不同濃度環(huán)孢菌素A處理對牛肉宰后成熟過程中品質(zhì)及細(xì)胞凋亡因子的影響

馬秀利，王琳琳，韓玲*，余群力，殷元虎，韓廣星，朱躍明

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070) 2(黑龍江省畜牧研究所，黑龍江 齊齊哈爾，161005) 3(山東綠潤食品有限公司，山東 臨沂，276600) 4(張掖市萬禾草畜產(chǎn)業(yè)科技開發(fā)有限責(zé)任公司，甘肅 張掖，734000)

宰后成熟是肌肉在內(nèi)環(huán)境改變條件下發(fā)生的復(fù)雜的生理生化反應(yīng)過程，可提高肌肉品質(zhì)，尤其能有效改善肌肉的嫩度及風(fēng)味。目前關(guān)于宰后肌肉成熟嫩化的主要理論是肌肉結(jié)構(gòu)變化及肌原纖維骨架蛋白的有限降解而使肌肉嫩化[1]。隨著肉品理論的不斷發(fā)展與完善，繼組織蛋白酶和鈣激活酶之后，細(xì)胞凋亡酶(Caspases)降解肌原纖維蛋白理論逐漸被認(rèn)為是改善宰后肌肉嫩度的重要因素。CsA是一種從真菌中提取的含有11個(gè)氨基酸的環(huán)多肽，具有強(qiáng)烈的特異性作用[2]。大量研究表明CsA對細(xì)胞凋亡(apoptosis)的發(fā)生具有一定的調(diào)節(jié)作用，它能夠與線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(mitochondrial permeability transport pore，MPTP)的結(jié)構(gòu)蛋白親環(huán)素D相互作用，通過調(diào)節(jié)MPTP的開放，間接調(diào)節(jié)Cyt-c從線粒體釋放到胞漿中，進(jìn)一步調(diào)節(jié)apoptosis級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生[3-4]。

Apoptosis又稱細(xì)胞程序性死亡，其在生物體的進(jìn)化、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定以及多個(gè)系統(tǒng)的發(fā)育中起重要作用[5]。Apoptosis對肌肉的嫩化作用是近年來肉品科學(xué)研究的熱點(diǎn)，尤其在apoptosis對肌原纖維蛋白降解方面國內(nèi)外學(xué)者做了大量研究。陳琳[6]研究指出凋亡誘導(dǎo)劑喜樹堿、依托泊苷及Ca2+均能提高肌原纖維的水解；HUANG等[7]利用Caspase-3的選擇性抑制劑DEVE-CHO處理宰后肌肉時(shí)發(fā)現(xiàn)，DEVE-CHO可以抑制肌肉骨架蛋白的降解，以上研究說明Caspases能夠降解肌細(xì)胞骨架蛋白進(jìn)而改善肌肉嫩度。此外，賈青[8]、孫志昶等[9]、ZHANG等[10]研究發(fā)現(xiàn)apoptosis與其他肉品質(zhì)特征如保水性、色澤顯著相關(guān)。有關(guān)Caspases對宰后肌肉嫩度改善的相關(guān)研究報(bào)道較多，但有關(guān)MPTP抑制劑CsA對宰后肌肉apoptosis的發(fā)生及其對肌肉品質(zhì)影響機(jī)制的相關(guān)研究，國內(nèi)外鮮有報(bào)道。

本研究以不同濃度CsA溶液處理的牛背最長肌肉樣為研究對象，通過測定肌肉宰后成熟過程中品質(zhì)指標(biāo)(pH值、色澤、保水性及嫩度)和apoptosis因子(胞漿Cyt-c含量、Caspase-9、Caspase-3活性)等指標(biāo)的變化，研究CsA處理對apoptosis的影響作用，并探究apoptosis的發(fā)生對宰后肌肉品質(zhì)的影響，以期為apoptosis改善肌肉品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

試驗(yàn)材料：肉牛由張掖博峰肥牛開發(fā)有限公司提供，選擇在同一牧場，生長發(fā)育正常，健康無病，體重均勻，平均年齡2～4 歲的肉牛8頭，公母各半，宰前禁食16～18 h，禁水2 h，屠宰后立即取牛胴體中部背最長肌肉樣，置于0～4 ℃環(huán)境下成熟。

