外泌體作為非小細(xì)胞肺癌診斷標(biāo)志物的研究進(jìn)展

王賽斌 呂鏜烽 涂軍偉 宋勇

外泌體(exosomes)是具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)、直徑為30～100 nm的微小囊泡，是細(xì)胞經(jīng)過“內(nèi)吞-融合-外排”等一系列調(diào)控過程后由細(xì)胞主動(dòng)分泌的一種物質(zhì)。外泌體的產(chǎn)生和分泌受多種蛋白質(zhì)精確調(diào)節(jié)[1]。在正?；驊?yīng)激條件下，幾乎所有類型的細(xì)胞都可以分泌外泌體，如網(wǎng)織紅細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮及上皮細(xì)胞等。與來源同一組織器官類型的正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞能分泌更多的外泌體。

外泌體內(nèi)含豐富的生物活性分子，包括蛋白質(zhì)、核酸及脂質(zhì)。這些分子被外泌體攜帶進(jìn)入血液循環(huán)，而后被一定距離外的靶細(xì)胞吸收，最終實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)靶細(xì)胞基因表達(dá)和細(xì)胞功能。研究表明，外泌體能影響腫瘤微環(huán)境的形成、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力、介導(dǎo)腫瘤免疫抑制及參與腫瘤放化療抵抗進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生與發(fā)展[2]。此外，外泌體因攜帶經(jīng)分選的生物活性物質(zhì)，天然具備了作為疾病生物標(biāo)志物的潛在價(jià)值[3]。

目前，外泌體數(shù)據(jù)庫(kù)“ExoCarta database”(http://www.exocarta.org)中關(guān)于外泌體的研究數(shù)量在不斷增加。外泌體作為疾病的研究對(duì)象，特別是在腫瘤領(lǐng)域的研究是目前的一個(gè)熱點(diǎn)。肺癌是一種高度致死的疾病，針對(duì)肺癌治療領(lǐng)域的研究近年來取得了不少進(jìn)展，但肺癌5年生存率并沒有改善[4]。其中，疾病得不到早期診斷及腫瘤發(fā)生早期轉(zhuǎn)移是主要原因之一。因此，尋找腫瘤生物標(biāo)志物用以疾病早期診斷是一項(xiàng)十分有意義研究。本文對(duì)近年外泌體作為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)診斷標(biāo)志物價(jià)值的研究進(jìn)展作一綜述。

一、外泌體作為疾病診斷標(biāo)志物概述

1. 外泌體的組成及特點(diǎn)： 外泌體內(nèi)含有的蛋白質(zhì)主要包括兩類：一類是在外泌體中普遍存在的蛋白，如四次跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81及CD82)、熱休克蛋白(HSP60、HSP70及HSP90)、腫瘤易感基因101蛋白(tumor susceptibility gene 101, TSG101)及ALG-2相互作用蛋白X(ALG-2-interacting protein X, Alix)；另一類蛋白則是與外泌體親代來源細(xì)胞相關(guān)。外泌體中的核酸來源于親代細(xì)胞，包括單鏈或雙鏈DNA、線粒體DNA，RNA如信使RNA(mRNA)、核糖體RNA、微小RNA(miRNA)以及非編碼RNA(noncodingRNA, ncRNA)；脂質(zhì)成分主要為膽固醇、二酰甘油、鞘磷脂、甘油磷脂和飽和脂肪酸等[5]。外泌體存在于多種體液，包括血漿、血清、精液、尿、唾液、乳腺、牛奶、羊水、腹水、腦脊液和膽汁。在外泌體分離技術(shù)方面，目前比較常用的方法有差速離心法、蔗糖密度梯度離心法、超濾離心法、免疫磁珠法和多聚物沉降法等。這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，其中, 差速離心法在文獻(xiàn)中報(bào)道較多。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，“液態(tài)活檢”的技術(shù)正逐漸興起。該技術(shù)具有無創(chuàng)性及檢測(cè)樣本易獲取性，在某些領(lǐng)域有逐漸取代傳統(tǒng)組織活檢的趨勢(shì)。其中，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells, CTCs)、無細(xì)胞循環(huán)DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)及外泌體是“液態(tài)活檢”的三種主要方式。CTCs已被證明是良好的腫瘤轉(zhuǎn)移性進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)因子，也可用于監(jiān)測(cè)疾病的治療反應(yīng)；而ctDNA作為可能的腫瘤生物標(biāo)志物和預(yù)后因子目前正處于研究中，難以標(biāo)準(zhǔn)化是其面臨的重大挑戰(zhàn)[6]。循環(huán)外泌體相對(duì)于其他液態(tài)活檢所具有的優(yōu)勢(shì)是：外泌體選擇性攜帶親代細(xì)胞的生物活性物質(zhì)，如miRNA；外泌體脂質(zhì)雙層膜能保護(hù)RNA免于降解，磷酸化蛋白在循環(huán)中免于去磷酸化，而磷酸化的蛋白在腫瘤中更具生物標(biāo)志物價(jià)值；外泌體降低生物流體的復(fù)雜性，從而有助于更具體、靈敏地檢測(cè)低豐度的分子[7]。

