乙醛脫氫酶的克隆表達及其酶學性質

豆欣喜，張明，林材，吳殿輝，李曉敏，孫軍勇，蔡國林，陸健*

1(江南大學，工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 2 (江南大學，糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫，214122) 3 (江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122) 4(江蘇省農墾麥芽有限公司，江蘇 射陽，224300) 5(華潤雪花啤酒有限公司，河北 秦皇島，066001)

乙醇在人體內的代謝主要靠體內的2種酶[1]，一種是乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenases, ADH, EC1.1.1.1)，將乙醇氧化成乙醛；另一種是乙醛脫氫酶(Acetaldehyde dehydrogenase,ALDH,EC 1.2.1.10)，將乙醛氧化成乙酸。一般情況下，ADH可充分表達，缺乏ALDH的個體比較多，導致乙醛在體內大量積累，產生醉酒癥狀[2]，同時會損傷肌體細胞，容易誘發(fā)肝癌[3]。目前，在人體中已發(fā)現(xiàn)19種ALDH，主要分布在肝、胃、心臟等器官中，最常見的有ALDH1、ALDH2、ALDH3、ALDH4四種[4]。其中，參與乙醛氧化的主要是ALDH1和ALDH2，ALDH2 的催化活性是ALDH1的10倍[5]。所以ALDH2是人體酒精代謝的關鍵酶，近年來，隨著人們對獲得全新的、更有效的解酒保肝藥物的需求日益迫切，關于高效表達乙醛脫氫酶2編碼基因ALDH2的研究工作更顯出其深遠意義。

很多科研工作者將ALDH2基因導入大腸桿菌或畢赤酵母的表達體系中，以構建高產ALDH2的工程菌[6-7]。但是大腸桿菌是一種致病菌，畢赤酵母表達ALDH2時需要用甲醇誘導，這對產物的安全性具有一定的影響，解酒藥物的研究也受到了限制。釀酒酵母Saccharomycescerevisiae作為第一個完成全基因組測序的真核生物[8]，很早就被應用于食品和飲料工業(yè)，已被成功地表達了大量的真核外源蛋白，釀酒酵母能對外源蛋白質進行一定程度上的折疊加工和糖基化修飾，這有利于保持生物產品的活性和穩(wěn)定性[9-11]。

但是釀酒酵母表達系統(tǒng)仍有缺點：與大腸桿菌表達系統(tǒng)和經甲醇誘導的畢赤酵母表達相比，游離的質粒在釀酒酵母中表達，由于沒有選擇條件的壓力，在發(fā)酵過程中會出現(xiàn)質粒丟失的問題；整合到酵母基因組上的質粒雖然穩(wěn)定性好，但質粒不能獨立于酵母染色體外進行自主復制，這就會出現(xiàn)拷貝數(shù)低，目的產物表達量不高的問題。綜合上述各種表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點，本研究將人源ALDH2基因針對釀酒酵母進行了密碼子偏好性優(yōu)化后，與組成型強啟動子TPIp一同整合到酵母的基因組上來表達人源ALDH2基因；在工程菌發(fā)酵過程中不需要添加誘導劑，產物相對比較安全，并對該重組酶的最適作用溫度、最適pH、溫度穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、金屬離子對比酶活的影響以及動力學進行了研究，以期為解酒酶制劑的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質粒

釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeW303-1A(MATaΔura3 Δtrp1 Δleu2 Δhis3)和N85(MATa/MATα)，大腸桿菌EscherichiacoliJM109以及表達質粒pYX212均由本實驗室保存，克隆載體pMD18-T simple vector購自寶生物工程(大連)有限公司。其中：質粒pYX212攜帶有Ampr抗性基因和磷酸丙糖異構酶的組成型強啟動子TPIp及其終止子TPIt。

1.1.2 主要酶和試劑

Prime STAR DNA Polymerase，ExTaqDNA Polymerase，rTaqDNA Polymerase，T4DNA Ligase，BamH I，EcoR I，Mini BEST Universal Genomic DNA Extraction Kit試劑盒，DNA Marker、標準蛋白Marker均購自寶生物工程(大連)有限公司；SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒、膠回收試劑盒、氨芐青霉素(Amp)、YNB(Yeast Nitrogen Base)、L-亮氨酸、L-色氨酸、L-組氨酸、腺嘌呤、蝸牛酶和輔酶NAD+購自生工生物工程(上海)股份有限公司，其他試劑均為市售國產或進口分析純產品。目的基因ALDH2及引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，DNA片段測序均由上海睿迪生物技術有限公司完成。

