普通菜豆中煙草水楊酸結(jié)合蛋白2同源基因的鑒定及表達(dá)特征分析

薛仁風(fēng) 王 利 豐 明 葛維德,*

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普通菜豆中煙草水楊酸結(jié)合蛋白2同源基因的鑒定及表達(dá)特征分析

薛仁風(fēng)1,**王 利2,**豐 明1葛維德1,*

1遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所, 遼寧沈陽 110161;2農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)生態(tài)與資源保護(hù)總站, 北京 100125

水楊酸(salicylic acid, SA)能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性反應(yīng), 而水楊酸結(jié)合蛋白2 (salicylic acid binding protein 2, SABP2)是植物細(xì)胞內(nèi)調(diào)控水楊酸水平的重要酯酶。本研究利用生物信息學(xué)方法在普通菜豆中搜索到7個(gè)煙草水楊酸結(jié)合蛋白2的同源基因, 命名為。分別在2個(gè)菜豆感病品種(白刀豆和BRB130)和2個(gè)抗病品種(黑蕓豆和260205)中接種尖鐮孢菌FOP-DM01菌株(f. sp.isolate, FOP-DM01)后, 檢測寄主根組織中水解水楊酰甲酯(methyl salicylate, MeSA)活性和游離SA含量的變化, 并利用熒光定量PCR技術(shù)分析7個(gè)基因表達(dá)量變化。結(jié)果表明,、、、和的轉(zhuǎn)錄表達(dá)受FOP-DM01菌株誘導(dǎo)均呈現(xiàn)不同程度的升高, 其中黑蕓豆中基因和260205中基因表達(dá)量變化最顯著, 接種3 d后分別升高至0 d表達(dá)量的7.6倍和5.6倍。此外, 黑蕓豆和260205根中水楊酰甲酯酯酶(methyl salicylate esterase, MES)活性顯著提升, 游離SA含量也相應(yīng)升高, 激活寄主內(nèi)SA介導(dǎo)的相關(guān)防御反應(yīng)。本研究結(jié)果可以為普通菜豆鐮孢菌枯萎病抗病分子育種和抗病機(jī)理研究提供理論基礎(chǔ)。

普通菜豆; 鐮孢菌枯萎病; 水楊酸結(jié)合蛋白2; 直系同源基因; 系統(tǒng)獲得性抗性

普通菜豆(L.)是最重要的食用豆類之一, 是人類攝取蛋白質(zhì)、維生素和礦質(zhì)元素的重要來源[1]。普通菜豆多種植于土壤貧瘠區(qū), 因此容易遭受多種病原物危害而減產(chǎn), 其中以土傳病害最為嚴(yán)重。普通菜豆鐮孢菌枯萎病(Fusarium wilt)屬于普通菜豆維管束類病害的一種, 是由尖鐮孢菌菜豆專化型(f. sp., Fop)引起的典型土傳真菌病害, 給普通菜豆生產(chǎn)帶來很大危害[2]。