2. 外泌體在疾病中作為診斷標(biāo)志物的價(jià)值： 外泌體通過細(xì)胞釋放進(jìn)入循環(huán)和體液。研究表明，在健康受試者和患者中外泌體具有不同的蛋白質(zhì)和RNA含量，這是其具備診斷標(biāo)志物價(jià)值的基礎(chǔ)[8]。相關(guān)研究主要集中于腫瘤，包括胰腺癌、前列腺癌、胃癌、口咽鱗狀細(xì)胞癌、食管癌和肺癌等腫瘤的診斷；也有應(yīng)用于非腫瘤性疾病，如帕金森氏病的診斷[9]。

外泌體攜帶的蛋白質(zhì)組成與親代細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)不同，這表明外泌體是選擇性包裝親代細(xì)胞蛋白質(zhì)，相關(guān)機(jī)制目前了解尚少，但可能涉及四次跨膜蛋白和其他蛋白之間的相互作用，與跨膜蛋白在膜中形成蛋白復(fù)合物微結(jié)構(gòu)域有關(guān)。血清外泌體磷脂酰肌醇蛋白多糖-1(GPC1)陽(yáng)性在診斷胰腺癌患者時(shí)具有100%的特異性和敏感性；前列腺癌患者尿液中的外泌體TM256(跨膜蛋白256)同樣具有非常高的診斷敏感性(94%)和特異性(100%)[10]。這些研究結(jié)果振奮人心。

腫瘤具有獨(dú)特的miRNA表達(dá)譜，腫瘤細(xì)胞來源的外泌體富含miRNA可用作腫瘤診斷標(biāo)記物[11]。Huang等[12]研究提示外泌體miR-1290和miR-375是去勢(shì)治療失敗前列腺癌有價(jià)值的診斷標(biāo)志物；Cazzoli等[13]發(fā)現(xiàn)了具有潛力的篩選和診斷肺腺癌的外泌體miRNA；肝臟移植后血清外泌體miRNA水平的增加可以提示肝癌的復(fù)發(fā)；循環(huán)外泌體EGFRvⅢmRNA水平的增加可以診斷膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，從而避免通過外科手術(shù)活檢腦組織來檢測(cè)EGFRvⅢ蛋白。

目前，外泌體作為診斷標(biāo)志物在非腫瘤疾病中也被廣泛研究。在神經(jīng)系統(tǒng)中，腦脊液外泌體tau蛋白可用于早期阿爾茨海默病的診斷，而血清外泌體溶酶體蛋白有助于區(qū)分臨床前阿爾茨海默病和癡呆患者[14]。血清外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)還可用于診斷帕金森氏病患者[9]。在哮喘患者中，來自支氣管肺泡灌洗液的外泌體與健康對(duì)照者表現(xiàn)出不同的miRNA譜；血清外泌體miR-192水平增加可以預(yù)測(cè)急性心肌梗死后患者心力衰竭的發(fā)生發(fā)展[15]。此外，外泌體作為診斷標(biāo)志物也被用于泌尿系統(tǒng)疾病、肝臟疾病和血管性疾病[16-17]。所有這些研究都為眾多疾病的診斷開啟了新的視窗。

二、外泌體在NSCLC中的診斷價(jià)值

肺癌具有很高的發(fā)病率和病死率，NSCLC的5年生存率與診斷時(shí)的腫瘤分期相關(guān)[18-19]。大多數(shù)肺癌患者出現(xiàn)局部癥狀或轉(zhuǎn)移相關(guān)癥狀時(shí)已錯(cuò)過了最佳治療時(shí)機(jī)，因此肺癌早期診斷至關(guān)重要。目前，采用低劑量計(jì)算機(jī)斷層掃描(low dose CT, LDCT)對(duì)肺癌進(jìn)行篩查，能有效減少肺癌負(fù)擔(dān)[20-21]。但是LDCT具有明顯的缺點(diǎn)，包括過度診斷、輻射暴露和患者長(zhǎng)時(shí)間承受心理壓力。近年來，肺癌靶向治療的興起對(duì)腫瘤診斷提出了新的要求。因此，尋找非侵入性或微創(chuàng)性、具有高敏感性和特異性的生物診斷標(biāo)志物是臨床迫切需要解決的問題。