1.1.3 主要儀器

瓊脂糖凝膠電泳儀，美國Bio-Rad公司；JD-801凝膠成像儀，江蘇省捷達科技發(fā)展有限公司；Spectra Max Plus 384酶標儀，美國MDC公司；His TrapTMexcel(1 mL)色譜柱，GE Healthcare公司；Mastercycler pro PCR儀，德國Eppendorf公司。

1.1.4 目的基因和引物的合成

將GeneBank中人源乙醛脫氫酶2的基因序列根據(jù)釀酒酵母(S.cerevisiae)的密碼子偏好性進行密碼子優(yōu)化后合成目的基因ALDH2，連接克隆載體pUC57后，得到重組質粒pUC57-ALDH2。其中，ALDH2基因的兩端分別具有BamHI和EcoRI的酶切位點。

表1 本實驗中所使用的引物Table 1 Primers used in the study

注：下劃線為用于融合PCR的重疊序列。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組質粒pYX212-ALDH2的構建

重組質粒pYX212-ALDH2的構建過程如圖1所示。首先，使用SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒提取質粒pUC57-ALDH2和pYX212，分別經EcoR I和BamH I雙酶切，用膠回收試劑盒回收目的基因ALDH2(1 542 bp)和線性化載體pYX212(8 346 bp)，然后在T4連接酶的作用下，16 ℃保溫過夜，將目的基因與載體連接，并轉化至大腸桿菌JM109的感受態(tài)細胞[12]，涂布含有Amp的LB篩選培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)12 h左右，挑取平板上長出的菌落使用引物F5/R5進行菌落PCR，并且提取陽性克隆子的質粒分別進行雙酶切和測序驗證。

圖1 重組質粒pYX212-ALDH2的構建
Fig.1 Construction of recombinant plasmid pYX212-ALDH2

1.2.2 人源ALDH2基因表達組件TRP1L-URA3-TPIp-ALDH2-TPIt-TRP1R的構建

以釀酒酵母W303-1A的基因組為模板，以F1/R1和F4/R4為引物，利用Prime STAR DNA Polymerase分別擴增TRP1基因的上游同源臂TRP1L和下游同源臂TRP1R；以釀酒酵母N85的基因組為模板，以F2/R2為引物擴增完整的篩選標記基因URA3；以重組質粒pYX212-ALDH2為模板，以F3/R3為引物擴增含有TPI的啟動子和終止子以及目的基因ALDH2的片段TPIp-ALDH2-TPIt。PCR產物經過瓊脂糖凝膠電泳分離后，分別回收上述TRP1L、TRP1R、URA3以及TPIp-ALDH2-TPIt四個片段。

表達組建的構建過程如圖2所示?；谌诤螾CR的原理，采用一種高效構建基因表達組件的方法，以等摩爾的TRP1L、URA3、TPIp-ALDH2-TPIt和TRP1R為模板，不加引物，在Prime STAR DNA Polymerase的作用下，進行touchdown PCR(15個循環(huán))將上述4個片段進行融合；再以融合的產物為模板，以P1/P4為引物，在ExTaqDNA Polymerase的作用下進行常規(guī)PCR(15個循環(huán))擴增表達組件[13]。

圖2 工程菌酵母構建示意圖
Fig. 2 Construction of the engineering yeast strain

1.2.3 基因工程菌的構建

基因工程菌的構建過程如圖2所示。利用電轉化的方法將上述獲得的表達組件(TRP1L-URA3-TPIp-ALDH2-TPIt-TRP1R)轉入到尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型的釀酒酵母W303-1A中，通過同源重組的方式將表達組件整合到酵母的基因組上，整合位點是trp1基因，電轉參數(shù)為1 800 V，4～5 ms。

1.2.4 基因工程菌的鑒定

釀酒酵母W303-1A為尿嘧啶缺陷型菌株，在不含尿嘧啶的培養(yǎng)基上無法生長，當ALDH2基因表達組件整合到基因組上時，由于組件上含有完整的URA3基因，陽性轉化子就可以在不含尿嘧啶的培養(yǎng)基上生長。因此，可以利用酵母菌的這個特性，使用SC-URA3培養(yǎng)基篩選整合成功的釀酒酵母。

提取平板上轉化子的基因組，以F1/R4為引物進行PCR驗證。為了進一步鑒定整合位點是否正確，再以整合位點向外分別在500 bp的位置重新設計引物F6/R6，以轉化子的基因組為模板，進行PCR擴增，回收正確的PCR擴增條帶進行測序驗證。

