(fā)現，部分通過調控細胞分裂和擴展進而影響水稻籽粒發(fā)育的基因表達量發(fā)生了顯著變化，在中，、、和的表達量顯著上調，和顯著下調；選取符合3﹕1分離比例的F2代分離群體中的突變單株進行基因定位，最終將調控基因精細定位在第7染色體上標記sps1-3和sps1-2之間134 kb的物理范圍內，包含19個注釋基因；經測序，與野生型相比，發(fā)現中的在編碼區(qū)有一個A-T的堿基替換，致使編碼的賴氨酸變成了終止密碼子，導致蛋白翻譯提前終止，初步確定為候選基因。qPCR分析發(fā)現在水稻的根、莖、葉、鞘和穗中均有表達，且在莖稈中的表達量最高；生物信息學分析發(fā)現，是的一個新等位基因。對外源BR的敏感性降低，BR鈍感基因的表達極顯著下調；推測可能通過BR信號傳導途徑調控水稻籽粒和株型的發(fā)育?！窘Y論】是一個水稻短穗小粒突變體，編碼一個表達蛋白，是的新等位基因，通過BR信號傳導途徑調控水稻籽粒和株型的發(fā)育。

水稻(L.);短穗;小籽粒;基因定位

0 引言

【研究意義】穗粒數、千粒重和實粒數決定了水稻產量，對于水稻增產有重要意義。穗長和枝梗數影響穗粒數，其中穗長會直接影響穗粒數，一般來說，長穗的穗粒數多于短穗，穗長的研究為水稻增產提供了一個新的方向；同時，作為影響水稻產量的三大因素之一，籽粒是遺傳育種中最重要的選擇性狀。因此，水稻穗發(fā)育和籽粒的研究至關重要?！厩叭搜芯窟M展】Li等[1]證明已克隆的與穗長相關的基因編碼一個屬于多肽轉運蛋白家族的轉運蛋白，決定水稻穗長。Zhu等[2]證明是驅動蛋白13亞家族的成員，在發(fā)育的器官中高表達，調控細胞伸長與水稻穎殼及其他器官如穗長、節(jié)間等的長度。編碼一個未知功能的植物特有蛋白，穗長變短是穗發(fā)育過程中細胞增殖減少所致[3]。目前，在水稻中已克隆了多個籽粒發(fā)育相關的基因。其中與籽粒細胞分裂和擴展相關基因有[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]、[14]和[15]等；與籽粒粒長相關的基因有[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]、[22]和[23]等。這些基因的功能缺失突變體大多表現籽粒大小的變化，其中編碼TONNEAU1募集基序蛋白，基因表達上調促進谷粒細胞縱向分裂、減少橫向分裂，從而使谷粒變得細長[6]。編碼一個包含SBP結構域的轉錄因子，能夠直接與啟動子結合并抑制它的表達，進而調控水稻粒寬[8]。是籽粒大小發(fā)育的正向調控因子，過表達通過占據OsBAK1-7的胞外富亮氨酸重復（LRR）結構域，競爭性地抑制OsBAK1-7和OsMSBP1間的互作，進而阻止OsBAK1-7通過與OsMSBP1互作而產生的胞吞作用[13]。水稻籽粒發(fā)育是一個復雜的生物學過程，除相關基因直接調控外，激素等其他因素也影響籽粒的發(fā)育。油菜素內酯是控制葉片傾角的重要植物激素，也影響株型和籽粒大小[24]。如，編碼GTP結合蛋白α亞基，參與BR的信號傳導，功能缺失突變體降低了對外源24-eBL的敏感性，表現植株半矮化、籽粒小而圓等特征[25]。此外，植物G蛋白復合體能通過調節(jié)異源三聚體G蛋白復合體的活性調控氮信號，這提供了基于環(huán)境可持續(xù)性增加水稻谷粒產量的新途徑[26]。Sakamoto等[27]發(fā)現生長素（auxin，IAA）處理增加了的表達，進而推測生長素可能通過調節(jié)BR受體表達水平影響水稻對BR的感知，進而調控水稻株型和籽粒的發(fā)育?！颈狙芯壳腥朦c】作為的一個新等位突變體，主要表現水稻株高變矮、穗長變短、籽粒變小和枝梗數目減少。前人對的研究增加了對穗發(fā)育的認識，而的探索則有利于調控水稻籽粒發(fā)育的認知，在水稻育種中有著重要的應用價值。【擬解決的關鍵問題】本研究通過對突變體進行形態(tài)鑒定、細胞學觀察、基因精細定位和qPCR分析等研究，為的功能研究提供了一個新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