水楊酸(salicylic acid, SA)作為一種介導(dǎo)植物抗病反應(yīng)重要的信號(hào)分子, 在普通菜豆抗鐮孢菌枯萎病的防御反應(yīng)中具有極其重要的作用[3]。植物通過水楊酰甲酯酯酶(methyl salicylate esterase, MES)水解水楊酰甲酯(methyl salicylate, MeSA), 從而釋放出具有生物活性的游離SA, 誘導(dǎo)植物細(xì)胞內(nèi)SA相關(guān)的抗病防御反應(yīng), 提高植物免疫力[4-5]。SA與許多植物鐮孢菌枯萎病的抗病性都存在著密切的聯(lián)系, 受外源SA誘導(dǎo)條件下, 擬南芥[6]、番茄[7]、海棗[8]、鷹嘴豆[9]、普通菜豆[3]等對(duì)的抗性均顯著提高。SA是許多種植物防御系統(tǒng)中重要的信號(hào)分子, 因此在植物體內(nèi)直接影響SA水平的調(diào)節(jié)因子就必然與植物的抗病性存在密切的聯(lián)系。水楊酸結(jié)合蛋白2 (salicylic acid binding protein 2, SABP2)就是這樣一類直接參與調(diào)控植物體內(nèi)SA水平的蛋白。SABP2具有MES活性, 在植物體內(nèi)將MeSA轉(zhuǎn)化成游離SA, 提高植物體內(nèi)SA水平, 對(duì)激發(fā)植物系統(tǒng)抗性具有極其關(guān)鍵的作用[10]。相關(guān)研究表明, 煙草基因編碼29 kD蛋白質(zhì), 該蛋白能夠水解MeSA生成SA, 從而誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性[11-14]。此外, Chigurupati等[15]研究表明, SABP2是煙草中SA介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑關(guān)鍵因子, 在煙草受非寄主病原誘導(dǎo)發(fā)生的抗性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Vlot等[16]研究表明, 擬南芥中基因的直系同源基因基因家族的、和在丁香假單胞菌誘導(dǎo)條件下表達(dá)量顯著升高, 功能驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明,、、和在誘導(dǎo)擬南芥發(fā)生系統(tǒng)獲得性抗性反應(yīng)中具有十分關(guān)鍵的作用。Manosalva等[17]研究表明, 馬鈴薯中基因的直系同源基因在寄主抵御致病疫霉侵染過程中同樣也發(fā)揮著相似的重要功能。

植物細(xì)胞內(nèi)存在一個(gè)SA參與的復(fù)雜信號(hào)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò), 而基因作為植物內(nèi)源SA重要的調(diào)控節(jié)點(diǎn)蛋白, 目前僅有少數(shù)幾個(gè)基因通過功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)被證明參與了植物的抗病反應(yīng), 而且主要集中在模式植物上。因此本研究選擇普通菜豆中煙草基因()的同源基因作為目的基因, 研究基因家族成員在普通菜豆枯萎病抗病反應(yīng)中的功能, 有望在普通菜豆抗病分子育種和抗病機(jī)理的研究中取得重要的突破。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

普通菜豆品種BRB130 (編號(hào)為F0004322)、白刀豆(編號(hào)為F0001298)、260205 (編號(hào)為F0005035)和黑蕓豆(編號(hào)為F0004852)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供。將菜豆種子播于滅菌的營養(yǎng)土中, 23~28℃條件下, 每日補(bǔ)充12 h光照, 培養(yǎng)7~10 d, 以備接種。供試菌株為FOP-DM01。病原菌首先接種于PDA (Potato Dextrose Agar)平板上, 25~28℃培養(yǎng)7 d, 然后用于接種。

1.2 接種與樣品的采集

參照薛仁風(fēng)等[18]方法接種病原菌; 分別從0、1和3 d接種和未接種的菜豆植株根部取樣, 每個(gè)處理3次生物學(xué)重復(fù); 將樣品保存于?80℃, 用于基因表達(dá)量、MES活性和SA含量分析。

1.3 PvMES家族基因預(yù)測與序列分析

利用煙草中SABP2蛋白質(zhì)序列(登錄號(hào)為Q6RYA0)搜索普通菜豆基因組數(shù)據(jù)庫(http://www. phytozome.net/), 分析普通菜豆家族基因, 獲得7個(gè)普通菜豆中基因的直系同源基因序列, 命名為~。根據(jù)推測的PvMES氨基酸序列, 利用ClustalX 1.83和MEGA 4.0軟件分別進(jìn)行氨基酸序列同源性比對(duì)和進(jìn)化樹分析。

1.4 總RNA的提取與cDNA合成

采用TRIzol試劑(TianGen, China)提取處理和對(duì)照各時(shí)間點(diǎn)樣品的總RNA, 按照 Reverse Transcriptase System試劑盒(Promega, USA)操作說明書合成第1鏈cDNA, 采用Oligo d(T)15反轉(zhuǎn)錄引物。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析基因表達(dá)量

