檸檬烯納米脂質體的制備及其性質測定

郝靜梅，孫志高*，盛冉，方明，于奉生

1(西南大學 柑桔研究所，重慶，400712) 2(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)

檸檬烯又稱苧烯，學名為1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)環(huán)己烯，分子式為C10H16，為無色至淡黃色的液體，不溶于水，溶于丙酮、乙醇等有機溶劑[1-2]，是自然界除蒎烯外分布最廣的萜烯，具有抗菌、抗氧化、消炎和抗腫瘤等多種生理功能[3-5]。但是，由于檸檬烯不溶于水，且易于氧化和揮發(fā)，限制了檸檬烯在食品、藥品、保健品等行業(yè)中的使用和發(fā)展。因此，為了更好地開發(fā)利用檸檬烯，研究改進檸檬烯溶解特性的新技術和方法極為迫切。

在20世紀60年代中期BANGHAM提出了脂質體由磷脂膜構成的概念,經過進一步發(fā)展，脂質體現(xiàn)已在藥劑學、生物物理學、治療物理學和化學等多個領域中廣泛應用[6]。脂質體作為一種新型的靶向制劑，具有無毒、生物相容性好、可降解和緩釋[7]，對脂溶性物質的包封性良好[8-9]等優(yōu)點。采用脂質體技術將檸檬烯包封后可增加檸檬烯的穩(wěn)定性，并提高檸檬烯的利用率。本研究通過利用乙醇注入法制備檸檬烯脂質體，以包封率為指標，通過單因素和響應面試驗對檸檬烯脂質體的制備工藝進行優(yōu)化，篩選出檸檬烯脂質體的最佳制備工藝，并測定了檸檬烯脂質體的平均粒徑、粒徑分布和電位等理化指標。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

檸檬烯(純度≥95%)，上海邁瑞爾化學技術有限公司；檸檬烯標準品(純度≥99.0%)，美國Sigma公司；大豆卵磷脂(>90%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；膽固醇，國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇、三氯甲烷、甲醇、Na2HPO4、NaH2PO4均為分析純，重慶川東化工有限公司；無水Na2SO4，成都科龍化工試劑廠；正己烷：色譜純，Honeywell有限公司。

1.2 儀器與設備

電子分析天平(BT224S)，賽多利斯科學儀器有限公司；恒溫磁力攪拌器(DF-101S)，鄭州長城科工貿有限公司；恒溫水浴鍋(LKTC-B1-T)，上海雙舜實業(yè)發(fā)展有限公司；高速冷凍離心機(UniCen MR)，德國Herolab公司；渦旋混合器(XW-80A)，其林貝爾儀器制造有限公司；7890B/5977A氣相色譜-單四級桿質譜聯(lián)用儀、HP-5MS石英毛細管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)、G4513A自動進樣器，美國Agilent公司；激光粒度分析儀(ZEN 3600)，英國Malvern儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 乙醇注入法制備檸檬烯納米脂質體

采用乙醇注入法制備檸檬烯脂質體，稱取一定量的大豆卵磷脂、膽固醇，加入5 mL無水乙醇于50 ℃水浴充分溶解5 min，然后加入一定量的檸檬烯充分混勻，用注射器快速吸取上述脂質乙醇溶液，并勻速注入到不斷攪拌的水化介質0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer solution, PBS)中，攪拌水化20 min后過0.22 μm的微孔濾膜，即得到檸檬烯脂質體[10, 11]。

1.3.2 GC-MS測定檸檬烯的含量

色譜條件：色譜柱為超高惰性HP-5ms毛細管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)；程序升溫：起始溫度40 ℃，停留1 min，以15 ℃/min升至160 ℃，停留1 min，進樣口溫度為250 ℃；載氣為高純氦氣，流速為1.2 mL/min，不分流，進樣量為0.1 μL；用外標法自動進樣器直接進樣，分別測定不同濃度檸檬烯標準液的峰面積，繪制標準曲線。

質譜條件：EI離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度為280 ℃；離子源溫度為230 ℃；四級桿溫度為150 ℃；質量掃描范圍m/z為40～350。