試驗(yàn)試劑：Caspase-9、3活性測定試劑盒，北京普利萊基因技術(shù)有限公司；環(huán)孢菌素A、細(xì)胞色素C、二甲基亞砜、連二亞硫酸鈉、蔗糖、乙基苯基聚乙二醇、2-氨基-2(羥甲基)-l,3-丙二醇(Tris)、酒石酸鉀鈉、KCl、MgCl2、EDTA、K3PO4、NaN3、CuSO4、HCl、NaCl等，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16M型離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；XHF-D-型高速分散器(內(nèi)切式勻漿機(jī))，寧波新芝生物科技股份有限公司；FA2004B型電子天平，上海佑科儀器有限公司；C-LM4 型數(shù)顯式肌肉嫩度儀，上海精密科學(xué)儀器有限公司；SPectramax M2型酶標(biāo)儀，美國美谷分子儀器有限公司；DNP-9162型水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；CR-10型色差計(jì)，柯尼美能達(dá)有限公司；HI99163型便攜式pH計(jì)，意大利哈納HANNA儀器公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品采集與處理

宰后立即取牛胴體中部背最長肌肉樣，去除表面脂肪、筋腱及結(jié)締組織后，分割為每塊100 g左右的肉樣，按照肉液比10∶1的比例，將4種濃度0.10、0.20、0.25、0.30 mol/L 的CsA溶液均勻注射進(jìn)肉塊中，不作任何處理的肉樣為對照組；采用托盤包裝，在0～4 ℃環(huán)境下成熟。在成熟時(shí)間點(diǎn)12、24、48、96及144 h分別測定pH值、肉色、蒸煮損失及剪切力等指標(biāo)，測定之前用濾紙吸去肉樣滲出的汁液，對于肌原纖維小片化指數(shù)(MFI)、胞漿Cyt-c含量及Caspase-9、3活力等不便立即測定的指標(biāo)，將肉樣在設(shè)計(jì)時(shí)間點(diǎn)采集并用液氮迅速冷卻后置于-80 ℃凍藏待測。

1.3.2 pH值測定

將便攜式pH計(jì)的探針插入肉樣中，使pH計(jì)的電極與肌肉組織充分接觸，讀數(shù)穩(wěn)定后記錄數(shù)據(jù)，每個(gè)肉樣重復(fù)測定3次，取平均值。

1.3.3 肉色測定

測定肉樣表面的L*值、a*值和b*值，將肉樣切開形成新的橫斷面并在室溫下氧合40 min，色差計(jì)進(jìn)行白板校正后，將色差儀探頭垂直放在樣品橫斷面上進(jìn)行測量，每個(gè)肉樣重復(fù)測定3次，取平均值作為該肉樣的色差值。

1.3.4 蒸煮損失

將長×寬×高不少于6 cm×3 cm×3 cm的肉樣，修整去除肉塊表面的脂肪和結(jié)締組織，稱重記為Ma，80 ℃恒溫水浴加熱，用數(shù)顯溫度計(jì)記錄加熱過程中肉塊的中心溫度。當(dāng)中心溫度達(dá)到75 ℃時(shí)，恒溫保持5 min后取出冷卻至室溫，再次稱重記為Mb，蒸煮損失計(jì)算公式為：

蒸煮損失/%=(Ma-Mb)/Mb×100

(1)

