白酒酒醅纖維素降解菌的多樣性分析及其分離篩選

劉茂柯，唐玉明，熊洪，劉穎，蔣鵬，任道群，田新惠，姚萬春

1(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻高粱研究所，四川 德陽，618000) 2(四川省瀘州市釀酒科學(xué)研究所，四川 瀘州，646100)

纖維素是植物光合作用的產(chǎn)物，細(xì)胞壁的重要成分，也是地球上最豐富的可再生性能源之一[1]。纖維素分子是以吡喃葡萄糖苷為單元，由β-1,4-糖苷鍵連接形成的直鏈多糖，通過氫鍵締合形成纖維束[2]。由于分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，自然狀態(tài)難被降解，導(dǎo)致目前大量纖維素資源未得到充分利用[3]。

利用纖維素酶將纖維素降解成可發(fā)酵性糖是利用纖維素資源的有效途徑[1]。纖維素酶是能將纖維素水解成葡萄糖和纖維二糖的一組酶系的總稱[2]，由于其主要由纖維素降解菌在誘導(dǎo)物的作用下產(chǎn)生，選育高效的纖維素降解菌成為了有效利用纖維素資源的關(guān)鍵[1]。雖然已有研究選育的許多菌株顯示出良好的應(yīng)用效果[4-7]，但總體上，我國纖維素酶工業(yè)仍處于初級開發(fā)階段，受酶催化率低、生產(chǎn)成本高和周期長等問題的影響，纖維素酶的制備遠(yuǎn)無法滿足工業(yè)發(fā)展的需要[2]。因此，進(jìn)一步發(fā)掘高活力的纖維素降解菌尤為必要。

白酒釀造環(huán)境具有豐富的微生物資源，是選育高效發(fā)酵菌株的天然寶庫[8-10]。近年研究表明，纖維素降解菌是參與白酒釀造的優(yōu)勢菌群[11-13]。酒醅是釀酒原料經(jīng)微生物發(fā)酵的產(chǎn)物，也是白酒發(fā)酵物質(zhì)能量代謝活動最活躍的反應(yīng)中心[9]。理論上，以酒醅為研究材料更有利于分離高活力的功能菌株。因此，本研究探討白酒酒醅纖維素降解細(xì)菌的群落多樣性，從中篩選高效菌株，旨在為纖維素資源的有效利用提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

酒醅樣本于2017年采自瀘州市某知名白酒企業(yè)。濃香和清香型酒醅樣品分別采自4和3個酒醅堆。采樣方法是以酒醅堆中心為采樣點(diǎn)，取距表層40 cm處酒醅 (50 g)，于 -80 ℃ 保存。

1.2 主要試劑和儀器

化學(xué)試劑 (分析純)、Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、PCR引物：生工生物工程 (上海)股份有限公司；EZNATM總DNA抽提試劑盒：美國Omega公司；PCR儀S1000、DGGE儀DCode Universal Mutation Detection System：美國Bio-Rad公司；PCR試劑、pGEM-T載體、EscherichiacoliJM109：寶生物工程 (大連) 有限公司；分光光度計UV2550：日本Shimadzu公司。

1.3 培養(yǎng)基

羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基 (CMC-Na培養(yǎng)基)[14]、剛果紅培養(yǎng)基[15]、酶活培養(yǎng)基[15]、濾紙液體培養(yǎng)基[14]、LB培養(yǎng)基和秸稈液體培養(yǎng)基。秸稈液體培養(yǎng)基：CMC-Na 10.0 g，蛋白胨 2.0 g，NaCl 0.5 g，K2HPO41.0 g，MgSO4· 7H2O 0.5 g，酵母膏2 g，蒸餾水1 000 mL，添加10 g水稻秸稈或10 g 小麥秸稈。秸稈的制備: 80 ℃烘干至恒重，并剪切成 0.5 cm×1 cm的片狀。LB 培養(yǎng)基：酵母浸出粉5 g，NaCl 10 g，蛋白胨10 g，蒸餾水1 000 mL，瓊脂20 g，pH 7.0。所有培養(yǎng)基121 ℃ 滅菌15 min備用。

1.4 方法

1.4.1 富集培養(yǎng)

將10 g酒醅樣品置于90 mL CMC-Na液體培養(yǎng)基，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)72 h后取菌液2 mL接種于100 mL CMC-Na液體培養(yǎng)基，按上述培養(yǎng)條件傳代。將第3次傳代的富集培養(yǎng)物用于DGGE分析和菌株分離。