根據(jù)~和的cDNA序列設(shè)計(jì)定量PCR引物(表1)。以普通菜豆的基因作為內(nèi)參, 采用SuperRealPreMix (SYBR Green, TianGen, China) 熒光定量PCR試劑和qTOWER 2.2實(shí)時(shí)定量PCR儀(Analytikjena, Germany), 以各個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)的cDNA為模板分析家族基因的表達(dá)情況。參照試劑說明中的反應(yīng)體系與程序。反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線和熔解曲線, 以PCR產(chǎn)物電泳確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物特異性。采用2?ΔΔCT法分析數(shù)據(jù), 確定基因的相對(duì)表達(dá)量。設(shè)每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)3個(gè)生物學(xué)重復(fù), 在同一個(gè)批次完成內(nèi)參基因和目標(biāo)基因的PCR反應(yīng)。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用的引物

1.6 MES活性及SA含量的測定

分別取各時(shí)間點(diǎn)采集樣品, 用液氮研磨成粉末, 溶解于預(yù)冷Tris-HCl緩沖液中, 6000′離心30 min, 收集上清液用于MES活性測定。參照Forouhar等[19]測定方法, 將上清液與MeSA混合, 于37℃溫浴30 min, 加入水楊酸甲基轉(zhuǎn)移酶和14C-S-腺苷甲硫氨酸標(biāo)記水解產(chǎn)生的SA, 生成14C-MeSA, 加入等體積乙酸乙酯, 混勻后離心提取有機(jī)相, 通過閃爍計(jì)數(shù)儀定量分析14C-MeSA含量, 計(jì)算上清液MES活性; 另取各時(shí)間點(diǎn)采集樣品, 用于游離SA含量測定。參照薛仁風(fēng)等[3]的方法, 取300~1000 mg根組織, 用液氮研磨后溶于3 mL 80%甲醇, 置4℃過夜。將樣品 4℃, 9000′離心10 min, 取上清液, 將沉淀再次懸浮于2 mL甲醇中, 4℃黑暗放置6 h, 4℃條件下10 000′離心10 min, 取上清液, 將兩組上清液混合后取0.5 mL置于40℃條件下真空干燥, 將提取物用0.3 mL 5%三氯乙酸抽提后, 加入2倍體積環(huán)戊烷∶乙酸乙酯∶異丙醇(50∶50∶1), 充分混勻后離心, 取有機(jī)相真空干燥, 將干燥產(chǎn)物溶解于乙腈, 用高效液相色譜儀(HPLC)測定SA含量。

1.7 發(fā)病情況調(diào)查與評(píng)價(jià)

采用1~9級(jí)的病級(jí)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[20], 在接種后每天記錄發(fā)病植株的病級(jí)。共設(shè)3個(gè)重復(fù), 每個(gè)重復(fù)10株菜豆幼苗。平均發(fā)病級(jí)別=S(發(fā)病級(jí)別/調(diào)查總株數(shù)); 病情指數(shù)=S(發(fā)病級(jí)數(shù)×相應(yīng)的發(fā)病植株數(shù))/(9×植株總數(shù))×100%。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用SAS統(tǒng)計(jì)分析軟件中LSD法進(jìn)行單因素方差分析[21], 采用Microsoft Excel 2010軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 PvMES基因序列及編碼蛋白質(zhì)序列分析

根據(jù)基因cDNA序列, 利用生物信息學(xué)方法在普通菜豆基因組數(shù)據(jù)庫(http://www. phytozome.net/)中搜索基因的同源序列, 共獲得7個(gè)基因的直系同源基因, 分別命名為~(表2)。其中位于第3染色體,位于第2染色體,位于第10染色體?；蛐蛄信c基因序列一致性各不相同, 其中最高, 達(dá)到63.8%,最低, 僅為45.3%。