式中：Ma為蒸煮前肉樣質(zhì)量；Mb為蒸煮后肉樣質(zhì)量。

1.3.5 嫩度

1.3.5.1 剪切力

剪切力肉樣處理方法同蒸煮損失測定方法，用剪切力儀測定剪切力，每組重復(fù)3次，取平均值。

1.3.5.2 MFI

參考DELGADO等[11]的方法并稍作修改。測定取2 g肉樣，加20 mL的MFI緩沖液(100 mmol/L KCl、20 mmol/L K3PO4、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L NaN3，pH 7.1)，然后勻漿(10 000 r/min，勻漿時(shí)間12 s/次，間隙30 s，連續(xù)5次，在冰水浴下進(jìn)行)。勻漿液在4 ℃條件下1 000×g離心15 min，棄去上清液。沉淀用8 mL的MFI緩沖液懸濁、再離心，棄去上清液。沉淀用5 mL的MFI緩沖液，用200目尼龍篩網(wǎng)過濾該懸濁液，另用5 mL MFI緩沖液幫助肌原纖維蛋白通過濾網(wǎng)。過濾所得的肌原纖維蛋白懸濁液用雙縮脲法測定其蛋白含量，然后用MFI緩沖液將其質(zhì)量濃度稀釋至0.5 mg/mL，然后在540 nm下測定其吸光度，將結(jié)果乘以200，即為MFI。

1.3.6 胞漿Cyt-c含量

參考辛國榮等[12](2007)方法并稍作修改。取組織塊在冷水的生理鹽水中漂洗除去血液，濾紙拭干，稱重。加預(yù)冷勻漿介質(zhì)(pH 7.4，0.1 mol/L Tris-HCl，1 mmol/L KCl，1 mmol/L EDTA-2Na，0.25 mol/L蔗糖(均用去離子水配制)的體積總量是組織塊重量的9倍，進(jìn)行組織勻漿(10 000 r/min，勻漿時(shí)間12 s/次，間隙30 s，連續(xù)5次，在冰水浴下進(jìn)行)。勻漿液經(jīng)離心(2 000 r/min，10 min)，棄沉淀。取上清液以18 000 r/min(低溫高速離心機(jī))離心15 min，上清液即為胞漿。取4 mL待測胞漿樣品，加少許連二亞硫酸鈉(0.025 g)，振搖后，在520 nm處測定吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度。

1.3.7 Caspase活力

1.3.7.1 Caspase-9活力

按照Caspase-9活性檢測試劑盒說明書對Caspase-9的活性進(jìn)行測定，并稍作修改。取90 mg組織肉樣，剪碎后加入150 μL Caspase-9裂解液，用玻璃勻漿機(jī)于4 °C勻漿30次。勻漿液于4 ℃，10 000g離心10 min，離心完畢后取上清液待測。取85 μL Caspase-3反應(yīng)緩沖液，10 μL待測上清液，5 μL 2 mm Caspase-9反應(yīng)底物Ac-LEHD-AMC，依次加入96孔酶標(biāo)板中，對照孔加入95 μL反應(yīng)緩沖液，5 μL Caspase-9反應(yīng)底物DEVD-pNA，用封口膜封住，置于37 ℃恒溫箱中反應(yīng)1～2 h，取下封口膜，用酶標(biāo)儀在405 nm處測定吸光度值。

1.3.7.2 Caspase-3活力

按照Caspase-3活性檢測試劑盒說明書對Caspase-3的活性進(jìn)行測定，并稍作修改。樣品處理及操作同Caspase-9活性檢測方法，用酶標(biāo)儀在405 nm處測定吸光度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果均采用平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，多重比較分析采用Duncan法(p<0.05)，用Origin 8.5作圖軟件進(jìn)行圖形制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度CsA處理對肌肉pH值的影響

由圖1可知，隨著成熟時(shí)間的延長，對照組及處理組pH值均呈先下降后上升的變化趨勢。對照組pH值在宰后96 h下降到最小值為5.56，隨后緩慢上升(p<0.05)；處理組pH值在96 h下降到最小值，隨后緩慢上升(p<0.05)。12～48 h，處理組pH值均高于對照組，且pH值隨CsA濃度的增加而升高，但0.25 mol/L處理組pH值均高于其他處理組，且0.10和0.20 mol/L處理組、0.25和0.30 mol/L處理組的pH值無顯著差異(p>0.05)。

圖1 不同濃度CsA處理對肌肉pH值的影響
Fig.1 Effect of different concentrations of CsA treatment on pH value of muscle
注：圖中不同字母表示同一時(shí)間點(diǎn)不同處理濃度的差異顯著(p<0.05)，下同。