1.4.2 酒醅樣品和富集培養(yǎng)物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的DGGE分析

取3 mL 1.4.1的富集培養(yǎng)物于5 mL離心管，8 000 r /min離心去除上清取沉淀物。采用EZNATM總DNA抽提試劑盒分別提取沉淀物和初始酒醅樣品的細(xì)菌DNA。采用引物338F-GC和518R[16]擴(kuò)增 16S rRNA V3區(qū)。PCR反應(yīng)體系 (50 μL) 和擴(kuò)增程序分別參照LIU等[10]和FERROCINO等[17]的報道設(shè)置。PCR產(chǎn)物的DGGE電泳條件：聚丙烯酰胺凝膠濃度8%，變性范圍30%～60% (100%變性劑含7 mol/L尿素，40%去離子甲酰胺)；使用1×TAE緩沖液，100 V電泳10 min進(jìn)膠，200 V、60 ℃ 條件下電泳4 h，銀染法染色。將 DGGE優(yōu)勢條帶回收并用20 μL無菌水浸泡過夜。以浸液為模板，采用引物338F和518R進(jìn)行PCR擴(kuò)增后按文獻(xiàn)[18]的方法克隆，由蘇州金唯智生物科技有限公司測序。測序所得序列在美國生物技術(shù)研究中心 (National Center for Biotechnology, NCBI) 網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對。用 Quantity One軟件對 DGGE 圖譜進(jìn)行數(shù)字化和標(biāo)準(zhǔn)化處理后，進(jìn)行UPGMA聚類分析，計算多樣性指數(shù) (H)[19]。

1.4.3 菌株的篩選與鑒定

取1.4.1中的富集培養(yǎng)物1 mL用無菌水梯度稀釋10-4～10-7。將稀釋液涂布于CMC-Na固體培養(yǎng)基，28 ℃ 恒溫培養(yǎng)72 h，挑單菌落于LB固體培養(yǎng)基劃線純化并保種。參照李靜等[20]的方法，將純化菌株涂布于LB固體培養(yǎng)基制成5 mm菌餅，接種到剛果紅固體培養(yǎng)基，28 ℃ 培養(yǎng)4 d，觀察接菌處是否產(chǎn)生透明圈，根據(jù)透明圈直徑大小初步判斷菌株產(chǎn)纖維素酶的能力，選取透明圈直徑較大的菌株繼續(xù)研究。利用試劑盒提取菌株DNA，采用引物8-27F和1523-1504R進(jìn)行PCR擴(kuò)增[21]并測序。將測序獲得的序列通過 BLAST比對獲取相似度較高的模式菌株序列，用 MEGA 4.0中 Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[22]。

1.4.4 羧甲基纖維素酶 (CMCase) 活力的測定

1.4.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

利用 3, 5-二硝基水楊酸 (DNS) 比色法繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[15]。

1.4.4.2 粗酶液的制備

挑單菌落接種到50 mL酶活培養(yǎng)基，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，于2、3、4、5、6 d分別取發(fā)酵液，6 000 r/min、4 ℃ 離心10 min，取上清即為粗酶液。

1.4.4.3 酶活測定

取0.1 mL粗酶液置于1.9 mL 10 g/L的CMC-Na溶液中，50 ℃恒溫水解30 min，再加入1.5 mL DNS溶液，沸水浴反應(yīng)10 min后冷卻至室溫，定容至25 mL，540 nm處比色，測定OD值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶活。酶活定義：50 ℃條件下, 1 mL酶液每分鐘催化底物生成1 μg葡萄糖的酶量，稱為1個酶活單位，以U/mL表示[15]。

1.4.5 濾紙條崩解實(shí)驗(yàn)

將CMCase活性較高的菌株制成菌懸液，接種10 mL于90 mL濾紙液體培養(yǎng)基， 28 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)，定期觀察濾紙條被降解的情況。

1.4.6 秸稈降解率的測定

取5 mL菌懸液 (復(fù)合菌系各菌懸液按1∶1的體積比共接種5 mL) (無菌水作對照) 分別接至45 mL秸稈液體培養(yǎng)基，28 ℃振蕩培養(yǎng)7 d。將培養(yǎng)物5 000 r/min離心10 min，棄上清，用蒸餾水反復(fù)清洗3次(每次清洗后5 000 r/min離心10 min，棄上清)，80 ℃ 烘至恒重，用差重法計算秸稈降解率。每個處理設(shè)置3個重復(fù)。