NtSABP2蛋白質(zhì)序列包括260個(gè)氨基酸, 理論蛋白分子質(zhì)量為29.3 kDa, 等電點(diǎn)為5.39。該蛋白包含3個(gè)活性位點(diǎn)(Ser81、Asp210、His238), 共同組成具有水解MeSA活性的結(jié)構(gòu)域。此外, NtSABP2序列中有15個(gè)與SA互作的活性位點(diǎn); PvMES1序列中3個(gè)水解活性位點(diǎn)均與NtSABP2相同, SA互作位點(diǎn)有14個(gè)與NtSABP2相同; PvMES2序列中有2個(gè)水解活性位點(diǎn)和11個(gè)SA互作位點(diǎn)與NtSABP2相同; PvMES3~PvMES7序列3個(gè)水解活性位點(diǎn)均與NtSABP2相同, 而SA互作位點(diǎn)數(shù)則均與NtSABP2不同, 分別為13、11、15、9和6 (圖1)。該結(jié)果表明,基因家族不同成員可能具有不同的生化特性和生物學(xué)功能。

表2 PvMES家族基因與煙草水楊酸結(jié)合蛋白2核苷酸序列分析

圖1 PvMES1~PvMES7和NtSABP2氨基酸序列比對(duì)分析

相同位點(diǎn)用黑色表示, 相似位點(diǎn)用灰色表示; 水解活性位點(diǎn)用黑色箭頭表示。SA結(jié)合位點(diǎn)用黑色三角形表示。

Identical residues are shaded in black and similar residues in gray; the catalytic triad residues are indicated by arrows, and residues that contact salicylic acid are indicated with black triangles.

基因家族成員按照與NtSABP2序列的親緣關(guān)系可分為三個(gè)亞家族,、和的親緣關(guān)系較近, 組成亞家族I,、和三個(gè)成員親緣關(guān)系較近, 組成亞家族II,組成亞家族III(圖2)。目前在擬南芥、馬鈴薯等作物中均有基因家族的相關(guān)研究報(bào)道[16-17], 但在普通菜豆中尚無基因的研究成果。

2.2 PvMES基因的誘導(dǎo)表達(dá)分析

接種FOP-DM01菌株1 d后, 4個(gè)菜豆品種根中表達(dá)量均有所上調(diào), 但不顯著, 接種3 d后, 抗病品種黑蕓豆和260205根中表達(dá)量顯著高于感病品種BRB130和白刀豆, 與0 d表達(dá)量相比, 分別上升至3.9倍和5.6倍;基因的表達(dá)量在接種病原菌后的4個(gè)品種中, 不同時(shí)間段并沒有發(fā)生顯著變化; 在接種病原菌1 d后, 抗病品種黑蕓豆和260205根中表達(dá)量顯著高于感病品種BRB130和白刀豆, 接種3 d后, 2個(gè)抗病品種的表達(dá)量繼續(xù)升高, 顯著高于2個(gè)感病品種, 與0 d表達(dá)量相比, 分別提高至1.9倍和4.3倍;表達(dá)量在接種病原菌3 d后的4個(gè)菜豆品種中均升高, 黑蕓豆根中表達(dá)量升高至2.5倍, 高于其他3個(gè)品種;表達(dá)量在接種病原菌后均顯著升高, 接種1 d后, 黑蕓豆和260205根中表達(dá)量顯著高于BRB130和白刀豆, 接種3 d后, 黑蕓豆和260205根中表達(dá)量分別升高至0 d表達(dá)量的7.6倍和5.4倍; 接種病原菌后, 4個(gè)菜豆品種中表達(dá)量均逐漸升高, 在接種3 d后, 黑蕓豆根中表達(dá)量升高至3.7倍, 顯著高于其他3個(gè)品種; 而基因的表達(dá)量在接種病原菌后的4個(gè)品種根中沒有發(fā)生顯著變化; 在此互作過程中, 寄主基因作為陽性對(duì)照, 在接菌1 d后表達(dá)量顯著升高(圖3)。結(jié)果表明,基因家族7個(gè)成員中,、、、和的轉(zhuǎn)錄表達(dá)受 FOP-DM01菌株誘導(dǎo)均呈現(xiàn)不同程度的升高, 推測這5個(gè)基因與菜豆鐮孢菌枯萎病抗病反應(yīng)關(guān)系密切, 其中黑蕓豆基因在接種3 d后表達(dá)量變化最顯著, 升高至7.6倍, 說明該基因可能對(duì)抗病品種黑蕓豆的抗病性起到關(guān)鍵作用, 而抗病品種260205接種3 d后表達(dá)量升高最明顯, 達(dá)5.6倍, 表明其可能對(duì)寄主誘導(dǎo)自身抗病反應(yīng)的發(fā)生最重要。