1.2.5 發(fā)酵產酶實驗

對原始菌和工程菌分別進行培養(yǎng)和產酶實驗，具體方法如下：將斜面培養(yǎng)基保存的菌株在新鮮的YPD平板培養(yǎng)基上劃線，于30 ℃活化培養(yǎng)至菌落長出(約36～48 h)。挑取單菌落接種至含3 mL的YPD培養(yǎng)基的小試管中，30 ℃，200 r/min培養(yǎng)24 h。取2 mL培養(yǎng)液(1%接種量)于200 mL的YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)，在培養(yǎng)48、72、96、120 h時，分別取5 mL的發(fā)酵液用于酶活測定。

發(fā)酵液的處理：5 mL的發(fā)酵液在8 000 r/min條件下離心5min，用無菌水洗滌菌體1次，再用液氮冷凍菌體10 min，最后加入和菌體等體積的酸洗玻璃珠和600 μL的PBS緩沖液(20 mmol/L PBS, 0.15 mol/L NaCl)，在渦旋振蕩器上振動30 s，之后在冰上放置1 min，重復15個循環(huán)，10 000 r/min離心5 min，上清液即是粗酶提取液，用于酶活和蛋白含量的測定。

1.2.6 蛋白質含量和酶活的測定

采用考馬斯亮藍法(CBB)[14]測定蛋白質含量。

乙醛脫氫酶酶活檢測方法：酶、輔酶NAD+和底物在一定條件下反應，通過測定一定時間的340 nm處吸光度的變化值，可計算出NAD+轉化為 NADH 的量，從而得到該酶的酶活[15]。酶活定義：35 ℃下，每分鐘內OD340值發(fā)生0.001的數(shù)量變化定義為1個活力單位。反應體系里 ALDH 的酶活計算公式[16]為：

(1)

(2)

本實驗的測定體系參考 Okibe 的反應體系[17]并進行了一定的改進。

表2 ALDH酶活測定反應體系Table 2 The enzyme activity assay of ALDH

加入酶液之前先將反應體系在35 ℃溫浴10 min，然后加入酶液10 μL，迅速用酶標儀測340 nm下吸光度值的變化，在連續(xù)5 min內，每隔1 min讀取1次吸光度值，根據(jù)公式(1)、(2)計算酶活。

1.2.7 重組ALDH2的分離純化

由于酵母自身的乙醛脫氫酶的酶活很高，為了盡量去除干擾，必須先分離純化后才能進行人源ALDH2的酶學性質研究[18]。用YPD培養(yǎng)基對工程菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，取發(fā)酵96 h的發(fā)酵液收集菌體，用蒸餾水洗滌菌體，加入10倍菌體的PBS緩沖液重懸菌體，由于發(fā)酵液處理量比較大，改用蝸牛酶進行破碎酵母細胞壁，提取胞內蛋白，按30 mg/g菌體的比例加入蝸牛酶，37 ℃水浴1 h破碎酵母細胞壁，離心，上清即為粗酶提取液。

利用鎳柱親和層析的方法對粗酶液進行純化并對純化后的人源ALDH2進行SDS-PAGE檢測，分析蛋白純化的效果和人源ALDH2的分子量大小。

1.2.8 重組ALDH2的酶學性質研究

重組ALDH2的最適pH及其pH穩(wěn)定性：為探究最適pH，將酶活測定體系的Tris-HCl(pH 9.2)和水換成不同pH梯度(pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)的廣泛緩沖液，其余條件不變，測定人源ALDH2的酶活，最高酶活計為100%，計算不同pH緩沖液中ALDH2的相對酶活。把酶液在上述不同pH條件下處理2 h后，測定其殘余酶活，以未經處理的酶活力為100%。

重組ALDH2的最適溫度及其溫度穩(wěn)定性：為探究人源ALDH2最適溫度，將反應體系分別在不同溫度(25、30、35、40、45、50、55、60 ℃)下測其酶活，以測得的的最高酶活為100%，計算其它溫度下的相對酶活；將酶在上述不同溫度下保溫2 h后，測定殘余酶活，以未經處理的酶活力為100%。

金屬離子對重組ALDH2活性的影響：在酶的反應體系中加入終濃度為0.1 mol/L的金屬離子(K+、Mg2+、Mn2+、Ca2+、Na+)，對重組ALDH2進行酶活測定，以未加任何金屬離子為對照。