(1)

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 13.0進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)和單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒醅樣品及其富集培養(yǎng)物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的DGGE分析

圖1為酒醅樣品及其富集培養(yǎng)物的細(xì)菌DGGE圖譜。T檢驗(yàn)結(jié)果顯示，酒醅樣品及其富集培養(yǎng)物細(xì)菌H值無顯著差異 (p>0.05)，濃香型酒醅樣品與其富集培養(yǎng)物H值分別為2.99±0.27和3.06±0.29；清香型酒醅為2.83±0.37和3.08±0.91。

圖1 酒醅樣品(A)和富集培養(yǎng)物(B)細(xì)菌群落的DGGE圖譜
Fig.1 DGGE profile of bacterial community from original Zaopei samples (A) and enrichment culture (B)
注: 字母N和Q表示濃香和清香型酒醅樣品；B1～B14為測序條帶編號

聚類分析結(jié)果 (圖2) 顯示, 同一酒醅樣品與其富集培養(yǎng)物的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性較低，相似性系數(shù)為0.41～0.64，說明富集培養(yǎng)使酒醅樣品菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化。對富集培養(yǎng)物DGGE圖譜的優(yōu)勢條帶進(jìn)行測序 (B1～B14，圖1B)，所獲序列與NCBI 最似序列同源性為 90.9%～100%，分類于Acinetobacter、Klebsiella、Lactococcus、Paenibacillus、Bacillus(表1)。

圖2 DGGE 圖譜的UPGMA聚類分析
Fig.2 UPGMA dendrogram generated based on the DGGE profiles
注：標(biāo)尺數(shù)值代表樣品間的相似性系數(shù)，0表示完全不同，1表示完全相似經(jīng)16S rRNA基因鑒定，菌株SAAS1～SAAS6與最似模式菌株的同源性97.4%～98.9%，分類于Paenibacillus、Acinetobacter、Novosphingobium、Gluconobacter(圖4)。

2.2 菌株篩選與鑒定

從富集培養(yǎng)物共篩選到18株能在剛果紅培養(yǎng)基形成透明圈的細(xì)菌，選擇透明圈直徑較大的6株細(xì)菌(命名為SAAS1～SAAS6)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)(表2和圖3)。

表1 DGGE圖譜條帶序列的BLAST分析Table 1 BLAST results of selected bands from the DGGE profile

圖3 菌株SAAS1～SAAS6在剛果紅培養(yǎng)基上形成的透明圈
Fig.3 Transparent circle on cellulose congo red agar plates for isolates SAAS 1, 2, 3, 4, 5 and 6

圖4 菌株SAAS1～SAAS6 的16S rRNA系統(tǒng)進(jìn)化樹
Fig.4 Neighbor-joining phylogenetic tree of 16S rRNA for isolates SAAS 1, 2, 3, 4, 5 and 6
(注：本實(shí)驗(yàn)所得序列用粗體表示，Methanosaeta concilii NBRC 103675T(AB679168) 為外群序列。)

2.3 CMCase活力測定

以540 nm處吸光OD值為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量(mg)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程為y=0.402x+0.004,R2=0.995。經(jīng)測定，各菌株的最高CMCase活力及到達(dá)最高酶活的時間不同 (表2)。菌株SAAS1、SAAS3和SAAS5的酶活較高，分別為92.04、84.85和103.10 U/mL；SAAS2 (66.34 U/mL)和SAAS6 (59.98 U/mL) 次之，SAAS4酶活較低，僅23.77 U/mL。以上3個水平的差異顯著 (p<0.05)。此外， SAAS2、SAAS3和SAAS6達(dá)最高酶活的時間為4 d，SAAS1和SAAS5為5 d，SAAS4為3 d。

2.4 菌株對濾紙條的崩解效果

對菌株SAAS1～SAAS6進(jìn)行濾紙裂解能力測試。結(jié)果顯示，6株菌對濾紙條均具有一定的裂解能力 (表2)。菌株SAAS3和SAAS5的降解能力最強(qiáng)，濾紙潰爛成糊狀 (圖5)；SAAS1將濾紙裂解為長度較短的片段；其余3株細(xì)菌 (SAAS2、 SAAS4、SAAS6) 對濾紙條降解作用小，僅在濾紙邊緣出現(xiàn)毛邊。因此，取 SAAS1、SAAS3和SAAS5 進(jìn)行秸稈降解率測定。

