燕麥發(fā)酵過程中微生物、理化指標(biāo)及活性成分變化規(guī)律

史曉萌，陳建國(guó)*，梁寒峭，程池，趙眾煒，祁永和，王定邦，梁世才

1(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京，100015) 2(甘肅省定西市安定區(qū)政府，甘肅 定西，743000)3(甘肅伊麥坊科技股份有限公司，甘肅 定西，743000)

燕麥屬于禾本科草本植物，包括皮燕麥和裸燕麥(莜麥)。燕麥作為一種全價(jià)營(yíng)養(yǎng)谷物，可滿足當(dāng)代居民對(duì)膳食的更高追求——“營(yíng)養(yǎng)與健康”[1-3]。

甜醅以燕麥或青稞為原料，經(jīng)甜酒曲發(fā)酵而成，色澤黃潤(rùn)，醅粒如果肉，醅汁似糖水，深受甘肅、青海、內(nèi)蒙古等西北地區(qū)人們的喜愛，但我國(guó)甜醅工業(yè)化生產(chǎn)尚屬空白。本文利用甜酒曲純種固態(tài)發(fā)酵燕麥，研究了發(fā)酵過程中微生物、理化指標(biāo)及活性成分的變化規(guī)律，為工業(yè)化生產(chǎn)燕麥甜醅奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

燕麥：甘肅伊麥坊科技股份有限公司提供；甜酒曲：安琪酵母股份有限公司；β-葡聚糖測(cè)定試劑盒(雙酶法)：愛爾蘭Megazyme公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)食品藥品檢定研究院；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品：百靈威科技有限公司；Folin-Ciocalteu試劑：美國(guó)Sigma；葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、無(wú)水乙醇、NaOH、濃HCl、CuSO4、酒石酸鉀鈉等為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)(Avanti J-25),美國(guó)Beckman公司；pH計(jì)(FE20),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9160),上海一恒科學(xué)儀器有限公司；高效液相色譜儀(LC-20AD型,SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器，RID-10A示差檢測(cè)器),日本島津公司；電泳儀(Mini-Protean型),美國(guó)Bio-Rad公司；凝膠成像分析系統(tǒng)(UVP GDS-8000型),美國(guó)UVP公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

精選燕麥→清洗→浸泡→蒸煮→冷卻→接種→裝于容器→發(fā)酵→甜醅樣品[4-5]

燕麥經(jīng)清洗后，先浸泡2 h，再蒸煮1.0 h，冷卻至室溫，加曲2.75 g/kg，于28 ℃分別發(fā)酵0、12、24、36、48、60和72 h。

1.3.2 米根霉和酵母計(jì)數(shù)[6]

1.3.3 理化指標(biāo)測(cè)定

將燕麥甜醅樣品混勻后，取200 g甜醅，加入100 mL蒸餾水(煮沸并冷卻至室溫)，置于組織搗碎機(jī)中粉碎，混勻后置于密閉玻璃容器中。

淀粉酶活力測(cè)定[7-8]：采用DNS比色法測(cè)定淀粉酶活力。酶活力定義：以1 mL酶液在pH 5.5、40 ℃的條件下，1 h水解1.0%淀粉液生成1 μmol葡萄糖為1個(gè)酶活力單位(U)。甜醅樣品中淀粉酶活力以U/100 mg表示。

總酸含量測(cè)定[9]：滴定法。

pH值測(cè)定：pH計(jì)。

還原糖含量測(cè)定[10]：直接滴定法。

1.3.4 還原糖組成分析

色譜柱：Rezex RoA Organic Acid色譜柱(300 mm×7.8 mm，8 mm)，流動(dòng)相：5 mmol/L H2SO4溶液，流速為0.6 mL/min，柱溫80 ℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

1.3.5 蛋白質(zhì)水解情況檢測(cè)

SDS-PAGE法[5]。

1.3.6 活性成分測(cè)定

β-葡聚糖含量測(cè)定[11]：采用β-葡聚糖測(cè)定試劑盒(雙酶法)。

總黃酮含量測(cè)定[12]：NaNO2-Al(NO3)3比色法。

總多酚含量測(cè)定[13]:Folin-Ciocalteu比色法。

總皂苷含量測(cè)定[14]:香草醛-高氯酸比色法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”(n=3)表示，Duncan法進(jìn)行顯著性分析，p<0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 霉酵菌數(shù)、淀粉酶活力及感官評(píng)分變化