重組ALDH2的動力學研究：將純化的酶加入到含有不同底物濃度乙醛(0.208～3.33 mmol/L)和不同濃度輔酶NAD+(0.083～1.33 mmol/L)中，利用Lineweavere-Burk plot法計算獲得ALDH2對乙醛的Km值、Vmax值和ALDH2對輔酶NAD+的Km值、Vmax值。

2 結果與分析

2.1 工程菌的構建與鑒定

2.1.1 重組質粒pYX212-ALDH2的構建與鑒定

按照上述1.2.1的方法構建重組質粒pYX212-ALDH2，挑取平板上長出的菌落，37 ℃，180 r/min床菌過夜培養(yǎng)后提取其質粒，經BamHI和EcoRI雙酶切鑒定，如圖3所示，經過雙酶切后，得到1條1 500 bp左右的條帶，與預期片段1 542 bp大小相符，并通過測序驗證，表明重組質粒pYX212-ALDH2構建成功。

M-10000 Marker；1-重組質粒雙酶切的鑒定結果
圖3 重組質粒的雙酶切鑒定
Fig.3 Identification of recombinant plasmid by double digestion

2.1.2 表達組件TRP1L-URA3-TPIp-ALDH-TPIt-TRP1R的構建與鑒定

按照1.2.2所述的融合PCR的原理和方法，構建ALDH2的基因表達組件TRP1L-URA3-TPIp-ALDH-TPIt-TRP1R。首先通過PCR獲得4個融合片段TRP1L(269 bp)、TRP1R(255 bp)、URA3(1235 bp)和TPIp-ALDH2-TPIt(2 614 bp)，利用融合PCR將4個片段進行融合，如圖4所示，獲得的融合片段大小為4 400 bp左右，與預期的片段大小(4 373 bp)相符，證明已融合成功，并將融合成功的片段與T載體連接，通過測序驗證了其序列的正確性。

M-5 000 Marker；1～3-表達組件的PCR結果(4 400 bp)
圖4 表達組件的融合與鑒定
Fig.4 The fusion and verification of expression cassette

2.1.3 基因工程菌的構建及鑒定

在trp1基因的整合位點處向兩端550 bp左右的位置設計引物F6/R6，挑取SC-URA3平板上的轉化子，經過YPD培養(yǎng)基活化后提取基因組作為模板，以引物F6/R6進行PCR驗證，如圖5所示，空白對照無任何條帶，陰性對照只能擴增出1 100 bp左右的片段，轉化子能擴增出5 500 bp左右的片段，與預期的片段大小相符，將圖5的片段膠回收，通過測序驗證了其序列和整合位點的正確性，將工程菌命名為W303-ALDH2。

M-10 000 Marker；1-空白對照；2-陰性對照；3～4-轉化子的PCR結果
圖5 表達組件整合位點的鑒定
Fig.5 Identification of component integration sites

2.2 發(fā)酵時間對產酶的影響

按照1.2.5的方法對發(fā)酵液進行處理并測粗酶液中乙醛脫氫酶的酶活，如圖6所示，可知工程菌W303-ALDH2的粗酶提取液中乙醛脫氫酶的酶活略高于原始菌的酶活且最佳的發(fā)酵時間是96 h，酶活達到4 790 U/L。

圖6 不同菌株的產酶曲線
Fig.6 The production curve of ALDH2 by different strains

2.3 重組ALDH2的分離純化

用1 mL His TrapTMexcel親和色譜柱對重組ALDH2進行分離純化，將純化后的酶液進行SDS-PAGE鑒定，結果如圖7所示，泳道4有1條56 kDa左右的蛋白質條帶，符合理論值的大小，大部分的雜蛋白從穿透峰中流出。收集洗脫峰對重組ALDH2進行酶學性質研究。

M-蛋白Marker；1-原始菌的穿透峰；2-原始菌的洗脫峰；3-工程菌的穿透峰；4-工程菌的洗脫峰
圖7 重組ALDH2純化后SDS-PAGE分析
Fig.7 SDS-PAGE analysis of purified recombinant ALDH2

2.4 重組ALDH2的活性檢測與酶學性質研究

收集洗脫峰對其活性進行檢測，純化后酶的活力為20.70 U/mg。重組ALDH2最適作用pH及pH穩(wěn)定性的研究如圖8所示，重組ALDH2的最適反應pH為5.0，在pH 3.0和pH 4.0的酸性條件下，仍能保持高于80%的比酶活力，但是重組ALDH2在酸性條件下不穩(wěn)定，在不同酸性條件下處理2 h后，在pH 5.0時，僅保留20%的比酶活力，在堿性條件下處理2 h，保留高于60%的比酶活力。

