生物膜形成對(duì)植物乳桿菌PG3-1耐受性及功能基因表達(dá)的影響

張國(guó)麗，楊陳文，余茜，陳安均，劉書亮,2，敖曉琳,2*

1(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625000)2(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品加工與安全研究所，四川 雅安，625000)

植物乳桿菌在發(fā)酵食品中應(yīng)用十分廣泛，其生理活性以及穩(wěn)定性對(duì)食品加工有著重要影響。高溫會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，膜結(jié)構(gòu)破壞以及核酸分子受損等。在植物乳桿菌的工業(yè)應(yīng)用過(guò)程中常常會(huì)伴隨一些高溫的過(guò)程，如噴霧干燥、巴氏滅菌等，此外熱耐受還與植物乳桿菌的長(zhǎng)期保藏成正相關(guān)。因此提高乳桿菌的耐受能力對(duì)于提高植物乳桿菌的商業(yè)價(jià)值有重要意義。

1978年美國(guó)學(xué)者COSTERTON提出了生物膜(Biofilm)這一專有名詞[1-2]，它主要是由附著于生物或者非生物實(shí)體表面的細(xì)菌細(xì)胞和包裹著細(xì)菌的基質(zhì)所組成。當(dāng)細(xì)菌受到各種脅迫，如營(yíng)養(yǎng)缺乏或營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩，低pH值，高滲透壓，抗菌劑和抗生素等，在這些不利的環(huán)境下，大量的細(xì)菌通過(guò)自身合成的水合多聚物粘附在固體表面，以固著的方式生長(zhǎng)從而形成生物膜。這是細(xì)菌所具有的一種非常重要的環(huán)境適應(yīng)機(jī)制[3]。

生物膜在食品加工與安全領(lǐng)域具有重要的研究?jī)r(jià)值，生物膜的形成能促進(jìn)有益微生物對(duì)不利環(huán)境的適應(yīng)能力，使其具有良好的穩(wěn)定性，可解決發(fā)酵劑不穩(wěn)定等食品工業(yè)中的實(shí)際問(wèn)題。但食品工業(yè)的原輔料、食品加工機(jī)械表面和管道內(nèi)以及生產(chǎn)環(huán)境中很容易出現(xiàn)生物膜，生物膜的特殊結(jié)構(gòu)可以使其耐受消毒劑的作用而得以殘存，進(jìn)而可以再次污染食品，如果是病原菌，則可能造成極大的食品安全隱患[4-5]。

細(xì)菌在受到不同程度的環(huán)境因子刺激，如熱、酸、鹽等刺激，應(yīng)激蛋白在細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化過(guò)程中的基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成、折疊、跨膜運(yùn)輸、分解和立體構(gòu)象的維持等方面發(fā)揮重要作用，可抵御不良環(huán)境，典型代表為熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)，該蛋白廣泛分布于微生物、動(dòng)物、植物等各種生物體內(nèi)，其中DnaK、GroEL熱激蛋白，可通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)修復(fù)和折疊作用，從而保護(hù)蛋白質(zhì)形態(tài)、功能特性[6]，與生物膜的形成息息相關(guān)。

本試驗(yàn)研究了植物乳桿菌PG3-1生物膜形成后對(duì)其耐受性的影響，并從基因表達(dá)水平分析解釋該類現(xiàn)象，為更好的發(fā)揮植物乳桿菌的益生功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌(LactobacillusplantarumPG3-1，NCBI登錄號(hào)：AB617650)，分離自傳統(tǒng)制作的泡菜老鹽水中，具有優(yōu)良的發(fā)酵性能。

MRS肉湯、試驗(yàn)培養(yǎng)基(牛肉膏10 g，酵母粉5 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉5 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，葡萄糖20 g，檸檬酸5 g，胰蛋白胨25 g，果膠0.5 g，氯化鈉40 g，乳粉15 g，蒸餾水1 000 mL)，瓊脂糖等，以上生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或市售。

試劑盒：Biozol RNA Mini Kit，Biomiga公司；HisScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，Vazyme 公司；2×SYBR Mixture，熒光定量PCR板膜，Biomiga公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，Haimen Boyang儀器設(shè)備公司。