圖2 PvMES1~PvMES7和NtSABP2進(jìn)化樹分析

2.3 MES活性分析

MES活性與普通菜豆應(yīng)答枯萎病原菌FOP-DM01菌株侵染密切相關(guān)。研究表明, 在接種病原菌1 d后, 4個(gè)品種普通菜豆根MES活性均升高, 但并不顯著, 接種3 d后, 抗病品種黑蕓豆和260205根中MES活性顯著升高, 分別為0.043和0.057 μmol min–1mg–1, 顯著高于感病品種BRB130和白刀豆(圖4), 表現(xiàn)出對(duì)病原菌更強(qiáng)的抗病性。

圖3 FOP-DM01菌株誘導(dǎo)下普通菜豆根組織PvMES1~PvMES7和PvPR1表達(dá)量

相同時(shí)間點(diǎn)中標(biāo)以不同字母的柱值在不同品種間差異顯著(< 0.05)。

Bars represented by different letters are significantly different (< 0.05) among four common bean varieties at the same time point.

2.4 游離SA含量分析

接種病原菌1 d后, 普通菜豆抗病品種和感病品種根中SA含量略有上升, 但并沒有明顯差異; 接種病原菌3 d后, 抗病品種黑蕓豆和260205根中SA含量顯著升高, 分別為264.1和287.0 ng g–1FW, 均高于感病品種BRB130和白刀豆(圖5), MES活性的升高是其更強(qiáng)抗病性的基礎(chǔ)。

圖4 FOP-DM01菌株誘導(dǎo)下普通菜豆根組織MES活性

相同時(shí)間點(diǎn)中標(biāo)以不同字母的柱值在不同品種間差異顯著(< 0.05)。

Bars represented by different letters are significantly different (< 0.05) among four common bean varieties at the same time point.

2.5 不同品種普通菜豆發(fā)病級(jí)別的調(diào)查

接種FOP-DM01菌株3周后, 感病品種BRB130和白刀豆表現(xiàn)出明顯的葉片枯萎、褪綠變黃和根系變褐腐爛等發(fā)病癥狀, 而抗病品種黑蕓豆和260205僅少數(shù)植株表現(xiàn)出輕微的發(fā)病癥狀; BRB130和白刀豆的平均病級(jí)數(shù)分別達(dá)到6.4和7.1, 病情指數(shù)分別為74.2和68.3, 而黑蕓豆和260205平均病級(jí)數(shù)僅為2.9和2.7, 病情指數(shù)分別為38.1和27.7 (圖6)。表型鑒定結(jié)果表明, 黑蕓豆和260205對(duì)FOP-DM01菌株的抗病性要強(qiáng)于BRB130和白刀豆。

圖5 FOP-DM01菌株誘導(dǎo)下普通菜豆根組織SA含量分析

相同時(shí)間點(diǎn)中標(biāo)以不同字母的柱值在不同品種間差異顯著(< 0.05)。

Bars represented by different letters are significantly different (< 0.05) among four common bean varieties at the same time point.

圖6 普通菜豆接種FOP-DM01菌株后的病情評(píng)價(jià)

A: 接種FOP-DM01菌株3周后發(fā)病情況; B: 接種FOP-DM01菌株3周后的病情指數(shù)。相同時(shí)間點(diǎn)中標(biāo)以不同字母的柱值在不同品種間差異顯著(< 0.05)。

A: Disease progress of the common bean varieties at three weeks post inoculation with FOP-DM01; B: Disease index of the common bean varieties plants at three weeks post inoculation with FOP-DM01. Bars represented by different letters are significantly different (< 0.05) among four common bean varieties at the same time point.