突變體來源于秈型水稻保持系西大1B的EMS誘變，經過多世代連續(xù)種植，均穩(wěn)定遺傳。配制縉恢10號/雜交組合，對F1和F2群體進行遺傳分析，2016年7月選取F2隱性群體進行基因定位。所有材料均種植于西南大學水稻研究所歇馬基地。

1.2 農藝性狀鑒定

田間種植和西大1B，成熟期測量中間10株的株高、穗長、穗粒數、穗一次枝梗數、穗二次枝梗數和千粒重等主要農藝性狀。

1.3 細胞學觀察

抽穗期進行石蠟切片觀察，即取發(fā)育完整的和西大1B小花，FAA固定后，依次用一定濃度的乙醇脫水，然后二甲苯透明、石蠟包埋、切片和番紅固綠染色，最后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照；成熟期進行掃描電鏡觀察，分別把和野生型穎殼的內外稃表皮中部置于掃描電鏡下，-20℃冷凍觀察、照相并統(tǒng)計。

1.4 油菜素內酯敏感性試驗

將野生型和的種子催芽，露白后移到MS培養(yǎng)基上生長至兩葉1心期。以水稻第2葉葉舌為中心，在葉片和葉鞘各1 cm處截取，測量其葉夾角后放置于不同濃度梯度的24-eBL內，離體培養(yǎng)3 d后再次測量葉夾角，照相并統(tǒng)計分析。

1.5 基因定位和候選基因預測

分別取F2代分離群體中正常和突變單株各10株的葉片，等量混合后構成正常池和突變池，利用改良后的CTAB法提取親本和基因池的DNA，進行連鎖引物的篩選。選取符合3﹕1分離比例的F2代分離群體中的突變單株，采用堿煮法[28]提取基因組DNA，進行基因定位。PCR總體系為25 μL，含2.5 μL 10×PCR buffer、1.3 μL 25 mmol·L-1MgCl2、1 μL 2.5 mmol·L-1dNTPs、16 μL ddH2O、2 μL 10 μmol·L-1引物、2 μL模板DNA和0.2 μL 5 U·μL-1Taq酶。PCR程序為94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產物經10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，快速銀染后觀察。

根據Gramene和NCBI網站獲得的DNA序列信息，設計引物擴增野生型和突變體的預測基因。擴增產物回收后測序，序列拼接和比對在Vector NTI Advance 10.1上進行，BLAST在Gramene和NCBI上進行。

1.6 基因表達分析

突變體和野生型BR敏感性試驗處理過的材料以及抽穗期發(fā)育至3—5 cm的小穗，分別放在無核酸酶的2 mL離心管后速凍于液氮中，參照天根生化科技（北京）有限公司提供的試劑盒提取RNA，反轉錄成cDNA后采用Takara SYBR Green熒光染料進行qPCR定量分析。

2 結果

2.1 sps1的形態(tài)鑒定

田間種植條件下，成熟期株高變矮，由野生型的91.62 cm變?yōu)?7.81 cm，縮短了25.99%，進一步研究發(fā)現倒1節(jié)和倒2節(jié)節(jié)間長度顯著變短；成熟期的穗長為16.74 cm，極顯著低于野生型的27.08 cm，縮短了38.18%；一次枝梗數目無顯著差異，二次枝梗數目較野生型顯著減少，結實率由野生型的88.58%下降到突變體的66.01%（圖1）。

2.2 sps1籽粒變短變寬

的千粒重為18.01 g，顯著低于野生型的20.92 g。進一步分析發(fā)現，的粒長8.55 mm極顯著短于野生型的10.03 mm，粒寬2.95 mm則極顯著大于野生型的2.43 mm，籽粒厚度無變化（圖2）。

細胞學觀察和野生型外稃的內外表皮中部，結果發(fā)現，外稃外表皮細胞長度50.70 μm，顯著短于野生型的62.25 μm，縮短了18.55%，內表皮細胞長度80.43 μm，顯著短于野生型的91.30 μm，縮短了10.81%；外稃外表皮細胞寬度94.93 μm，顯著寬于野生型的78.87 μm，上升了16.92%，內表皮細胞寬度56.52 μm，顯著寬于野生型的40.22 μm，上升了28.84%。因此，認為籽粒變短變寬是由于細胞大小發(fā)生改變引起。石蠟切片分析進一步驗證了細胞變短變寬是導致寬短粒的主要原因（圖3）。