1.2 儀器與設(shè)備

3001型酶標(biāo)儀，Thermo Scientific 公司；BPC-250F生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DHG-9245A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1F超凈操作臺(tái)，蘇州凈化；SYQ-DSX-280B壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；PHS-4C+酸度計(jì)，成都世紀(jì)方舟科技有限公司；D2KW-5-4電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；CFX Connect Real-time PCR儀，BIO-RAD公司；Gel Doc XR凝膠成像儀，BIO-RAD公司；SORVALL高速離心機(jī)，美國(guó)科駿儀器有限公司；DY-A電泳儀，上?？颠_(dá)儀器廠。EVO18掃描電鏡，Carl Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 植物乳桿菌生物膜形成菌株和浮游菌株的制備

生物膜菌株(實(shí)驗(yàn)組)：將過(guò)夜活化培養(yǎng)后的植物乳桿菌按5×107CFU/mL接入試驗(yàn)培養(yǎng)基，振蕩搖勻后按照每孔200 μL的添加量添加到96孔板中42 ℃培養(yǎng)36 h。該接種和培養(yǎng)條件參照實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)結(jié)果。以相應(yīng)等體積空白培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。

浮游菌株(對(duì)照組)：將活化后的植物乳桿菌按1×105CFU/mL接入MRS肉湯培養(yǎng)基，振蕩搖勻后按照每孔200 μL的添加量添加到96孔板中37 ℃下培養(yǎng)36 h。以相應(yīng)等體積空白培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。

1.3.2 植物乳桿菌生物膜的定量測(cè)定

培養(yǎng)完成之后的培養(yǎng)液倒出，每孔加入200～300 μL無(wú)菌水清洗，將結(jié)合不緊密及游離菌體清除。風(fēng)干后加入0.5%結(jié)晶紫染液50 μL染30 min。倒掉染液，每孔加入250 μL無(wú)菌水洗3次。風(fēng)干后采用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處OD值。以A490值定量生物膜形成量，A490小于等于0.17時(shí)表明無(wú)生物膜形成，A490大于0.34時(shí)表明生物膜大量形成[7]。

1.3.3 植物乳桿菌生物膜的形態(tài)觀察

將約1 cm×1 cm經(jīng)過(guò)70%酒精浸泡、清潔的蓋玻片置于培養(yǎng)基中，讓植物乳桿菌在培養(yǎng)過(guò)程中自然黏附聚集在玻片上，培養(yǎng)完成之后取出玻片，置于2%戊二醛磷酸緩沖液中，于4 ℃冰箱中固定過(guò)夜，次日以磷酸緩沖液沖洗，分別用40%、70%、90%、100%的乙醇依次脫水，每次15 min。脫水后，用醋酸戊酯置換乙醇，再進(jìn)行干燥、鍍金及掃描電鏡觀察[8]，觀察生物膜形成情況，以浮游菌株作為對(duì)照。

1.3.4 植物乳桿菌生物膜耐受性的測(cè)定

同一批次培養(yǎng)多管實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組菌株，實(shí)驗(yàn)組單獨(dú)通過(guò)離心、沖洗、濃縮、打散、重懸等一系列過(guò)程，測(cè)定對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組初始活菌數(shù)。

(1)對(duì)溫度的耐受性：參照司淼菲[9]的方法，參考初始活菌數(shù)將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別按106CFU/mL接種量接種到5 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，然后分別在50 、55 、60 、65 、70 ℃水浴條件下靜置1 h，進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)，比較生物膜菌株和浮游菌株對(duì)溫度耐受性的差異，每組3個(gè)平行。

(2)對(duì)酸堿度的耐受性：參照KUBOTA[10]的方法，將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別按106CFU/mL的接種量分別接種到pH值2、3、4、8、9、10的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置處理2 h，進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)，比較生物膜菌株和浮游菌株對(duì)酸堿度耐受能力的差異，每組3個(gè)平行。