2.2 不同濃度CsA處理對肌肉色度的影響

肉色是消費(fèi)者評定肌肉外觀的重要指標(biāo)，其與肌紅蛋白含量、肌纖維類型和狀態(tài)及水分分布有很大關(guān)系[13]。由圖2可知，隨著宰后成熟時(shí)間的延長，對照組及處理組L*值、a*值、b*值均呈先上升后下降的變化趨勢。對照組L*值、b*值均在96 h達(dá)到最大值，隨后L*值顯著下降(p<0.05)；對照組a*值在宰后24 h達(dá)到最大值19.77，隨后呈下降趨勢，但差異不顯著(p>0.05)。處理組L*值均在宰后48 h達(dá)到最大值，按濃度遞增順序L*值峰值分別為37.01、38.87、39.80、39.37，隨后顯著下降(p<0.05)；12～48 h，處理組的L*值均高于對照組，且0.25 mol/L處理組L*值均高于其他處理組，但各處理組L*值差異不顯著(p>0.05)。處理組b*值變化情況與L*值變化情況類似，在宰后48 h達(dá)到最大值，隨后顯著下降(p<0.05)；12～48 h內(nèi)，處理組b*值均高于對照組，且b*值的上升呈溶液濃度依賴變化，但0.25 mol/L處理組b*值均高于其他處理組。處理組a*值在宰后24 h達(dá)到最大值，隨后顯著下降(p<0.05)。12～96 h，對照組a*值均高于各處理組，且隨處理濃度的增加a*值呈下降趨勢，0.10 mol/L處理組a*值在12～96 h內(nèi)均高于其他處理組，0.30 mol/L處理組a*值在12～48 h均低于其他處理組a*值，但差異不顯著。

圖2 不同濃度CsA處理對肌肉L*(A)、a*(B)、b*(C)值的影響
Fig.2 Effects of different concentrations of CsA treatment on L*(A), a*(B), b*(C) value of muscle

2.3 不同濃度CsA處理對肌肉蒸煮損失的影響

由圖3可以看出，對照組及處理組蒸煮損失呈先上升后下降的變化趨勢。12～96 h內(nèi)，對照組蒸煮損失顯著上升，并達(dá)到最大值為34.21%，隨后顯著下降(p<0.05)；0.10和0.30 mol/L 處理組蒸煮損失在96 h顯著上升并達(dá)到最大值分別為35.65%、38.31%，隨后顯著下降(p<0.05)，0.25 mol/L和0.25 mol/L處理組蒸煮損失在48 h達(dá)到最大值分別為36.34%、38.87%，隨后顯著下降(p<0.05)。在12～144 h，處理組蒸煮損失均顯著高于對照組，除0.30 mol/L處理組外，12～48 h，0.25 mol/L處理組蒸煮損失均高于其他處理組，且各處理組之間蒸煮損失無顯著差異(p>0.05)。

圖3 不同濃度CsA處理對肌肉蒸煮損失的影響
Fig.3 Effects of different concentrations of CsA treatment on the cooking loss of muscle

2.4 不同濃度CsA處理對肌肉嫩度的影響

剪切力是肉嫩度最直接的反映，肌肉越嫩其剪切力越低。MFI代表肌原纖維蛋白被降解及肌原纖維結(jié)構(gòu)破壞的程度，能夠反映出肌肉成熟進(jìn)行的程度[14]。由表1可以看出，隨著宰后成熟時(shí)間的延長，對照組及處理組剪切力均呈先上升后下降的變化。對照組剪切力在96 h達(dá)到最大值8.39 kgf，隨后顯著下降(p<0.05)；各處理組剪切力在宰后96 h也均達(dá)到最大值，按濃度遞增順序，依次為8.66、9.19、9.90和10.00 kgf，隨后顯著下降(p<0.05)。12～144 h，0.3 mol/L處理組剪切力均高于其他處理組，0.10 mol/L處理組剪切力在各時(shí)間點(diǎn)均顯著低于其他處理組(p<0.05)，且隨CsA處理濃度增加剪切力增大。