如圖1所示，0～24 h，米根霉和酵母生長(zhǎng)較為緩慢，米根霉分泌淀粉酶量較少，糖化發(fā)酵不充分，還原糖含量較低，入口甜味過淡，香味不明顯；24～48 h，隨著米根霉的繁殖，淀粉酶分泌量加大，燕麥淀粉被充分轉(zhuǎn)化為微生物可利用的還原糖，米根霉和酵母菌開始快速繁殖，淀粉酶糖化更充分，且產(chǎn)生更多的風(fēng)味物質(zhì)；48 h時(shí)，米根霉數(shù)量最高，達(dá)到1.35×104CFU/g，淀粉酶活力均達(dá)到峰值(78.83 U/100 mg)，此時(shí)，甜醅入口甘甜，香味純正，顆粒飽滿，感官評(píng)分最高；48～72 h，米根霉菌數(shù)開始衰減，積累的還原糖因大量被酵母利用而明顯下降，酵母菌數(shù)峰值達(dá)1.26×106CFU/g，且發(fā)酵后期燕麥粒飽滿性變差，開始出現(xiàn)黑色孢子斑點(diǎn)，感官評(píng)分逐漸下降。

2.2 還原糖、氨基酸態(tài)氮、總酸和pH值變化

圖1 燕麥甜醅發(fā)酵過程中霉菌-酵母菌數(shù)，淀粉酶活力及感官評(píng)分的變化
Fig.1 Changes of microbial, amylase activity and sensory score in sweet fermented naked oat during fermentation

由圖2-A可知，在12～60 h內(nèi)，甜酒曲中米根霉分泌大量糖化酶，還原糖含量明顯增加，最大值可達(dá)220.3 g/kg，較高的還原糖含量不僅增加了燕麥甜醅的甘甜口感，而且可以延長(zhǎng)甜醅的貯藏時(shí)間[15]。與還原糖變化趨勢(shì)類似，氨基酸態(tài)氮含量先升高后降低。

圖2 燕麥甜醅發(fā)酵過程中還原糖、氨基酸態(tài)氮、總酸和pH值的變化
Fig.2 Changes of reducing sugar, amino nitrogen, total acid and pH in sweet fermented naked oat during fermentation

在0～24 h時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量明顯升高，48 h時(shí)達(dá)到最大值352.0 mg/kg，隨后緩慢降低。燕麥甜醅發(fā)酵過程中，微生物利用蛋白酶系高效地降解燕麥蛋白，不僅分解成自身生長(zhǎng)所需的小分子氮源，而且增加了甜醅產(chǎn)品中游離氨基酸含量，從而豐富了甜醅的風(fēng)味和提高了人體對(duì)燕麥蛋白的利用率[16]。如圖2-B所示，燕麥初始pH值為6.32，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)酵產(chǎn)物pH值明顯下降，最低達(dá)pH值4.73。12～36 h燕麥甜醅發(fā)酵產(chǎn)生的總酸含量隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)總酸含量顯著上升，最高達(dá)4.84 g/kg，之后緩慢下降。燕麥甜醅發(fā)酵過程中pH值、總酸的變化，與米根霉分解燕麥淀粉產(chǎn)生大量有機(jī)酸密切相關(guān)[17]。

2.3 還原糖組成變化

燕麥發(fā)酵過程中米根霉代謝產(chǎn)生糖化酶，將燕麥淀粉水解成大量還原糖，既為發(fā)酵過程中微生物生長(zhǎng)代謝提供碳源，又保證了燕麥甜醅口感的甘甜。如圖3所示，發(fā)酵0 h時(shí)，燕麥原料中只含有3.1 g/kg葡萄糖，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，甜醅樣品中逐漸產(chǎn)生了3種還原糖，以葡萄糖為主，其次為麥芽糖，麥芽三糖最少。12～48 h，葡萄糖含量呈現(xiàn)快速上升趨勢(shì)，48 h達(dá)到峰值，含量為157.2 g/kg，隨后有所減少。而麥芽糖和麥芽三糖含量隨發(fā)酵時(shí)間逐步升高，72 h時(shí)二者含量分別為32.7 g/kg和15.0 g/kg。