(3)對(duì)鹽度的耐受性：將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別按106CFU/mL接種量分別接種到添加有6%、8%、10%、12%、14% NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置處理2 h，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，比較生物膜菌株和浮游菌株對(duì)不同鹽度耐受能力的差異，每組3個(gè)平行。

1.3.5 生物膜菌株和浮游菌株功能基因相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定

分別提取植物乳桿菌生物膜菌株和浮游菌株總RNA。提取的樣品經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)達(dá)到OD260/OD280為1.8～2.0，保存于-20 ℃冰箱中備用。

逆轉(zhuǎn)錄：將所得RNA采用試劑盒轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存于-20 ℃冰箱中備用。體系(20 μL)：2×RTmix 10 μL，酶2 μL，寡核苷酸1 μL，隨機(jī)六聚體1 μL，RNA模板6 μL。

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序：25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min。

引物設(shè)計(jì)：根據(jù)根據(jù)Gene Bank提供的GroEL、Dank基因序列，應(yīng)用Oligo軟件，設(shè)計(jì)了針對(duì)特異性定量引物用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，以16S rRNA作為內(nèi)參基因[11]，引物信息如表1。以上引物均由上海生工生物工程公司合成。

表1 引物信息表Table 1 Primer information table

實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系：SYBR 2×5μL ，上游引物0.2 μL(10 μmol/L)，下游引物0.2 μL(10 μmol/L) ，梯度稀釋cDNA模板0.4 μL，ddH2O補(bǔ)足至10 μL。

反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min ，95 ℃變性15 s，退火1 min，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后記錄CT值，每個(gè)處理3次重復(fù)。溶解曲線：95 ℃，10 s；65 ℃，5 s；95 ℃，50 s。

相對(duì)表達(dá)量計(jì)算：采用EXCEL以及SPSS 17. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析[12]。其中：

相對(duì)表達(dá)量 = 2-ΔΔCt

(1)

ΔΔCt =(Ct實(shí)驗(yàn)組-Ct實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參)-(Ct對(duì)照組-Ct對(duì)照組內(nèi)參)

(2)

2 結(jié)果與分析

2.1 生物膜菌株的測(cè)定結(jié)果

經(jīng)測(cè)定，實(shí)驗(yàn)組A490值為4.492 3，對(duì)照組A490值為0.136 5。對(duì)具有成熟生物膜的植物乳桿菌和浮游菌株進(jìn)行掃描電鏡觀察，所形成的生物膜較游離菌體具有大量的胞外聚合物包被，整個(gè)膜有孔洞，具有典型的生物膜結(jié)構(gòu)(圖1-b)，對(duì)照組中植物乳桿菌菌體形態(tài)清晰可見(jiàn)，沒(méi)有包被物，菌體呈游離狀態(tài)(圖1-a)。

圖1 植物乳桿菌生物膜以及游離菌體掃描電鏡圖
Fig.1 SEM of biofilm and planktonic L. plantarum

2.2 生物膜形成對(duì)植物乳桿菌耐受性的影響

2.2.1 生物膜形成對(duì)植物乳桿菌酸堿耐受性的影響

環(huán)境pH值對(duì)微生物的生長(zhǎng)至關(guān)重要，可以通過(guò)影響細(xì)胞膜表面電荷的性質(zhì)及通透性從而影響對(duì)物質(zhì)的吸收能力，或者通過(guò)改變酶活、酶促反應(yīng)等影響新陳代謝。酸性條件是乳酸菌自然發(fā)酵過(guò)程中的重要環(huán)境特征。乳桿菌發(fā)酵的主要產(chǎn)物乳酸的pKa=3.86，細(xì)胞內(nèi)的乳酸分子通過(guò)去游離化和游離化作用來(lái)調(diào)控細(xì)胞從對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，但是作為益生菌的乳桿菌服用后經(jīng)過(guò)胃部到達(dá)腸前時(shí)將會(huì)經(jīng)受極端的酸性條件。堿性條件下則不利于乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖，本試驗(yàn)對(duì)植物乳桿菌生物膜形成后對(duì)偏酸和偏堿環(huán)境的耐受能力均進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖2所示，隨著酸度或堿度的增大，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的耐受能力均下降，在不利的環(huán)境因素下，微生物的存活受到威脅，但實(shí)驗(yàn)組總體上較對(duì)照組表現(xiàn)出更佳的耐受能力，表明生物膜形成之后，植物乳桿菌對(duì)酸堿的耐受能力有所提高，可有利于使用植物乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)一些酸度較高的食品，該試驗(yàn)結(jié)果與HIROMI[10]等的試驗(yàn)結(jié)果類似。在pH值小于3的范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的存活率都很低，實(shí)驗(yàn)組沒(méi)有明顯的優(yōu)勢(shì)，表明生物膜結(jié)構(gòu)在極端環(huán)境中也會(huì)被破壞，失去對(duì)菌體的保護(hù)作用。