A：野生型和sps1植株；B：野生型和sps1的倒1—倒4節(jié)間（從右至左分別為倒1節(jié)、倒2節(jié)、倒3節(jié)、倒4節(jié)）；C：野生型和sps1的穗；D：野生型和sps1的株高、倒1—倒3節(jié)間長統(tǒng)計（PH代表株高，1st、2nd、3rd分別代表倒1節(jié)、倒2節(jié)、倒3節(jié)節(jié)間長度）；E：野生型和sps1的穗長（PL代表植株穗長）；F：野生型和sps1的一次枝梗、二次枝梗數目（PBN代表一次枝梗，SBN代表二次枝梗）；G：野生型和sps1的結實率。A中，Bar=25.00 cm；B中，Bar=10.00 cm；C中，Bar=20.00 cm；*：在P=0.05水平差異顯著；**：在P=0.01水平差異顯著。下同

A：野生型和sps1籽粒，Bar=5.00 mm；B：野生型和sps1籽粒的千粒重統(tǒng)計；C：野生型和sps1籽粒的粒長統(tǒng)計；D：野生型和sps1籽粒的粒寬統(tǒng)計；E：野生型和sps1籽粒的粒厚統(tǒng)計A: The grain of WT and sps1; B: Comparison of the 1000-grain weight of the WT and the sps1; C: Comparison of the grain length of the WT and the sps1; D: Comparison of the grain width of the WT and the sps1; E: Comparison of the grain thickness of the WT and the sps1

A：野生型籽粒石蠟切片；B：突變體sps1籽粒石蠟切片；C：野生型外稃的內表皮中部；D：突變體sps1外稃的內表皮中部；E：野生型外稃的外表皮中部；F：突變體sps1外稃的外表皮中部；G：野生型和sps1籽粒外稃的內、外表皮中部細胞長度統(tǒng)計圖；H：野生型和sps1籽粒外稃的內、外表皮細胞寬度統(tǒng)計圖。A—D，Bar=200.00 μm，E—F，Bar=100.00 μm A: cross section of grain in WT; B: cross section of grain in sps1; C: SEM images of the grain endodermis of WT; D: SEM images of the grain endodermis of sps1; E: SEM images of the grain exocuticle of WT; F: SEM images of the grain exocuticle of sps1; G: Comparison of the cell length of the WT and the sps1; D: Comparison of the cell width of the WT and the sps1. A-D, Bar=200.00 μm; E-F, Bar=100.00 μm

2.3 籽粒發(fā)育調控基因的qPCR分析

籽粒細胞分裂和擴展相關基因的qPCR分析發(fā)現，、和在野生型和突變體中的表達量很低，幾乎不表達，表達量相對較低；、、、、和的表達量則相對較高。與野生型相比，和在中的表達量顯著上調，和的表達量極顯著上調，而的表達量則極顯著下調（圖4-A）。

粒長發(fā)育相關基因中，、、、、在野生型和突變體中幾乎不表達，、和表達量則相對較高。進一步分析發(fā)現，籽粒負調控因子和在突變體中的表達水平極顯著高于其在野生型中的表達，的表達量則出現下調現象（圖4-B）。

2.4 基因的精細定位

利用縉恢10號和西大1B之間的多態(tài)性標記，將初步限定在水稻第7染色體ZTQ66和RM5455之間，遺傳距離分別為23.60和24.61 cM。在二者之間開發(fā)新的多態(tài)性標記進一步分析338株縉恢10號/的F2隱性單株，結果發(fā)現，多態(tài)性標記RM21906、sps1-1、sps1-3、sps1-2及RM21999處的交換單株分別有6、4、3、2和9個，且前3個標記的交換單株與后2個標記的交換單株不同，從而最終將定位在sps1-3和sps1-2之間134 kb的物理范圍內。定位區(qū)間共有19個注釋基因，其中11個編碼假定蛋白，5個編碼表達蛋白，其余3個分別編碼DUF581蛋白、FYVE類鋅指蛋白和AP2轉錄因子。測序發(fā)現中表達蛋白編碼基因在外顯子區(qū)域發(fā)生了一個A-T的堿基替換，造成編碼的賴氨酸變成了終止密碼子，初步確定為的候選基因（圖5-A）。生物信息學分析發(fā)現即為，因此，是的一個新等位突變體。