1.3.3 標準曲線的繪制

取30 mg檸檬烯標準品于25 mL容量瓶中，用色譜級正己烷定容至25 mL，即可制備成1000 μg/mL的檸檬烯標準溶液，然后吸取1 mL上述標準溶液于10 mL容量瓶中，并用色譜級正己烷定容，制得100 μg/mL的檸檬烯標準溶液，再將其依次稀釋成50、40、30、20、10、1 μg/mL的檸檬烯標準溶液。在1～100 μg/mL置信區(qū)間內以檸檬烯濃度為橫坐標(X)、峰面積(Y)為縱坐標，繪制檸檬烯標準曲線。

1.3.4 檸檬烯納米脂質體包封率的測定

游離檸檬烯含量的測定：吸取1 mL檸檬烯脂質體于10 mL離心管中，加入5 mL正己烷，旋緊瓶蓋密封，漩渦混合15 s。然后于4 000 r/min離心20 min，分離水相和正己烷相，取上層正己烷相3 mL于10 mL離心管中，加入0.1 g已干燥的無水Na2SO4，并靜置20 min，然后于10 000 r/min離心10 min，最后用氣相色譜法測定游離的檸檬烯含量Q1。

破乳后全部檸檬烯含量的測定：吸取1 mL檸檬烯脂質體于10 mL離心管中，加入0.5 mL甲醇和三氯甲烷的混合物(甲醇的體積分數(shù)為50%)，旋渦混合3 min，然后再加入5 mL正己烷，旋緊瓶蓋密封。將試管于50 ℃水浴中加熱20 min，并不斷振蕩。加熱后冷卻，然后于4 000 r/min離心15 min ,分離水相和正己烷相，取上層正己烷相3 mL于10 mL離心管中，加入0.1 g已干燥的無水Na2SO4并靜置20 min，然后于10 000 r/min離心10 min，最后用氣相色譜法測定全部的檸檬烯含量Q2。

檸檬烯脂質體的包封率(encapsulation efficiency，EE)由公式(1)計算可得：

(1)

式中：Q1表示游離檸檬烯含量；Q2表示破乳后全部檸檬烯含量。

1.3.5 乙醇注入法制備檸檬烯納米脂質體的工藝優(yōu)化

以包封率為指標，首先對影響檸檬烯納米脂質體包封率的大豆卵磷脂添加量(50、100、150、200、250、300 mg)、膽固醇的添加量(0、5、10、15、20、25 mg)、檸檬烯的添加量(5、10、15、20、25、30 mg)、磁力攪拌速度(200、400、600、800、1 000、1 200 r/min)、PBS緩沖液的溫度(30、40、50、60、70、80 ℃)、PBS緩沖液的pH值(5.8、6.2、6.6、7.0、7.4、7.8)等因素進行研究。在單因素實驗的基礎上，通過SPSS 20.0對實驗數(shù)據(jù)進行顯著性和極差分析，選取膽固醇添加量、檸檬烯添加量、PBS緩沖液的溫度3個主要影響因素，采用響應面分析法優(yōu)化檸檬烯脂質體的制備工藝，試驗設計見表1。

表1 響應面試驗設計因素及水平Table 1 The factor and levels of response surfaceoptimization experiment

1.3.6 驗證實驗

根據(jù)優(yōu)化后的最佳工藝，重新制備檸檬烯脂質體，對包封率進行測定，觀察試驗結果與模型符合情況。

1.3.7 檸檬烯脂質體粒徑及電位的測定

以最佳條件下制備的檸檬烯脂質體作為樣品，用馬爾文Zetasizer Nano-ZEN 3600激光粒度儀在25 ℃測定其粒徑及電位，設定的平衡時間為120 s、間隔時間為10 s，每次掃描3次，取其平均值[12]。

2 結果與分析

2.1 檸檬烯標準曲線

圖1-a即為用1.3.2氣相色譜質譜條件所得檸檬烯的氣相色譜圖。檸檬烯標準曲線如圖1-b所示，檸檬烯濃度在1～100 μg/mL范圍內具有良好的線性相關性。檸檬烯標準曲線回歸方程為Y=46 000X+74 860，R2=0.999 0。