圖2 生物膜形成菌株與浮游菌株的酸堿耐受性
Fig.2 the tolerance to pH of biofilm and planktonic L. plantarum
(不同大小寫字母代表差異顯著，p<0.05)

2.2.2 生物膜形成對(duì)植物乳桿菌溫度耐受性的影響

高溫會(huì)影響菌株的生長(zhǎng)和代謝，對(duì)于大多數(shù)乳酸菌在60 ℃左右就會(huì)死亡。生物膜形成對(duì)植物乳桿菌溫度耐受性的影響結(jié)果如圖3所示。

圖3 生物膜形成菌株與浮游菌株對(duì)溫度的耐受性
Fig.3 the tolerance to temperature of biofilm and planktonic L. plantarum
(不同大小寫字母代表差異顯著，p<0.05)

隨著溫度的升高，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的存活率均下降，但是生物膜形成菌株在同樣溫度下較之于浮游菌株具有更好的耐受性，最高耐受溫度提高至70 ℃，可能原因是在生物膜培養(yǎng)過(guò)程中受到較高溫度的刺激與誘導(dǎo)，提高了植物乳桿菌的熱應(yīng)激能力，在經(jīng)過(guò)熱適應(yīng)之后具有更好的溫度耐受性。當(dāng)溫度達(dá)到65 ℃及以上時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組存活率都很低，表明生物膜的保護(hù)作用具有一定限度。在益生菌發(fā)酵食品中，某些產(chǎn)品需要經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的巴氏滅菌處理來(lái)殺滅導(dǎo)致腐敗的雜菌，但是在殺滅雜菌的同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致益生菌的死亡，若能利用植物乳桿菌生物膜形成的保護(hù)作用提高其對(duì)溫度的耐受性，就可以通過(guò)低溫殺菌方式殺滅腐敗微生物，有益微生物可以存在于食品之中。

2.2.3 生物膜形成對(duì)植物乳桿菌鹽度耐受性的影響

植物乳桿菌生物膜形成對(duì)鹽度耐受性的影響如圖4所示，隨著鹽濃度的增加，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的存活率均下降，但實(shí)驗(yàn)組總體的耐受性高于對(duì)照組，表明植物乳桿菌生物膜形成之后對(duì)鹽度的耐受性有所提高。在發(fā)酵高鹽度食品時(shí)，利用植物乳桿菌生物膜形成的保護(hù)作用能夠很好的耐受高鹽度，有利于發(fā)酵的順利進(jìn)行。

圖4 生物膜形成菌株與浮游菌株對(duì)鹽度的耐受性
Fig.4 The tolerance to NaCl of biofilm and planktonic L. plantarum
(不同大小寫字母代表差異顯著，p<0.05)

植物乳桿菌在自然生長(zhǎng)過(guò)程中通常會(huì)暴露在一定濃度的鹽溶液中，而細(xì)胞質(zhì)的濃度須與外界保持一致。當(dāng)菌體突然暴露在高滲環(huán)境(如高濃度的鹽溶液)中時(shí)，環(huán)境滲透壓的改變會(huì)影響細(xì)胞的重要生理功能，細(xì)菌為了存活則需要適應(yīng)這種環(huán)境變化，細(xì)胞會(huì)通過(guò)向胞外運(yùn)輸水分，從而改變胞內(nèi)滲透壓和細(xì)胞體積來(lái)適應(yīng)高滲環(huán)境。而生物膜形成的保護(hù)結(jié)構(gòu)可能在一定程度上減少了高鹽濃度的進(jìn)入來(lái)應(yīng)對(duì)這種環(huán)境脅迫。