1. 外泌體蛋白質(zhì)： 檢測(cè)和分析肺癌細(xì)胞來源外泌體蛋白有助于肺癌的早期診斷[22]。有研究采用定位于外泌體膜的EGFR用于肺癌診斷[23]；Huang等[24]研究發(fā)現(xiàn)NSCLC患者肺組織外泌體表面EGFR免疫染色呈陽(yáng)性的占80%，而慢性肺炎組織的外泌體EGFR呈陽(yáng)性的只有2%的，因而他們認(rèn)為外泌體EGFR蛋白可用作NSCLC和慢性肺炎鑒別診斷的生物標(biāo)志物。孟祥寬等[25]檢測(cè)分析了18例肺腺癌患者和9例正常對(duì)照者血清外泌體膜蛋白GPC1的表達(dá)，結(jié)果表明GPC1表達(dá)水平不僅與肺腺癌發(fā)生相關(guān)，而且與NSCLC分期相關(guān)，晚期NSCLC患者GPC1表達(dá)量更高。

將高通量質(zhì)譜分析用于篩選NSCLC外泌體蛋白的研究揭示了更多具有生物標(biāo)志物價(jià)值的分子。Birgitte等[26]采用微陣列芯片技術(shù)研究了431例肺癌患者和150例對(duì)照者血漿外泌體中的蛋白表達(dá)情況，通過分析發(fā)現(xiàn)CD151、CD171及tetraspanin 8 (TSPAN8)這三種蛋白表達(dá)不僅能區(qū)分腫瘤與正常組織，同時(shí)也能區(qū)分出各種肺癌組織亞型；聯(lián)合應(yīng)用這三種蛋白診斷NSCLC的ROC曲線下面積(Area Under Curve, AUC)達(dá)到0.74。Ueda等[27]采用抗CD9-MISA聯(lián)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)分析了46例患者血清外泌體，從中篩選出CD91分子對(duì)NSCLC的診斷敏感性為0.72，特異性0.60，AUC為0.89。Park等[28]采用Nano-LC-ESI-MS/MS技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)從NSCLC患者胸水外泌體中分析出包括EGFR在內(nèi)的上百種具有潛在診斷價(jià)值的蛋白。而NSCLC患者尿液和腫瘤組織的外泌體中，Li等[29]運(yùn)用質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)存在特異性表達(dá)蛋白富亮氨酸α-2-糖蛋白1，認(rèn)為它可用作NSCLC潛在的診斷標(biāo)志物。Clark等[22]同樣采用Nano-ELS-MS/MS技術(shù)分析了來自正常支氣管上皮細(xì)胞系和兩個(gè)攜帶NSCLC細(xì)胞系的外泌體的蛋白表達(dá)譜，從中篩選出如細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子、溶酶體膜糖蛋白2等多種存在顯著性差異表達(dá)的蛋白，同時(shí)檢測(cè)分析這些蛋白有助于提高NSCLC診斷敏感性和特異性。蛋白微陣列芯片是高通量檢測(cè)的另一種方法，可同時(shí)檢測(cè)多種目標(biāo)蛋白。Jakobsen等[30]采用胞外囊泡芯片技術(shù)從109例晚期NSCLC患者血清外泌體中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)多種具有高敏感性和特異性的蛋白，聯(lián)合分析這些蛋白對(duì)晚期NSCLC患者的診斷靈敏度達(dá)到75%，特異度76%，見表1。

2. 外泌體核酸作為NSCLC診斷標(biāo)志物： 血漿來源的外泌體miRNA的表達(dá)譜在肺癌患者和正常對(duì)照者中存在明顯差異。在NSCLC患者中，患者的本身的個(gè)體差異、腫瘤組織的不同類型和不同病理分期使得miRNA表達(dá)譜不盡相同，但患者循環(huán)外泌體與腫瘤細(xì)胞外泌體中的miRNAs組分具有很強(qiáng)的相似性。在一項(xiàng)隊(duì)列研究中，Rolfo等[31]發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，NSCLC患者組血漿外泌體中與EGFR通路相關(guān)的miRNA-30b/30c發(fā)生了上調(diào)。Rodriguez等[32]發(fā)現(xiàn)肺部腫瘤患者血循環(huán)外泌體miR-122-5p等miRNA含量明顯高于支氣管肺泡灌洗液所測(cè)的結(jié)果。此外，在疾病的不同階段，細(xì)胞外囊泡miRNA含量也不同，Silva等[33]研究發(fā)現(xiàn)血漿外泌體miR-30e-3p和let7f表達(dá)水平的差異可作為NSCLC患者早期和晚期區(qū)分的標(biāo)志物，而且預(yù)后較差的NSCLC患者與其血漿中這些miRNA表達(dá)量下調(diào)有關(guān)。