圖3 燕麥甜醅發(fā)酵過程中還原糖組成的變化
Fig.3 Changes of reducing sugar composition in sweet fermented naked oat during fermentation

2.4 蛋白質(zhì)水解情況

如圖4所示，發(fā)酵0 h時(shí)，燕麥蛋白在37 kDa處有明顯的條帶a，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，燕麥蛋白條帶a逐漸被水解，0～48 h降解明顯，到48 h時(shí)，燕麥蛋白條帶a被完全降解。從24 h開始，在30 kDa處出現(xiàn)燕麥蛋白條帶b，條帶b處的蛋白含量在24～48 h快速增加，之后逐漸減少。結(jié)果表明,在燕麥甜醅發(fā)酵過程中，大分子燕麥蛋白在微生物蛋白酶作用下逐漸被降解，小分子蛋白逐漸增多[5]。

圖4 燕麥甜醅發(fā)酵過程中蛋白的SDS-PAGE圖
Fig.4 SDS-PAGE patterns of proteins in sweet fermented naked oat during fermentation

2.5 活性成分的變化

圖5所示為燕麥發(fā)酵過程中黃酮、皂苷、多酚和β-葡聚糖的變化規(guī)律。燕麥β-葡聚糖和總皂苷含量分別為20.5 g/kg和323.9 mg/kg，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，β-葡聚糖和總皂苷含量無(wú)明顯變化。燕麥初始多酚含量為233.6 mg/kg，多酚含量隨發(fā)酵時(shí)間呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，36 h后趨于穩(wěn)定，60 h多酚含量最高達(dá)505.2 mg/kg。而黃酮含量有所減少，由最初251.6 mg/kg降至179.0 mg/kg。

圖5 燕麥甜醅發(fā)酵過程中活性成分的變化
Fig.5 Changes of active components in sweet fermented naked oat during fermentation
注：小寫字母不同表示有顯著差異(p<0.05)

3 結(jié)論

本文利用甜酒曲純種固態(tài)發(fā)酵燕麥，解析了燕麥甜醅固態(tài)發(fā)酵過程中微生物、理化指標(biāo)及活性成分的變化規(guī)律。米根霉在發(fā)酵初期(0～24 h)代謝產(chǎn)生糖化酶，將燕麥淀粉轉(zhuǎn)化成大量還原糖和氨基酸態(tài)氮，為后期發(fā)酵提供了充足的碳源和氮源；24～48 h為發(fā)酵中期，總酸顯著升高，pH值明顯降低，有利于抑制雜菌的滋生，同時(shí)米根霉和酵母菌開始快速增殖，淀粉酶活力顯著升高，產(chǎn)生大量葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖以及豐富的風(fēng)味物質(zhì)，賦予甜醅甘甜的口感和純正的發(fā)酵麥香，感官評(píng)分達(dá)到最大值96.50分，為工業(yè)化生產(chǎn)燕麥甜醅過程中發(fā)酵終點(diǎn)的確定提供了科學(xué)依據(jù)；48～72 h為發(fā)酵后期，各項(xiàng)理化指標(biāo)趨于穩(wěn)定，無(wú)顯著變化，但燕麥顆粒飽滿性變差，出現(xiàn)了黑色孢子斑點(diǎn)，降低了感官評(píng)分。整個(gè)發(fā)酵過程中，燕麥甜醅中β-葡聚糖和總皂苷含量無(wú)明顯變化，黃酮含量由251.2 mg/kg減少至179.0 mg/kg，而多酚含量隨發(fā)酵時(shí)間呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，由最初233.6 mg/kg升至505.2 mg/kg。通過SDS-PAGE分析，在0～48 h大分子燕麥蛋白被明顯水解，而小分子蛋白在24～48 h明顯增加。

綜上，控制燕麥發(fā)酵條件對(duì)甜醅產(chǎn)品的質(zhì)量具有重要意義。本試驗(yàn)通過對(duì)燕麥甜醅固態(tài)發(fā)酵過程中霉酵數(shù)量、淀粉酶活力、還原糖、總酸及β-葡聚糖、總皂苷、多酚等指標(biāo)的檢測(cè)分析，為判斷甜醅發(fā)酵終點(diǎn)和控制發(fā)酵過程提供了技術(shù)參數(shù)，為燕麥甜醅的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。