為了解/的表達模式，抽穗期取植株的根、莖、葉、鞘和穗進行qPCR分析，結果發(fā)現/在植株各個器官中均有表達，并在莖中表達量最高、葉片中的表達量最低（圖5-B）。

2.5 突變體sps1對外源BR的敏感性降低

成熟期觀察野生型和突變體，發(fā)現的倒1葉和倒3葉葉夾角分別為7.41°和28.62°，極顯著低于野生型的19.02°和44.15°（圖6-A）。利用不同濃度的24-eBL處理野生型和，隨著外源24-eBL濃度的增加，野生型的葉夾角增加幅度不斷增大，而的葉夾角在0.01 μmol·L-1時變化較小，在0.10 μmol·L-1濃度時，角度差增加較快，在0.10 μmol·L-1以上濃度時角度差增加幅度極小。葉夾角變化表明突變體對低濃度BR的敏感性降低（圖6-B和圖6-C）。

A：籽粒相關的細胞分裂和擴展基因在WT和sps1中的表達模式；B：籽粒粒長相關的基因在WT和sps1中的表達模式

A：SPS1/DEP2在水稻第7染色體上的分子定位；B：SPS1/DEP2在野生型中的表達模式

qPCR結果分析發(fā)現，BR相關基因、、和在野生型和突變體中表達量較低，且在二者之間表達無差異；在野生型和突變體中則表達量較高，且在突變體中表達量下調（圖6-D）。

A：野生型和突變體三片功能葉的葉夾角；B：BR敏感性試驗；C：不同濃度的外源BR處理下野生型和突變體sps1的葉夾角的角度差；D：BR相關基因在WT和sps1中的表達模式

3 討論

本文鑒定到一個短穗小籽粒突變體，精細定位和候選基因測序發(fā)現是的新等位突變體。目前，已鑒定了多個等位突變體。在第6外顯子上有31個堿基的缺失，的第2內含子上有一個G-A的替換，改變了內含子的位置編輯，進而出現移碼；在第7外顯子上缺失了38 bp，在第3內含子上發(fā)生了G-T替換，則在終止密碼子上出現A-G的替換；、和均來自粳稻，籽粒表現為小圓粒[3,29]。和則來自秈稻，前者調控基因在第7外顯子上有一個G-T的堿基替換，導致翻譯提前終止，突變體籽粒為小圓粒，后者則在編碼區(qū)出現單堿基缺失，導致移碼突變，籽粒呈橢圓形[30]。與已報道的等位突變體相比，來自于秈稻育種材料西大1B的EMS誘變，其典型特征是穗直立，籽粒短寬導致千粒重略有下降，此外，還表現植株適度矮化、株型緊湊等特點，是一個良好的水稻育種材料。

細胞變短、變寬是導致籽粒寬短的主要原因，這與粒型發(fā)育一般與細胞分裂和擴張有關的結論相一致。目前，已經定位克隆了多個籽粒發(fā)育調控基因或QTLs[31-33]，編碼BAHD酰基轉移酶，是維持油菜素內酯平衡的一個重要調控因子，功能缺失突變體中穎殼細胞增長導致細長粒表型[11]；編碼一個DUF640蛋白，通過調控細胞分裂和擴展基因的表達調控籽粒的發(fā)育，功能缺失突變體內外穎的外薄壁細胞變小且數量減少，進而導致籽粒的長、厚和粒重減少[12,34]；是一個調控粒長和粒寬的主要QTL，超表達能增加籽?？v向細胞分裂并減少橫向細胞分裂，進而導致谷粒細長[6,35]。qPCR分析發(fā)現，和在中表達極顯著上調，籽粒寬短的表型相一致。

[25]、[27]和[36]是BR信號傳導途徑中的關鍵基因，[37]和[38]則是BR合成相關基因，同時這些基因在水稻籽粒發(fā)育中也扮演著重要的角色。qPCR分析發(fā)現，只有在中表達極顯著下降。編碼G蛋白a亞基，功能缺失突變體表現為矮化桿粗、葉片寬短直立、葉色暗綠、直立穗和小圓粒等特征[25,39]，這與粳稻等位突變體的表型十分類似；同時我們發(fā)現，降低了對油菜素內酯的敏感性，而本研究中的也降低了對油菜素內酯的敏感性。這些結果暗示/可能通過D1介導的BR信號傳導途徑調控水稻穗粒的發(fā)育。