2.5 秸稈降解率測定

由圖6和圖7可知，菌株SAAS1、SAAS3、SAAS5對水稻秸稈和小麥秸稈均具有降解作用。此3株菌對水稻秸稈降解率分別為22.77%、7.15%、6.93%；對小麥秸稈的降解率分別為6.88%、5.56%、8.55%。按隨機(jī)組合方式，將以上3菌株構(gòu)建4個復(fù)合菌劑并測試其秸稈降解率。結(jié)果表明，復(fù)合菌劑SAAS1+SAAS3和SAAS1+SAAS3+SAAS5對2種秸稈的降解率較單一菌株均有顯著提高 (p<0.05)。其中，SAAS1+SAAS3+SAAS5組合的降解效果最佳，對水稻秸稈和小麥秸稈的降解率分別達(dá)35.32% 和28.89%。

表2 菌株SAAS1～SAAS6的纖維素降解能力評價Table 2 Estimation of the cellulose degradation activity of isolates SAAS 1, 2, 3, 4, 5 and 6

注：透明圈直徑和CMC最高酶活的實(shí)測值為3份樣品重復(fù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；“+”表示濾紙軟化，出現(xiàn)毛邊； “++”表示濾紙條斷裂； “+++”表示濾紙成糊狀。

圖5 菌株SAAS1、SAAA3和SAAS5的濾紙條崩解效果(CK表示對照組)
Fig.5 Filter paper degradation by isolates SAAS 1, 3 and 5 (CK is the control for this experimental set up)

1-SAAS1; 2-SAAS3; 3-SAAS5; 4-SAAS3+SAAS5; 5-SAAS1+SAAS3; 6-SAAS1+SAAS5; 7-SAAS1+SAAS3+SAAS5
圖6 不同菌株處理對水稻秸稈 (A) 和小麥秸稈 (B) 的降解率
Fig.6 Degradation rate of rice(A) and wheat(B) straw by different isolates
(實(shí)測值為3份樣品重復(fù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，不同字母表示處理間存在顯著差異,p<0.05)

a-CK; b-SAAS1; c-SAAS3; d-SAAS5; e-SAAS1+SAAS3; f-SAAS1+SAAS3+SAAS5
圖7 不同菌株處理對水稻秸稈 (A) 和小麥秸稈 (B) 的降解效果
Fig.7 Rice(A) and wheat(B) straw degradation by different isolates

3 討論

環(huán)境樣品的微生物數(shù)量龐大且種類繁多，采用選擇性培養(yǎng)基富集目標(biāo)菌群有利于提高菌株分離效率。研究證實(shí)，利用CMC-Na作唯一碳源是富集篩選纖維素降解菌的有效手段[14-15]。以往研究利用CMC-Na培養(yǎng)基富集不同環(huán)境樣品的纖維素降解菌[23-24]，發(fā)現(xiàn)富集培養(yǎng)物與原始樣品間的菌群結(jié)構(gòu)(DGGE圖譜) 存在顯著差異。這與本研究結(jié)果一致，表明富集培養(yǎng)取得了顯著效果。通過富集泥炭沼澤土的纖維素降解菌，袁楠等[24]發(fā)現(xiàn)富集培養(yǎng)物的細(xì)菌H值顯著下降。但本研究發(fā)現(xiàn)富集培養(yǎng)對酒醅細(xì)菌H值無顯著影響，說明富集前后樣品的細(xì)菌多樣性水平一致。這可能是在富集培養(yǎng)過程中，酒醅纖維素降解菌的生長與被淘汰菌群的衰亡水平相近所造成。另一可能的解釋是，因?yàn)橄鼍w的DNA可在環(huán)境中保存較長時間不被降解[25]，DGGE揭示的物種可能并非全是纖維素降解菌，從而導(dǎo)致物種多樣性水平的測試值高于真實(shí)值。為避免此現(xiàn)象的發(fā)生，本研究對酒醅細(xì)菌進(jìn)行3次傳代，目的是在富集纖維素降解菌的同時，降低消亡菌體DNA的優(yōu)勢度。由于DGGE圖譜僅反映環(huán)境樣品的優(yōu)勢物種[26]，對富集培養(yǎng)物DGGE的優(yōu)勢條帶測序可較真實(shí)的反映纖維素降解菌的物種多樣性。除Lactococcus外，Bacillus、Paenibacillus、Klebsiella和Acinetobacter均被研究證實(shí)為高產(chǎn)纖維素酶的種群[12-13, 20, 27]，表明DGGE結(jié)果的準(zhǔn)確性。另一方面，本研究分離的Novosphingobium和Gluconobacter未被DGGE檢測到。這可能是DGGE條帶未被全部測序造成。事實(shí)上，方法學(xué)差異常導(dǎo)致研究結(jié)果出現(xiàn)偏差[10]，對環(huán)境樣品物種多樣性的檢測應(yīng)結(jié)合不同手段方能更真實(shí)地反映群落信息。