2.3 功能基因相對(duì)表達(dá)量的確定

2.3.1 內(nèi)參基因的擴(kuò)增

將cDNA模板分別稀釋0，10，102，103，104，105，106，107倍，按照體系進(jìn)行熒光定量PCR，確定最佳稀釋倍數(shù)為100倍。通過(guò)內(nèi)參基因的溶解曲線(圖5)可以觀察到在80～85 ℃之間出現(xiàn)單一的峰，沒(méi)有雜峰出現(xiàn)，溶解峰對(duì)應(yīng)的值與擴(kuò)增產(chǎn)物的理論非常接近，證明內(nèi)參基因擴(kuò)增產(chǎn)物為單一特異性產(chǎn)物。實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)PCR受到RNA的不穩(wěn)定性，RNA提取方法的不穩(wěn)定性，逆轉(zhuǎn)效率和PCR效率等因素的影響。本實(shí)驗(yàn)采用保守的基因作為內(nèi)參(16S rRNA)對(duì)定量方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化來(lái)消除上述因素對(duì)結(jié)果的影響。

圖5 內(nèi)參基因溶解曲線
Fig.5 Melt curve of reference gene

2.3.2 目的基因擴(kuò)增結(jié)果

通過(guò)圖6和圖7可以觀察到目的基因在75～80 ℃出現(xiàn)單一的峰，目的基因的引物特異性較好，沒(méi)有雜峰和引物二聚體的岀現(xiàn)，溶解峰對(duì)應(yīng)的值與擴(kuò)增產(chǎn)物的理論值非常接近，表明目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物為單一特異性產(chǎn)物。

圖6 GroEL基因溶解曲線
Fig.6 Melt curve of GroEL gene

圖7 DanK基因溶解曲線
Fig.7 Melt curve of DanK gene

M-2 000 bp的DNA標(biāo)記； 1-2-16S rRNA內(nèi)參基因；3-DanK基因
圖8 內(nèi)參基因及DanK基因擴(kuò)增結(jié)果
Fig.8 Electrophoresis results of reference gene and DanK gene

M-2 000 bp的DNA標(biāo)記； 3-4-GroEL 基因
圖9 GroEL基因擴(kuò)增結(jié)果
Fig.9 Electrophoresis result of GroEL gene

2.3.3 基因相對(duì)表達(dá)量的確定

實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)是通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)即時(shí)測(cè)定特異性產(chǎn)物的量，進(jìn)而據(jù)此推斷目的基因的初始含量。利用該方法對(duì)植物乳桿菌生物膜菌株和浮游菌株各功能基因進(jìn)行相對(duì)定量分析，結(jié)果如圖10所示。DnaK，GroEL 基因的相對(duì)表達(dá)量分別達(dá)到1.53，3.22。結(jié)果表明，生物膜成熟過(guò)程中受到熱脅迫等環(huán)境影響，DnaK、GroEL基因表達(dá)量增高，與焦凌霞[13]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似，學(xué)者對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌進(jìn)行70～90 ℃熱脅迫，DnaK基因的表達(dá)量也提高至1～2.5倍不等。2種熱應(yīng)激基因?qū)χ参锶闂U菌在高溫逆境下的生存于生物膜的形成起著重要作用。

圖10 基因相對(duì)表達(dá)量
Fig.10 The relative expression of genes

3 討論

細(xì)菌生物膜的形成過(guò)程牽涉到多種基因的表達(dá)以及復(fù)雜的蛋白調(diào)控機(jī)制[14]。本試驗(yàn)表明，植物乳桿菌生物膜形成之后相關(guān)應(yīng)激基因的表達(dá)量提高，且對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力和耐受性也相應(yīng)提高，表明其生物膜的形成與各種應(yīng)激行為密不可分，在成膜過(guò)程中受到各種環(huán)境脅迫，產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)激行為，調(diào)控了菌體對(duì)不良環(huán)境的耐受力。乳酸菌的應(yīng)激研究目前已較為全面，但是將生物膜的形成與應(yīng)激行為和環(huán)境耐受力相結(jié)合的研究較為少見(jiàn)。