3 討論

SA作為典型的植物信號(hào)分子, 通過激活抗病相關(guān)基因的表達(dá)提高寄主抗病性, 在植物系統(tǒng)抗性體系中具有非常重要的作用[22-24]。Spletzer和Enyedi[25]研究表明SA處理番茄顯著地提升了寄主對(duì)鏈格孢菌的系統(tǒng)抗性。Sz?ke等[26]研究表明禾谷鐮孢菌侵染感病或者中抗的玉米品種并不會(huì)導(dǎo)致寄主內(nèi)SA含量明顯變化, 而被其侵染的抗病品種體內(nèi)的SA水平則顯著升高。Wu等[27]揭示出香蕉受f. sp.侵染后細(xì)胞內(nèi)SA含量顯著升高, 并激活苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase, PAL)和過氧化物酶(peroxidase, POX)等相關(guān)防御因子的表達(dá), 從而誘導(dǎo)寄主系統(tǒng)獲得性抗性(system acquired resistance, SAR)反應(yīng)的發(fā)生。在植物細(xì)胞中MeSA是SA穩(wěn)定的的無活性衍生物, 是植物體內(nèi)SA主要的運(yùn)輸形式, 可經(jīng)植物韌皮部從病原菌感染位點(diǎn)運(yùn)送到效應(yīng)部位。植物遭受病原菌侵襲后應(yīng)激產(chǎn)生一些SA信號(hào)分子, 在SA甲基轉(zhuǎn)移酶作用下生成MeSA, MeSA對(duì)SA水解酶不敏感(SA易受SA水解酶降解), 故可作為可移動(dòng)的SAR信號(hào), 從病原菌感染的局部位點(diǎn)運(yùn)送到植物遠(yuǎn)端組織, 以激發(fā)起全植株水平的抵御病原菌的抗性[4-5,10]。因此, MES對(duì)于調(diào)控植物細(xì)胞內(nèi)SA水平和建立植物抵御病原物侵染的抗性反應(yīng), 均是必不可少的調(diào)控因子。

比較基因組學(xué)的研究為揭示普通菜豆基因結(jié)構(gòu)和功能提供了捷徑[28]。種間的比較基因組學(xué)主要揭示物種間在基因組結(jié)構(gòu)上的差異, 解析基因功能, 探索物種進(jìn)化關(guān)系, 將模式植物基因組的相關(guān)信息轉(zhuǎn)移到未知植物基因組中, 精確定位和克隆基因。因此, 通過分析普通菜豆與煙草等模式植物部分或全部基因序列的保守程度, 就可以利用普通菜豆與煙草基因組之間編碼順序上和結(jié)構(gòu)上的同源性, 分析序列信息, 從而獲得普通菜豆基因組中的相關(guān)序列, 進(jìn)而揭示普通菜豆基因的潛在功能, 闡明物種進(jìn)化關(guān)系及基因組的內(nèi)在結(jié)構(gòu)。眾所周知, 植物細(xì)胞內(nèi)存在一個(gè)SA參與的復(fù)雜信號(hào)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò), 而基因作為植物內(nèi)源SA重要的調(diào)控節(jié)點(diǎn)蛋白, 目前僅有少數(shù)幾個(gè)基因通過功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)被證明參與了植物的抗病反應(yīng)。煙草基因在寄主誘導(dǎo)產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性過程中發(fā)揮重要作用,基因編碼蛋白具有MeSA水解活性, 能夠水解MeSA生成SA, 從而激活寄主內(nèi)SA介導(dǎo)的抗病相關(guān)反應(yīng)[11-15]。擬南芥中基因家族成員是基因同源基因, 其中、、和是激活寄主防御反應(yīng)最關(guān)鍵的基因,家族基因表達(dá)量的升高顯著提升了擬南芥的抗病性[16]。此外, 在致病疫霉侵染馬鈴薯過程中, 抑制基因的表達(dá)顯著降低了MeSA轉(zhuǎn)化為SA的效率, 從而顯著削弱了馬鈴薯晚疫病抗病性[17]。本研究利用生物信息學(xué)方法搜索到普通菜豆中7個(gè)煙草水楊酸結(jié)合蛋白2的同源基因~, 其中、、、和的表達(dá)量受FOP-DM01菌株誘導(dǎo)均呈現(xiàn)不同程度的升高, 抗病品種的基因表達(dá)量顯著高于感病品種, 并且抗病品種MES活性和游離SA含量也顯著高于感病品種。試驗(yàn)結(jié)果表明, 在菜豆與病原菌的互作過程中, 抗病品種基因表達(dá)量迅速升高, MES活性顯著提升, 從而水解產(chǎn)生游離SA, 激活了寄主內(nèi)SA介導(dǎo)的相關(guān)防御反應(yīng)。本研究結(jié)果有望在普通菜豆抗病分子育種和抗病機(jī)理的研究中取得重要進(jìn)展, 關(guān)于基因家族各成員在菜豆與病原菌的互作中如何發(fā)揮抵抗病原菌侵染的功能, 我們將克隆基因家族各成員基因, 采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因沉默技術(shù)獲得基因過表達(dá)和基因沉默的轉(zhuǎn)基因植株, 通過研究轉(zhuǎn)基因植株抗病表型和生理生化指標(biāo)的變化進(jìn)一步驗(yàn)證基因家族各成員的生物學(xué)功能。