高通量檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了外泌體miRNA作為分子標(biāo)志物的研究。Munagala等[34]采用miRNA的芯片技術(shù)檢測(cè)了荷瘤小鼠血清外泌體中的miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)miR-21和miR-155表達(dá)增加有助于肺癌復(fù)發(fā)的診斷。Zhou等[35]采用qRT-PCR方法從肺腺癌患者血漿外泌體中鑒定出6種較正常對(duì)照者明顯表達(dá)上調(diào)的miRNA，聯(lián)合分析這些外泌體miRNA可有助于肺腺癌的診斷，見表2。

在臨床應(yīng)用方面，目前Exosome Diagnostics公司研發(fā)的基于血漿外泌體的ExoDx Lung(ALK)診斷試劑盒已于2016年初被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于臨床。這是世界上第一個(gè)以血液樣本分析外泌體RNA的臨床液體活檢。這項(xiàng)方法可靈敏、準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)地檢測(cè)NSCLC患者的EML4-ALK突變。通過比較患者組織ALK水平和相應(yīng)的血漿樣本發(fā)現(xiàn)該項(xiàng)檢測(cè)可以達(dá)到88%的診斷靈敏度和100%的診斷特異性。而此前，對(duì)于EML4-ALK的檢測(cè)是基于組織活檢的熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization, FISH)或免疫組化(immunohistochemistry, IHC)，而且FISH缺乏靈敏性，誤診率也高。

表1 外泌體蛋白質(zhì)作為NSCLC診斷標(biāo)志物

注：NA：not available

表2 外泌體核酸作為NSCLC診斷標(biāo)志物

注：NA：not available

三、總結(jié)和展望

外泌體具有成為多種疾病生物標(biāo)志物的巨大潛力，但尚存在一些問題。首先，目前沒有分離外泌體的標(biāo)準(zhǔn)化方法，部分個(gè)體研究的結(jié)果匹配欠佳，這可能與外泌體的分離與純化的方法差異有關(guān)[36]。操作過程的標(biāo)準(zhǔn)化、均一化是外泌體在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中面臨的重要挑戰(zhàn)；其次，在定量研究中尚缺乏對(duì)外泌體內(nèi)參miRNA的滴定，一些研究認(rèn)為miR-1228是良好內(nèi)源性參照[31,37]，但仍需要更多的研究進(jìn)行驗(yàn)證；第三，對(duì)外泌體尚存在精確分離、快速鑒定及靈敏檢測(cè)的難題。

然而，越來越多的研究正在逐漸推進(jìn)外泌體的臨床應(yīng)用，Wang等[38]利用DNA構(gòu)建納米結(jié)構(gòu)和先進(jìn)的適配技術(shù)，開發(fā)了DNA納米四面體傳感器，利用電化學(xué)特性檢測(cè)腫瘤來源的外泌體，大大提升了檢測(cè)的靈敏度。Xia等[39]通過整合具有優(yōu)良水溶性的單壁碳納米管和跨膜蛋白CD63的特異性核酸適體來檢測(cè)外泌體，展示了一種可見且簡(jiǎn)單的方法，為外泌體的臨床檢測(cè)應(yīng)用提供了可能。而微流體控制技術(shù)的發(fā)展使其具有了超高的空間分辨率和近乎單分子水平的精確操控性，并且具有樣品使用的低耗性，這一方法已經(jīng)顯示出其在細(xì)胞外囊泡臨床應(yīng)用方面的巨大潛力[40]?？傊饷隗w作為液態(tài)活檢的主要手段之一，具有廣闊的研究?jī)r(jià)值。相信在將來的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中，外泌體有望作為肺癌良好的生物標(biāo)志物，推進(jìn)肺癌的早期診斷，并有助肺癌的治療及預(yù)后監(jiān)測(cè)。

參 考 文 獻(xiàn)

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