關(guān)于白酒釀造環(huán)境纖維素降解菌的分離，以往研究從黃水分離的細(xì)菌均以Bacillus為主[12-13]。本研究所得菌株則分類于Paenibacillus、Acinetobacter、Novosphingobium、Gluconobacter。此結(jié)果揭示釀造環(huán)境蘊(yùn)藏豐富的纖維素降解菌值得發(fā)掘。產(chǎn)酶水平方面，曾林等[12]選育的B.endophyticusCMCase活力最高，達(dá)到153.36 U/mL，具有良好的應(yīng)用前景。但CMCase活力測定是以人工合成的可溶性纖維素為底物，比天然纖維素更易被細(xì)菌分解利用。因此，僅憑CMCase活力水平難以真實(shí)反映菌株對天然纖維素的利用能力[12]。如在本研究中，菌株SAAS1、SAAS3和SAAS5的CMC酶活水平相當(dāng)，但SAAS1對分子結(jié)構(gòu)更接近天然纖維素的濾紙[28]的降解能力較低。所以，進(jìn)一步評價菌株對天然秸稈的利用能力必不可少。

本研究供試的3株細(xì)菌 (SAAS1、SAAS3和SAAS5) 在液態(tài)發(fā)酵條件下對水稻秸稈和小麥秸稈具有較好的降解效果，但同一菌株對不同秸稈的降解能力存在差異，如菌株SAAS1 對水稻秸稈降解率達(dá)22.77%，但對小麥秸稈的降解率僅為6.88%。 此外，SAAS1對濾紙的降解能力雖低于SAAS3和SAAS5，但其對水稻秸稈的降解能力顯著較高 (p<0.05)。以上現(xiàn)象的發(fā)生可能與菌株在利用不同碳源時所表達(dá)的纖維素酶不同，導(dǎo)致降解效率不同有關(guān)[15]。天然纖維素的降解常依賴多種酶的協(xié)同作用，利用不同特性的菌株構(gòu)建復(fù)合菌系是提高秸稈降解率的有效手段[14, 29]。本研究通過構(gòu)建復(fù)合菌系混合發(fā)酵，顯著提高了菌株對秸稈的降解效果 (p<0.05)，得到的復(fù)合菌系SAAS1+SAAS3+SAAS5對水稻秸稈和小麥秸稈液態(tài)發(fā)酵7 d 的降解率分別達(dá)35.32%和28.89%。長期以來，國內(nèi)外復(fù)合菌系研究面臨相同的難點(diǎn)，即在混合菌系中，微生物群落結(jié)構(gòu)及相互作用易受環(huán)境因素影響，從而導(dǎo)致菌系功效不穩(wěn)定[30]。本研究構(gòu)建的復(fù)合菌系由3株細(xì)菌組成，菌種少，利于質(zhì)量控制。今后我們將針對菌株的協(xié)同機(jī)理及其配伍比例進(jìn)行研究，進(jìn)一步加強(qiáng)菌系功效，提高其生產(chǎn)轉(zhuǎn)化能力。

4 結(jié)論

我國白酒釀造環(huán)境極為特殊，蘊(yùn)藏豐富的微生物資源。為充分發(fā)揮我國白酒釀造環(huán)境的資源優(yōu)勢，拓展纖維素酶的種質(zhì)來源，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合基于分子生物學(xué)研究手段的免培養(yǎng)技術(shù)(DGGE)和分離培養(yǎng)手段解析酒醅纖維素降解菌的多樣性，選育出3株具有應(yīng)用潛力的纖維素降解菌，為今后構(gòu)建高效穩(wěn)定的復(fù)合菌系及纖維素酶的工業(yè)生產(chǎn)提供了新的種質(zhì)資源。