4 結(jié)論

搜索到普通菜豆中煙草水楊酸結(jié)合蛋白2的7個(gè)同源基因, 其中和的表達(dá)量受 FOP-DM01菌株誘導(dǎo)呈不同程度的升高; MES活性及其水解產(chǎn)生的游離SA含量在接種后也相應(yīng)顯著提升, 但接種后抗病品種中MES活性和游離SA含量都顯著高于感病品種, 游離SA含量升高激活寄主體內(nèi)SA介導(dǎo)的相關(guān)防御反應(yīng), 這是抗病品種的發(fā)病級(jí)別和病情指數(shù)顯著低于感病品種的基礎(chǔ)。

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Identification and Expression Analysis of Likely Orthologs of Tobacco Salicylic Acid Binding Protein 2 in Common Beans

XUE Ren-Feng1,**, WANG Li2,**, FENG Ming1, and GE Wei-De1,*

1Crop Research Institute, Liaoning Academy of Agricultural Sciences, Shenyang 110161, Liaoning, China;2Rural Energy and Environment Agency, Ministry of Agriculture, Beijing 100125, China

Salicylic acid can induce the systematic resistant response in plants, and salicylic acid-binding protein 2 is an important esterase in the regulation of salicylic acid content in plant cells. In this study, we used the bioinformatics method to search the orthologous genes of tobacco salicylic acid-binding protein 2 in common bean, which were designated as–, then analyzed the changes of MES activity and free SA accumulation in plant roots. The expression level of 7genes in susceptible varieties BRB130 and Baidaodou, resistant varieties Heiyundou and 260205 infected byf. sp.isolate FOP-DM01 was detected by Real time PCR, showing that the expression of, andwas significantly increased at three days after FOP-DM01 infection, with most significant increase of 7.6 folds and 5.6 folds forgene in Heiyundou andgene in 260205 at 0 day, respectively. The MES activity and free SA content in roots of Heiyundou and 260205 were also improved, which activated the relevant defense response reaction mediated by SA in the host. The results of this study provide a theoretical basis for the resistance molecular breeding of Fusarium wilt in common beans.

common bean; Fusarium wilt; salicylic acid binding protein 2; orthologous genes; system acquired resistance

2017-09-10;

2018-01-08;

2018-01-29.

葛維德, E-mail: snowweide@163.com, Tel: 024-31029901

10.3724/SP.J.1006.2018.00642

本研究由國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31401447), 遼寧省博士科研啟動(dòng)基金(201501113), 特色糧油新品種選育及優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)技術(shù)集成與示范(2018416023)和國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-09-08Z)資助。

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (31401447), the Liaoning Doctor Startup Foundation (201501113), the New Varieties Breeding, High Quality and Effective Technology Integration and Demonstration of Special Grain and Oil Crop (2018416023), and the China Agriculture Research System (CARS-08-Z8).

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

E-mail: xuerf82@163.com, Tel: 024-31029901

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180128.1953.006.html