DnaK、GroEL生物學(xué)功能廣泛，而且在生物體內(nèi)廣泛地參與了多種復(fù)雜的功能，與生物在高溫、酸、堿、氧化應(yīng)激等逆境下的生存關(guān)系密切。熱激蛋白在受到各種環(huán)境脅迫時(shí)都會(huì)受到誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)。環(huán)境滲透壓升高，會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)有破壞作用，GroEL基因面對(duì)滲透脅迫則會(huì)受到誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，起到保護(hù)蛋白質(zhì)的目的。在此環(huán)境脅迫下與調(diào)控下也促進(jìn)了生物膜的形成。

劉倩穎[15]的試驗(yàn)研究表明，在鹽脅迫下，GroEL基因的表達(dá)量會(huì)增加至4倍左右，在本實(shí)驗(yàn)植物乳桿菌生物膜的成熟過(guò)程也受到鹽脅迫，說(shuō)明該基因在鹽脅迫下其相對(duì)表達(dá)量也會(huì)受到影響，可能一個(gè)基因同時(shí)調(diào)控著細(xì)菌的多種環(huán)境應(yīng)激行為。

應(yīng)激基因的相對(duì)表達(dá)量變化在表型試驗(yàn)中也得以驗(yàn)證。酸、高溫脅迫下會(huì)導(dǎo)致一些相關(guān)的酸敏感酶的活性喪失，細(xì)胞膜、大分子物質(zhì)的結(jié)構(gòu)損壞等，菌體與菌體之間也會(huì)有協(xié)同或拮抗行為的產(chǎn)生。植物乳桿菌會(huì)通過(guò)自身適應(yīng)性調(diào)節(jié)來(lái)消除部分不利影響，涉及的可能機(jī)制包括細(xì)胞膜組成的改變、應(yīng)激蛋白和分子伴侶的誘導(dǎo)產(chǎn)生、轉(zhuǎn)錄調(diào)控的表達(dá)等。適應(yīng)性調(diào)節(jié)可能是上述一種機(jī)制的作用，也可能是多種機(jī)制的綜合結(jié)果，仍需進(jìn)一步研究確定。

高滲條件通常由鹽類或糖類溶質(zhì)引起，植物乳桿菌通常情況下能自我平衡胞內(nèi)胞外的一定鹽或糖濃度。在高滲透壓條件下，可在細(xì)胞內(nèi)積累相容性溶質(zhì)；在低滲透壓條件下，可以通過(guò)向細(xì)胞外部釋放相容性溶質(zhì)。通過(guò)調(diào)節(jié)相容性溶質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)含量這樣的方式，達(dá)到保護(hù)菌體的目的。

植物乳桿菌生物膜形成之后，其對(duì)環(huán)境的耐受性相應(yīng)提高，可利用生物膜的形成有利于抵抗環(huán)境脅迫壓力，通過(guò)調(diào)控生物膜的形成促進(jìn)有益微生物聚集，提高發(fā)酵菌種穩(wěn)定性與活力，從而提高發(fā)酵食品品質(zhì)。

4 結(jié)論

研究了植物乳桿菌PG3-1生物膜形成之后環(huán)境耐受力的變化以及相關(guān)功能基因表達(dá)量的變化，結(jié)果表明，生物膜形成后菌株對(duì)溫度、酸堿度、鹽度耐受性均有不同程度的提高，且與其功能基因的表達(dá)存在一定關(guān)聯(lián)，植物乳桿菌生物膜形成過(guò)程中發(fā)生熱應(yīng)激、酸應(yīng)激、鹽應(yīng)激等應(yīng)激行為，GroEL、DanK熱應(yīng)激基因的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到3.22、1.53，更為深入的相互關(guān)系還需要進(jìn)一步探索。