圖1 檸檬烯標準品氣相色譜圖(a)及標準曲線(b)
Fig.1 GC chromatogram (a) and standard curve (b) of limonene standard

2.2 單因素試驗

2.2.1 大豆卵磷脂添加量對檸檬烯脂質體包封率的影響

將大豆卵磷脂添加量設為50、100、150、200、250、300 mg，檸檬烯添加量為10 mg，PBS緩沖溶液溫度為50 ℃，pH為7.0，磁力攪拌器速度為800 r/min，其包封率結果如圖2-a所示。隨著大豆卵磷脂添加量的上升，其包封率呈現(xiàn)先上升后趨于平穩(wěn)的態(tài)勢。當卵磷脂添加量較少時，不足以包封分散在體系中的檸檬烯，故包封率較低；隨著添加量的上升，分散在體系中的卵磷脂足以包封體系中的檸檬烯，并逐漸飽和，當卵磷脂添加量過高時，體系呈乳白色，可能是有部分卵磷脂析出所致，綜合考慮選擇卵磷脂添加量為100 mg。

2.2.2 膽固醇添加量對檸檬烯脂質體包封率的影響

大豆卵磷脂添加量為100 mg，膽固醇添加量為0、5、10、15、20、25 mg，其他條件同2.2.1，包封率結果如圖2-b所示。由圖2-b可知，隨著膽固醇含量的升高，包封率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當大豆卵磷脂和膽固醇的質量比即膜材比為10∶1時，檸檬烯脂質體的包封率達到最大值(63.49±0.83)%。大豆卵磷脂是組成脂質體雙分子層膜的主要成分，但僅有大豆卵磷脂制備的脂質體具有通透性，剛性不足，加入膽固醇可增加脂質體雙分子層的剛性，具有調節(jié)脂質體膜流動性和穩(wěn)定性的功能[13]。少量的膽固醇對檸檬烯脂質體的構建具有重要作用，膽固醇可以穩(wěn)定檸檬烯脂質體的雙分子結構，降低其流動性以及減少檸檬烯的泄漏[14]。但是膽固醇的添加量不宜過高，否則剛性增強，會形成結晶物，破壞脂質體的雙分子層結構，導致檸檬烯泄漏，故包封率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢[15-16]。

2.2.3 檸檬烯添加量對脂質體包封率的影響

將檸檬烯的添加量分別設為5、10、15、20、25、30 mg，膽固醇添加量為10 mg，其他條件同2.2.2，制備檸檬烯脂質體，其包封率結果如圖2-c所示。由圖2-c可見，隨著檸檬烯添加量的增大，脂質體的包封率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當檸檬烯的添加量為10 mg時，脂質體包封率達到(64.23±0.87)%的最高水平，但隨著檸檬烯添加量的進一步升高包封率呈下降趨勢。其原因為當溶質分子的濃度太低時，增加了脂質體在形成過程中對檸檬烯分子的“捕捉”難度[17-18]，導致包封率較低。隨著檸檬烯添加量的進一步升高，推測由于一定量的磷脂所形成的脂質體對檸檬烯的包封能力是有限的，當檸檬烯含量超過脂質膜的飽和度[19]時，其包封率也會下降，故實驗選取檸檬烯添加量為10 mg。

2.2.4 PBS的溫度對檸檬烯脂質體包封率的影響

當檸檬烯添加量為10 mg，其他條件同2.2.3，改變PBS的溫度分別為30、40、50、60、70、80 ℃，制備檸檬烯脂質體，并測定脂質體的包封率。由圖2-d可知，隨著PBS緩沖液的溫度升高，脂質體的包封率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當PBS的溫度為50 ℃時，包封率最高，為(65.69±1.06)%。因為每一種磷脂都有其自身的相變溫度，它也是組成磷脂的?；溣晒虘B(tài)向液態(tài)過渡時的溫度，磷脂膜的物理性質與其水化介質的溫度密切相關，故必須使PBS的溫度高于磷脂的相變溫度，才能使脂質體在液晶條件下進行，但溫度過高又會加速大豆卵磷脂的氧化及引起被包封物的氧化降解[19-20]。同時對于脂溶性物質，檸檬烯被包埋在脂質膜中，當PBS溫度低于磷脂的相變溫度時，檸檬烯無法進入到脂質雙分子層中，導致包封率降低；但PBS溫度過高，又會直接導致檸檬烯的揮發(fā)增強，損失增大，且膜的通透性也增加，導致檸檬烯的泄漏增加，故實驗選擇PBS溫度為50 ℃。

