甜味劑萊鮑迪苷D的高效生物催化合成

費理文，王勇

1(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食用菌研究所，農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點實驗室，國家食用菌工程技術(shù)研究中心，國家食用菌加工技術(shù)研發(fā)分中心，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點開放實驗室，上海, 201403) 2(中科院上海生命科學(xué)研究院 植物生理生態(tài)研究所，上海, 200032)

來自甜葉菊的甜菊糖苷類化合物因其甜度高、熱量低、無毒性、耐高溫、耐酸堿和水溶性好等優(yōu)點，受到了科學(xué)界、產(chǎn)業(yè)界等多個領(lǐng)域的廣泛重視。其中含量相對豐富的甜菊糖、萊鮑迪苷A(Rebaudioside A，RA)等已廣泛應(yīng)用于飲料、食品、調(diào)味劑、酒類、乳制品等食品加工領(lǐng)域[1-9]。雖然RA和甜菊糖具有高甜度，但是口感上與蔗糖相比仍有除了甜味之外的苦后味等非純粹甜味[10]。而甜菊糖苷類化合物組分眾多，目前已知四十多種組分均具有四環(huán)二萜母核及不同程度的糖基化修飾，具有不同程度甜味口感[3, 11-13]。在這一點上萊鮑迪苷D(Rebaudioside D，RD)具有更好的口感特性，是甜菊糖苷類甜味劑開發(fā)的升級方向之一，美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration, FDA)于2017年認證RD為“一般安全”物質(zhì)(Generally Recognized as Safe，GRAS)應(yīng)用于食品行業(yè)[14]。

然而甜葉菊中RD這樣高品質(zhì)的組分含量低，僅占干葉質(zhì)量的約0.5%，用傳統(tǒng)分離方法難以得到高純度產(chǎn)品且產(chǎn)量也無法滿足市場需要[3]。為解決這一問題, 歐美等國都在研發(fā)甜菊糖苷類化合物的微生物異源合成方法, 期望能夠定向、高效地合成高品質(zhì)的甜菊糖苷組分。目前甜菊糖苷母核以及后續(xù)糖基化的生物合成過程及其相關(guān)的催化酶已基本清楚，為定向催化合成RD提供了基礎(chǔ)[3]。RD可由RA在尿苷二磷酸葡萄糖(uridine diphosphate glucose, UDPG)的存在下經(jīng)一步糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)獲得，本實驗室在前期工作中用水稻糖基轉(zhuǎn)移酶EUGT11構(gòu)建大腸桿菌異源表達體系，實現(xiàn)體外催化來源相對豐富的前體RA通過一步糖基化反應(yīng)生產(chǎn)RD[15]。但是該工程菌催化RD產(chǎn)量低下，需要向催化體系外源添加活化糖配體UDPG，而UDPG成本高昂，以外源添加形式進行生產(chǎn)不可行，因此需要進一步探索增加異源催化細胞內(nèi)源性UDPG供給的改造策略。為了增加大腸桿菌內(nèi)源性UDPG供應(yīng)，需要對宿主進行代謝工程改造，主要策略包括兩個方面：一方面是對宿主自身的代謝流進行改造，引導(dǎo)代謝物往UDPG富集的方向流動，并且減少UDPG的消耗途徑；另一方面是挖掘自然界其他物種的UDPG合成通路，將其引入大腸桿菌系統(tǒng)。本文利用基因重組技術(shù)對大腸桿菌宿主BL21(DE3)進行UDPG合成途徑中分支代謝的相關(guān)基因敲除改造，并且在染色體中整合可以利用蔗糖并將其磷酸化為UDPG合成前體1-磷酸葡萄糖(glucose-1-phosphate，G1P)的蔗糖磷酸化酶(E.C 2.4.1.7)以及催化UDPG合成的G1P尿苷基轉(zhuǎn)化酶基因，從而實現(xiàn)內(nèi)源性UDPG的富集。在經(jīng)UDPG富集化改造的宿主內(nèi)表達糖基轉(zhuǎn)移酶EUGT11可實現(xiàn)RD的高效全細胞催化(圖1)。該項工作探索出了切實可行的大腸桿菌全細胞催化糖基化產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化平臺催化平臺。