表1 不同濃度CsA處理對肌肉剪切力和MFI的影響Table 1 Effects of different concentrations of CsA treatment on the shear force and MFI of muscle

注：同列不同字母表示差異顯著(p<0.05)，下同。

說明剪切力的變化呈CsA處理濃度依賴變化。由表1可知，在整個(gè)成熟過程中，對照組及處理組MFI均呈顯著上升趨勢(p<0.05)。宰后144 h，對照組MFI顯著上升到最大值72.30(p<0.05)；處理組MFI均達(dá)到最大值，按濃度遞增的順序分別為65.07、63.00、62.13、60.32(p<0.05)，說明MFI的變化呈濃度依賴變化。12～144 h，處理組MFI均低于對照組MFI，且隨CsA處理濃度增加MFI呈下降趨勢，12～96 h，0.30 mol/L處理組MFI均低于其他處理組，0.10 mol/L處理組MFI均高于其他處理組。

2.5 不同濃度CsA處理對肌肉胞漿Cyt-c含量的影響

Cyt-c是細(xì)胞凋亡途徑中的凋亡誘導(dǎo)因子，在細(xì)胞發(fā)生凋亡過程中起重要作用[15]。由表2可以看出，隨著成熟時(shí)間的延長，對照組胞漿Cyt-c含量呈先顯著下降后顯著上升的趨勢(p<0.05)，CsA處理組胞漿Cyt-c含量呈逐漸增加的趨勢(p<0.05)。宰后12～24 h，對照組胞漿Cyt-c含量顯著下降并達(dá)到最小值0.48 mmol/L，隨后顯著上升(p<0.05)；宰后12～144 h，處理組胞漿Cyt-c含量均達(dá)到最大值，按濃度遞增的順序胞漿Cyt-c含量分別為0.58、0.56、0.55、0.51 mmol/L。宰后12～144 h，除24 h外，處理組胞漿Cyt-c含量均低于對照組，且隨CsA處理濃度增加而降低；48～144 h，0.30 mol/L處理組胞漿Cyt-c含量均低于其他處理組，且0.10 mol/L處理組Cyt-c含量變化與之相反；除0.10 mol/L處理組外，各處理組胞漿Cyt-c含量在成熟期間無顯著差異(p>0.05)。

表2 不同濃度CsA處理對肌肉胞漿Cyt-c含量的影響Table 2 Effects of different concentrations of CsA treatment on cytoplasm Cyt-c content in muscle

2.6 不同濃度CsA處理對肌肉Caspase活力的影響

在細(xì)胞凋亡的線粒體途徑中，Caspase-9作為凋亡的啟動(dòng)因子，它可召集并激活凋亡效應(yīng)酶Caspase-3[5]。由圖4-A可以看出，隨著成熟時(shí)間的延長，對照組Caspase-9活性呈顯著下降的趨勢，CsA處理組Caspase-9活性均呈先顯著上升后顯著下降的趨勢(p<0.05)。0.10和0.20 mol/L處理組Caspase-9活性在24 h顯著上升并達(dá)到最大值分別為1.414、1.302，0.25和0.30 mol/L處理組Caspase-9活性在48 h達(dá)到最大值分別為1.239、1.220，隨后顯著下降(p<0.05)。12～24 h，處理組Caspase-9活性均低于對照組，且隨CsA處理濃度增加而降低，在48 h，處理組Caspase-9活性顯著高于對照組(p<0.05)；48～144 h，0.20 mol/L處理組Caspase-9活性降低速率均高于其他處理組，處理組Caspase-9活性降低速率隨CsA處理濃度增加而降低。在整個(gè)成熟過程中，對照組及處理組Caspase-3活性均呈先顯著上升后顯著下降的趨勢(p<0.05)(圖4-B)。宰后12～24 h，對照組Caspase-3活性顯著上升并達(dá)到最大值3.051，隨后顯著下降(p<0.05)；宰后12～48 h，處理組Caspase-3活性均達(dá)到最大值，按濃度遞增的順序Caspase-3活性分別為2.815、2.637、2.530、2.628，隨后顯著下降(p<0.05)。12～24 h，處理組Caspase-3活性均低于對照組，且隨CsA處理濃度增加而降低，在48 h，處理組Caspase-3活性顯著高于對照組；48～96 h，0.10 mol/L處理組Caspase-3活性降低速率均高于其他處理組，處理組Caspase-3活性降低速率隨CsA處理濃度增加而降低，12～48 h，0.30 mol/L處理組Caspase-3活性均低于其他處理組，且0.10 mol/L處理組Caspase-3活性變化與之相反；12～144 h，0.25及0.30 mol/L處理組Caspase-3活性無顯著差異。