2.2.5 磁力攪拌速度對檸檬烯脂質體的影響

將PBS溫度設為50 ℃，其他條件同2.2.4，調整磁力攪拌器速度分別為：200、400、600、800、1 000、1 200 r/min，制備檸檬烯脂質體，并測定檸檬烯脂質體的包封率。由圖2-e可知，隨著攪拌速度的增加脂質體包封率處于先上升后逐漸穩(wěn)定在一定范圍內，當攪拌速度在600～1 200 r/min范圍內，脂質體的包封率較高，其原因可能是因為磁力攪拌器的速度快慢直接影響體系內脂質的分散及水合[21]，當攪拌速度過慢時，PBS緩沖溶液不足以均勻分散磷脂乙醇溶液，使得包封率較低；隨著攪拌速度加快，脂質體系分散較均勻，包封率隨之提高，但若攪拌速度過快又易產生較多泡沫，綜合考慮選擇磁力攪拌速度為800 r/min。

2.2.6 PBS的pH值對檸檬烯脂質體包封率的影響

將攪拌速度設為800 r/min，其他條件同2.2.5，依次改變PBS的pH值為5.8、6.2、6.6、7.0、7.4、7.8，制備檸檬烯脂質體，并測定脂質體的包封率。由圖2-f可以看出，隨著PBS的pH值增大，其脂質體的包封率呈先上升后下降趨勢。當PBS的pH值為7.4時，檸檬烯脂質體的包封率最高，為(66.49±0.53)%。由于脂質體的膜材選擇為大豆卵磷脂，其中帶有多種不同極性頭部的雜質分子，因本身電荷的排斥和吸引而影響脂質體的穩(wěn)定性。過酸或過堿均會使脂質體對H+或者OH-有較多的吸附而導致負荷過重，影響包封率[22]，故實驗選取PBS的pH值為7.4。

圖2 不同因素對檸檬烯脂質體包封率的影響
Fig.2 Effect of different factors on encapsulation efficiency of limonene liposomes

2.3 響應面實驗結果

對表2中所得實驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到以包封率為目標函數(shù)的二次回歸方程為：Y=66.05-1.96A+3.01B+1.16C-1.49AB-0.14AC-0.90BC-5.60A2-3.02B2-3.83C2，對該模型進行回歸方差分析，結果見表3。模型p<0.000 1，表示模型極顯著，該試驗方法可靠；失擬項p=0.167 2>0.05，不顯著，說明回歸方程與實測值擬合較好。模型相關系數(shù)R2=0.978 6，說明該模型能較好地描述試驗結果。因此可以用此模型來分析和預測檸檬烯脂質體的響應面工藝結果。由表3可知該模型中A、B、AB、A2、B2、C2達到極顯著水平，C達到顯著水平。3個因素對脂質體包封率的影響順序為檸檬烯添加量>膽固醇添加量>PBS的溫度。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Box-Behnken experimental design arrangementand corresponding results

表3 響應面二次模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for responsesurface quadratic model