圖1 改造底盤細胞UDPG合成代謝路徑高效催化RA合成RD
Fig.1 Schematic diagram of chassis modification for enhanced biosynthesis of UDPG used in biocatalysis of RD from RA

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

起始菌株E.coliBL21(DE3)為本實驗室保藏，其他改造菌株為本實驗構(gòu)建，具體信息見表1。質(zhì)粒pYF09為本實驗室前期構(gòu)建[15]。

表1 底盤改造菌株與質(zhì)粒Table 1 Host strains and plasmids used in this study

引物合成及測序：上海生工；各限制性內(nèi)切酶：New England Biolabs公司；PrimeSTAR Max：大連TaKaRa公司；質(zhì)粒抽提及DNA片段純化與膠回收試劑盒：AXYGEN公司；Vazyme ClonExpress II 一步法克隆試劑盒：南京諾維贊；RA標(biāo)準(zhǔn)品(純度>97%)：Thermo Fisher；RD標(biāo)準(zhǔn)品(純度>95%)：四川盈嘉合生物科技；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、氨芐青霉素及卡納霉素：上海生工；酵母提取物及胰蛋白胨：OXOID公司；其余各種化學(xué)試劑：上海國藥集團。

1.2 儀器設(shè)備

PCR儀,Thermo Fisher；小型離心機,Eppendorf；高速冷凍離心機,Eppendorf；高效液相色譜儀Ultra 3000,Thermo Fisher(前戴安)；搖床,智誠。

1.3 方法

1.3.1 大腸桿菌E.coliBL21(DE3)底盤細胞改造

改造工作分為兩個部分，一方面是對E.coliBL21(DE3)1-磷酸葡萄糖(G1P)的非UDPG合成消耗途徑進行基因敲除，包括磷酸變位酶基因(phosphoglucomutase，pgm)、1-磷酸葡萄糖腺苷酰基轉(zhuǎn)移酶基因(G1P adenylyltransferase，glgC)以及1-磷酸葡萄糖磷酸酶基因(G1P phosphatases，agp)。這3個基因分別負責(zé)將1-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化成供應(yīng)糖酵解途徑的6-磷酸葡萄糖、形成糖原儲存前體ADP-葡萄糖以及降解。另一方面在染色體中引入異源途徑，提高G1P以及UDPG的合成。引入染色體的異源基因包括來源于青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)的蔗糖磷酸化酶基因(BasP，NCBI Gene ID: 4556453)以及來源于兩歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum)的G1P尿苷基轉(zhuǎn)化酶基因(UgpA，NCBI Gene ID: 9889115)。各改造菌株信息見表1, 突變菌株SG1～SG4依次敲除基因glgC、pgm、agp以及替換原有UDPG合成酶基因ushA為全合成的包含Basp和ugpA的T5 操縱子。E.coliBL21(DE3)染色體基因敲除參照經(jīng)改良的λRed-CRISPR/Cas技術(shù)方法[16]，首先針對各個被敲除基因設(shè)計CRISPR/Cas9特異性靶點gRNA，然后設(shè)計同源臂，接著構(gòu)建相應(yīng)pTargetT-Δ目標(biāo)基因質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化含有pCas質(zhì)粒(表達Cas9)的目標(biāo)菌株，對目標(biāo)基因進行無痕敲除(表1和表2)。SG1以E.coliBL21(DE3)為目標(biāo)菌株，隨后的SG菌株依此以前一個SG菌株為基因編輯目標(biāo)菌株。基因敲除及插入工作均由南京金斯瑞生物科技完成。

表2 基因敲除突變所用gRNA序列Table 2 List of gRNA sequences used for the creation of knockouts