圖4 不同濃度CsA處理對肌肉Caspase-9(A)和 Caspase-3(B)活力的影響
Fig.4 Effects of different concentrations of CsA treatment on Caspase-9 (A) and Caspase-3 (B) activity in muscle

3 討論

在成熟過程中，肌肉pH值呈先下降后緩慢上升的變化，原因可能是宰后缺血、缺氧環(huán)境，導(dǎo)致肌糖原無氧酵解產(chǎn)生乳酸及ATP分解產(chǎn)生磷酸根離子而使肌肉內(nèi)酸性環(huán)境變化[16]。肌肉成熟過程中，因pH值、活性氧等變化導(dǎo)致線粒體Ca2+超載等的作用可引起線粒體外膜通透性增大，進(jìn)一步使線粒體Cyt-c釋放至胞漿[17-18]；注射不同濃度的CsA溶液使宰后肌肉MPTP關(guān)閉，維持了滲透壓及H+濃度的變化，限制了Cyt-c的釋放，并在一定程度上維持了有氧呼吸鏈完整，使得pH值下降緩慢，且濃度越高pH值下降越緩慢，但是當(dāng)處理濃度達(dá)到0.30 mol/L時(shí)，pH值下降加快，這可能與CsA濃度增高促進(jìn)非依賴性apoptosis途徑有關(guān)。

在宰后成熟過程中，對照組L*值、a*值和b*值均呈先上升后下降的變化趨勢。L*值增大可能是由于肌肉內(nèi)部水分滲出，堆積于肌肉的表面，增加了肌肉對光的反射能力[19]；脫氧肌紅蛋白暴露在空氣中迅速氧合，進(jìn)而氧合肌紅蛋白的比例逐漸升高，肉色變得亮紅而導(dǎo)致a*值、b*值上升[20]；隨著貯藏時(shí)間延長，氧合肌紅蛋白自動(dòng)氧化，產(chǎn)生灰褐色的高鐵肌紅蛋白使肉色變暗導(dǎo)致L*值、a*值及b*值均呈下降趨勢，這與田甲春等[21]研究的宰后牛肉成熟過程中色澤變化情況類似。注射不同濃度的CsA溶液使宰后牛肉表面水分滲出嚴(yán)重、色素流失增加，導(dǎo)致牛肉變暗變黃，且濃度越高此現(xiàn)象越明顯。注射CsA溶液使肌肉的L*值高于對照組，a*值較對照組低、b*值較對照組高，這是注射CsA溶液后，肉樣中氧氣含量變化以及蛋白變性使得a*值降低、b*值增加。這與賈青[8]研究的向宰后牦牛肉中注射Caspase-3專一抑制劑DEVE后L*值和b*值升高、a*值降低結(jié)果一致。

宰后牛肉的蒸煮損失呈先上升后下降的趨勢。注射不同濃度CsA溶液使pH值下降減緩，極限值升高，同時(shí)部分蛋白質(zhì)變性，外源溶液注入而使蒸煮損失增加，且濃度越高蒸煮損失越嚴(yán)重。OFFER等[22]研究發(fā)現(xiàn)在宰后成熟過程中，乳酸積累導(dǎo)致肉中的pH值下降并達(dá)到等電點(diǎn)時(shí)，能被蛋白質(zhì)吸附和保持的水分減少，肌原纖維內(nèi)部結(jié)構(gòu)的排斥力減少，肌原纖維內(nèi)部空間減小，導(dǎo)致水分流失嚴(yán)重，這與本研究對照組的研究結(jié)果相一致。