作為的一個新等位基因，為的研究提供了新的思路和方向，同時對水稻分子設計育種及其他禾谷類作物的分子改良也有一定的指導意義。

4 結論

EMS誘變得到一個短穗小粒突變體，株高極顯著降低，穗變短且二次枝梗數極顯著減少，籽粒變短變寬，千粒重顯著降低，細胞變短變寬是造成寬短粒的主要原因。利用縉恢10號/雜交組合的F2群體最終將定位在第7染色體sps1-3和sps1-2之間134 kb的物理范圍內，包含19個注釋基因，測序發(fā)現是的一個新等位突變體，調控基因在編碼區(qū)發(fā)生了一個A-T堿基替換，造成編碼的氨基酸變成了終止密碼子，導致翻譯提前終止。對低濃度的24-eBL敏感性降低，BR信號傳導途徑關鍵基因的表達量顯著下調，暗示/可能通過BR信號傳導途徑調控水稻籽粒和株型的發(fā)育。

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（責任編輯 李莉）

Identification and Gene Mapping of a Shorten Panicle and Seed MutantL.)

XIE Jia, ZHANG XiaoBo, TAO YiRan, XIONG YuZhen, ZHOU Qian, SUN Ying, YANG ZhengLin, ZHONG BingQiang, SANG XianChun

(Institute of Rice Research, Southwest University/Chongqing Key Laboratory of Application and Safety Control of Genetically Modified Crops, Chongqing 400715)

【Objective】Identification and gene mapping of a shorten panicle and seed mutant is significant for rice functional genomics research and molecular breeding. 【Method】A shorten panicle and seed mutant () was identified from the EMS-induced library. At the maturity stage, agronomic traits such as plant height, panicle length, seed number per panicle, filled grain number per panicle, seedsetting rate and 1000-seeds weight were measured. Scanning electron microscopy was carried out to analyze the inner and outer epidermis between the wild type andand the grain morphology of wild type andwas observed by paraffin section. Thewas crossed with Jinhui 10, and the F1and F2generations were used for genetic analysis. Sensitivity test of brassinolide (BR) was carried out on sheath of wild-type and. The root, stem, leaf, sheath and spike were collected, and the genes associated with grain development and the genes associated with BR were analyzed in qPCR.【Result】Thewas dwarf in all phases of plant development, and the panicle length, the first, second and third internodes were significantly shorter than those of the wild type. In addition, there were significant decrease in the branch number, seed-setting rate and the 1000-seeds weight in themutant. The results of scanning electron microscopy showed that when compared with the wild type, the inside and outside the central lemma of epidermal cells ofwas shorter and broader, and paraffin section showed that the smaller seed size ofwas caused by reduced cell length, increased cell width and cell number. There were significant changes in the expression of genes regulating rice grain size by controlling cell extension and division, such as the,,andsignificantly increased, theandsignificant reduced. Choose the single mutant strains in F2generation of Jinhui10/accord with the 3:1 separation ratio to conduct gene localization. Andwas finally mapped on chromosome 7 with a 134 kb physical distance between markers sps1-3 and sps1-2. There are 19 annotated genes in the fine mapping region. Sequencing indicated that a single nucleotide substitution from A to T occurred in, and a lysine was changed into termination codon, and then leaded to protein coding early termination in. The root, stem, leaf, sheath and spike of the wild type andwere analyzed by qPCR, and the results showed that the target gene was expressed in each organ of the plant, and the expression was highest in the plant stem. Bioinformatics analysis showed thatwas a new allele of. The sensitivity ofto the exogenous BR was reduced, and the expression ofwas significantly reduced. It is speculated that/may regulate the development of rice grain and plants by BR signaling pathway.【Conclusion】was a shorten panicle and seed mutant.encoded an expression protein and is a new allele of, which regulated the development of rice grain and plant type by BR signaling pathway.

rice (L.); shorten panicle; small grain; gene mapping

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.001

2017-12-26；

2018-02-08

國家重點研發(fā)計劃（2016YFD0100501）、重慶市社會事業(yè)與民生保障科技創(chuàng)新專項（cstc2017shms-xdny80057）、國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃（201710635043）、中央高校基本科研業(yè)務費（XDJK2015C118）

謝佳，E-mail：1219424208@qq.com。

桑賢春，E-mail：sangxianchun@163.com