注：p<0.05為顯著水平，用“*”表示；p<0.01為極顯著水平，用“**”表示。

2.4 響應面工藝優(yōu)化分析

利用Design-Expert軟件得出兩兩因素對脂質體包封率影響的響應曲面圖和等高線圖，如圖3所示。圖3-a曲線的陡峭程度最大，表示檸檬烯添加量、膽固醇添加量這2個因素對包封率的影響較大，這與單因素的實驗結果相一致。隨著檸檬烯添加量的變化，其響應面曲面較陡峭；隨著膽固醇添加量的變化呈弧形，弧度較大，在兩者交互作用中，檸檬烯的添加量占主導作用，且等高線呈現(xiàn)明顯的橢圓形，表明兩因素的交互作用明顯[23-24]。同理，由圖3-b可知,隨著水合溫度的變化，響應面曲面較為光滑，膽固醇添加量對脂質體包封率的影響更為顯著，在兩者的交互作用中占主導作用，但二者交互作用不顯著。由圖3-c可知檸檬烯添加量以及PBS緩沖液的溫度，以及二者交互作用對檸檬烯脂質體包封率的影響。隨著檸檬烯添加量的變化，其響應面曲面較陡峭；隨著PBS緩沖液溫度的變化，其響應面曲面較為平緩，弧度較小。檸檬烯在兩者的交互作用占主導作用，二者交互作用不顯著。根據(jù)模型所預測的最優(yōu)工藝條件為：膽固醇添加量為8.75 mg，檸檬烯添加量為12.73 mg，溫度為50.91 ℃，在此條件下所制備的檸檬烯脂質體的包封率為67.17%。

圖3 兩兩因素交互作用對檸檬烯納米脂質體包封率影響的響應面圖和等高線圖
Fig.3 Response surface and contour plots showing the pairwise interactive effects of different conditions on encapsulation efficiency of limonene nanolipsomes

2.5 驗證實驗

為了操作便利，將最佳條件調整為：膽固醇添加量為8.8 mg，檸檬烯添加量為12.7 mg，PBS溫度為51 ℃，在此條件下進行3次平行實驗，所得檸檬烯脂質體的平均包封率為(67.44±0.58)%，與理論預測值的相對誤差為0.4%，直接反應了脂質體對檸檬烯的包封效果較好。

2.6 檸檬烯脂質體外觀形態(tài)、粒徑和Zeta電位檢測

由圖4-a可知，檸檬烯脂質體外觀呈半透明狀態(tài)，并伴有淡藍色乳光。粒徑尺寸以及分布通常作為衡量納米脂質體穩(wěn)定性的一個重要指標，PDI是指脂質體粒徑的多分散性指數(shù)，PDI越小表示脂質體直徑分散越均勻、集中，PDI數(shù)值在0～0.3之間表明體系具有均勻的分散性[25-26]。最佳工藝條件下制備的檸檬烯脂質體的平均粒徑為(165.4±2.08)nm，平均多分散指數(shù)為(0.185±0.011)，這表明粒徑均勻性良好。響應面工藝優(yōu)化后所制得的檸檬烯脂質體，其Zeta電位為(-16.23±0.569)mV，見圖4-c。Zeta電位越大表示脂質體雙分子膜表面所帶的電荷越多，聚集時所需要克服的靜電斥力就越大，較大的Zeta電位可以阻礙脂質體溶液中的微粒發(fā)生凝聚[24, 27]。因此，綜合分析粒徑、PDI及Zeta電位，可以初步推測檸檬烯脂質體具有較好的穩(wěn)定性。

圖4 檸檬烯納米脂質體的外觀(a)、平均粒徑(b)及Zeta電位(c)
Fig.4 The extrinsic feature(a)、particle size(b) and zeta potential (c) of limonene nanoliposome

3 結論

脂質體作為一種人工膜，既可包埋親水性物質又可包埋疏水性物質，且安全、無毒副作用，具有良好的生物相容性[28]。本研究以乙醇注入法制備檸檬烯脂質體，并用響應面法進行優(yōu)化得到最佳制備條件：膽固醇添加量為8.8 mg、檸檬烯添加量為12.7 mg、PBS緩沖溶液的溫度為51 ℃，所制備的檸檬烯脂質體的包封率為(67.44±0.58)%，平均粒徑為(165.4±2.08)nm，PDI為(0.185±0.011)，平均電位為(-16.23±0.569)mV。通過制備檸檬烯脂質體，不僅可以保護被包埋的檸檬烯，提高檸檬烯的穩(wěn)定性，減少檸檬烯的揮發(fā)和氧化，更為檸檬烯在食品添加劑、藥品、功能食品等領域的進一步研究和應用提供了可能性，具有重要的現(xiàn)實指導意義。