圖8 pH對重組ALDH2酶活(A)及其穩(wěn)定性(B)的影響
Fig.8 Effect of pH value on the activity (A) and stability (B) of recombinant ALDH2

重組ALDH2最適作用溫度及溫度穩(wěn)定性的研究如圖9所示，重組ALDH2的最適作用溫度為35 ℃，高于45 ℃時，酶活迅速下降；在低于40 ℃時有較好的熱穩(wěn)定性，當在溫度高于55 ℃保溫2 h后，酶活完全喪失。

圖9 溫度對重組ALDH2酶活(A)及其穩(wěn)定性(B)的影響
Fig.9 Effect of temperature on the activity (A) and stability (B) of recombinant ALDH2

金屬離子對重組ALDH2活性的影響如圖10所示，Na+對ALDH2有輕微的抑制作用，比酶活是對照組的80%，K+、Ca2+、Mg2+、Mn2+均能提高ALDH2的酶活，但是從提高酶活的穩(wěn)定性考慮，K+是最佳的ALDH2酶活促進劑。

圖10 金屬離子對重組ALDH2酶活的影響
Fig.10 Effect of metal ions on the activity of recombinant ALDH2

2.5 重組ALDH2的動力學常數(shù)

利用Lineweavere-Burk雙倒數(shù)作圖分別求取人源ALDH2對底物乙醛和輔酶NAD+的Km值和Vmax值，人源ALDH2作用底物乙醛的米氏方程為y=0.007 9x+0.008 7(R2=0.998 9)，求得米氏常數(shù)Km為0.908 mmol/L，最大反應速度Vmax為114.94 U/mg；人源ALDH2作用輔酶NAD+的米氏方程為y=0.004 8x+0.017(R2=0.993 6)，求得米氏常數(shù)Km為0.282 mmol/L，最大反應速度Vmax為58.82 U/mg。

3 討論

本研究從釀酒酵母W303-1A單倍體出發(fā)，基于融合PCR技術，將人源的ALDH2基因的表達組件TRP1L-URA3-TPIp-ALDH2-TPIt-TRP1R整合到酵母的基因組上，整合位點是trp1基因，整合成功的基因工程菌命名為W303-ALDH2，整合到宿主菌的基因組上實現(xiàn)了ALDH2基因的穩(wěn)定表達，與游離質粒表達相比，不會出現(xiàn)目的基因隨著傳代的次數(shù)增多而丟失的現(xiàn)象。

發(fā)酵實驗結果表明，工程菌和原始菌的最佳產酶的發(fā)酵時間是96 h，工程菌的粗酶提取液的酶活達到了4 790 U/L，其乙醛脫氫酶表達水平仍不太理想，可能是因為外源基因拷貝數(shù)較低或者是酵母本身的乙醛脫氫酶基因的表達抑制了外源基因的表達等其它原因，后期將通過工程菌本身攜帶的主要的乙醛脫氫酶基因進行敲除來提高人源ALDH2基因的表達。

重組ALDH2用鎳柱進行分離純化，純化后的比酶活力是20.70 U/mg，對人源ALDH2的基本酶學性質進行研究，結果表明該酶的最適溫度是35℃，最適pH是5.0，在pH 3.0的酸性條件下仍能保持80%左右的比酶活力，這為解酒酶制劑的生產提供了現(xiàn)實可能性，但是該酶在酸性條件下不穩(wěn)定，在酸性條件下處理2 h后，酶活大大降低，僅保留20%左右的比酶活力，后期仍需在提高酶的酸性穩(wěn)定性方面做研究。

除Na+外，K+、Ca2+、Mg2+、Mn2+均能不同程度地提高ALDH2的酶活；以乙醛為底物測得酶的Km值為0.908 mmol/L，最大反應速度Vmax為114.94 U/mg；以輔酶NAD+為底物測得酶的Km值為0.282 mmol/L，最大反應速度Vmax為58.82 U/mg。

與用大腸桿菌表達的乙醛脫氫酶和畢赤酵母經過甲醇誘導發(fā)酵的乙醛脫氫酶相比，本實驗的人源ALDH2基因與酵母強組成型啟動子磷酸丙糖異構酶(TPI)啟動子融合，在發(fā)酵過程沒有誘導劑的加入，產物的安全性大大的提高，并且該酶的最適溫度和最適pH都較接近于人體環(huán)境，這為解酒酶制劑的開發(fā)提供了理論可能性。