宰后牛肉成熟過程中剪切力呈先上升后下降的趨勢，這是宰后成熟過程中會(huì)發(fā)生尸僵導(dǎo)致肌肉收縮和內(nèi)源酶作用解僵共同作用的結(jié)果[23]。MFI是肌原纖維降解情況的直接反映，隨著成熟時(shí)間的延長，蛋白質(zhì)不斷降解產(chǎn)生小片段使得MFI不斷增加[24]。本研究中對照組剪切力和MFI變化情況與王莉[25]、TAN等[14]研究結(jié)果相類似。注射不同濃度CsA溶液后，剪切力高于對照組，MFI低于對照組，可能是由于CsA使蛋白降解速度變慢、解僵時(shí)間增加以及部分蛋白發(fā)生變性，故剪切力較高、MFI較低；隨著成熟時(shí)間增加，在內(nèi)源酶的作用下，使成熟后期剪切力下降、MFI繼續(xù)上升。

宰后牛肉成熟過程中，胞漿中Cyt-c含量呈先下降后上升變化趨勢、Caspase-9活性呈逐漸下降的趨勢、Caspase-3活性呈先上升后下降變化趨勢。這是由于宰后早期肌肉缺氧使得線粒體通透性增加，Cyt-c釋放到胞漿使得胞漿Cyt-c含量增加，然后胞漿中Cyt-c與Apaf-1、Caspase-9前體、ATP/dATP結(jié)合成凋亡小體復(fù)合物，活化Caspase-9，進(jìn)而活化Caspase-3[26-28]；由于本實(shí)驗(yàn)測定時(shí)間起始點(diǎn)是牛肉宰后12 h，肌纖維缺氧，胞漿Cyt-c含量較高，Caspase-9被活化而活性較高，而Caspase-3被Caspase-9激活時(shí)間短活性較低，隨著成熟時(shí)間延長，線粒體結(jié)構(gòu)遭到破壞、膜通透性進(jìn)一步增加，CsA抑制作用也減弱，ATP大量消耗，胞漿中Cyt-c含量大量增加，Caspase-9，Caspase-3活性均降低[29]；對照組與曹錦軒[30]、王琳琳等[31]研究結(jié)果類似，同時(shí)也能反映出Caspase-9，Caspase-3被激活的先后順序。本研究中注射不同濃度CsA溶液后，胞漿中Cyt-c含量逐漸增加，但含量低于對照組，Caspase-9、Caspase-3活性先上升后下降，這是由于CsA致使肌肉線粒體MPTP開放程度不同，限制了Cyt-c釋放入胞漿，同時(shí)胞漿中Cyt-c與Apaf-1結(jié)合成復(fù)合物的時(shí)間和數(shù)量不同，Caspase-9、3活化程度不同，使得Caspase-9、3活性升高緩慢并低于對照組，apoptosis發(fā)生進(jìn)程不同，進(jìn)而對肌肉品質(zhì)的影響存在一定差異。

4 結(jié)論

宰后成熟過程中，肌肉pH值隨CsA溶液濃度增加而升高；隨CsA溶液處理濃度增加，L*值、a*值及b*值均呈先升高后降低的趨勢，L*值和b*值的升高及a*值的降低均呈濃度依賴變化；處理組蒸煮損失均高于對照組，各組肉樣蒸煮損失均在96 h達(dá)到最大值。

宰后成熟過程中，處理組剪切力高于對照組，MFI及低于對照組，且上述指標(biāo)的變化均隨CsA處理濃度的增加呈遞增或遞減的趨勢變化。

在成熟初期，處理組在12～48 h胞漿Cyt-c含量均低于對照組，且隨CsA處理濃度增加胞漿Cyt-c含量下降，處理組在12～24 h Caspase-9、3活性均低于對照組，且隨CsA處理濃度增加Caspase-9、3活性呈下降趨勢；CsA處理能夠影響宰后肌肉的品質(zhì)變化，且各品質(zhì)指標(biāo)的變化均呈濃度依賴趨勢變化，同時(shí)CsA能夠抑制宰后肌肉apoptosis的發(fā)生進(jìn)程。