1.3.2 全細胞催化合成RD

將pYF09轉(zhuǎn)化改造菌株，挑取含100 μg/mL氨芐青霉素的LB轉(zhuǎn)化平板上的單克隆接種至含抗生素的液體LB，37 ℃搖床轉(zhuǎn)速250 r/min培養(yǎng)過夜。然后以1%接種量接種至100 mL含抗生素的LB培養(yǎng)基，同樣條件培養(yǎng)約1.5 h監(jiān)測OD600值達到0.3～0.4左右時停止培養(yǎng)，菌液降溫至16 ℃左右后加入IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)劑IPTG終濃度0.1 mmol/L。隨后將培養(yǎng)菌液置于16 ℃，180 r/min轉(zhuǎn)速培養(yǎng)18 h培養(yǎng)結(jié)束后離心收集菌體，以100 mmol/L pH 8磷酸鈉緩沖液重懸清洗2遍后用于細胞催化反應(yīng)。基本催化體系為2 mL，以100 mmol/L pH8 磷酸鈉緩沖液配制，每mL 含0.2 g 濕菌體、60 mmol/L 檸檬酸三鈉、1 mmol/L RA、1 mmol/L UDPG、質(zhì)量分數(shù)5%蔗糖、0.1%體積分數(shù)Triton X-100，0.1 mmol/L ZnCl2。催化反應(yīng)條件為37 ℃，反應(yīng)時間24 h。隨后對SG4菌株的細胞催化進行單因素研究，在體系內(nèi)完全不添加UDPG的情況下，以基本催化體系和條件為基礎(chǔ)分別考察表面活性劑Triton X100體積分數(shù)(0、0.1%、0.5%、1%)、磷酸鈉緩沖液pH(6.4、7.0、7.2、7.4、8.0)、RA添加濃度(0.25、0.5、1、2、3 mmol/L)、蔗糖質(zhì)量濃度(0、100、150、200、300、400、500、600 g/L)、菌濃度(25、50、100、200、300 mL培養(yǎng)菌液離心所收集菌體)、檸檬酸鈉濃度(0、20、40、60、80、100 mmol/L)、反應(yīng)溫度(20、25、30、37、42、45、50 ℃)及轉(zhuǎn)化時間(0.5、1、2、3、4、5 d)8個因素對全細胞催化RA生產(chǎn)RD能力的影響。每個條件平行3組實驗。

1.3.3 檢測與統(tǒng)計分析

細胞催化結(jié)束后離心取上清，過濾0.2 μm濾膜后由高效液相進行檢測。色譜柱Thermo Hypersil Gold AQ 250 mm×4.6 mm×5 μm，檢測波長205 nm，柱溫控制40 ℃，進樣量40 μL。色譜條件為：A相水，B相乙腈，0～5 min 75% A +25% B，5～30 min 從25% B相乙腈濃度升高至65%，30～34 min保持65% B，34～35 min B相比例從65%降至25%，35～40 min 25% B。以標(biāo)品配置濃度梯度溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，RA標(biāo)準(zhǔn)曲線為UV205峰面積=0.260 6×RA濃度-0.931 8；RD標(biāo)準(zhǔn)曲線為UV 205 nm峰面積=0.202 5×RD濃度-0.1357。催化反應(yīng)結(jié)束后的反應(yīng)體系離心取上清，0.2 μm濾膜過濾后進行液相分析。數(shù)據(jù)由SPSS軟件中GLM one-way ANOVA進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 底盤改造菌株催化RA生產(chǎn)RD

本工作采用蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7)催化蔗糖產(chǎn)生果糖和G1P來分流糖酵解與UDPG的生物合成，同時引入UTP-1-磷酸葡萄糖尿苷轉(zhuǎn)移酶以實現(xiàn)UDPG的富集。表達宿主E.coliBL21(DE3)以方法1.3.1進行不同程度的改造，獲得突變宿主菌SG1、SG2、SG3和SG4。將含糖基轉(zhuǎn)移酶EUGT11的重組質(zhì)粒pYF09分別轉(zhuǎn)化到這些不同程度改造的宿主菌中，同時以原始菌株E.coliBL21(DE3)為陰性對照進行全細胞催化實驗，比較不同宿主菌的催化效果。結(jié)果顯示，各個改造宿主菌發(fā)酵生物量無明顯差別(圖2)。從催化生產(chǎn)RD的結(jié)果看，重組大腸桿菌pYF09-SG1及pYF09-SG2同改造前pYF09-BL21(DE3)相比催化活性沒有顯著差異，pYF09-SG3雖有所提高但差異并不顯著，只有pYF09-SG4催化所得RD則比未改造宿主及SG1、SG2有顯著提高，SG4宿主催化產(chǎn)生RD達317.3 mg/L(圖3)。

圖2 表達EUGT11的各重組菌生物量(誤差線：±SE)
Fig.2 Biomass of different engineered strains expressing EUGT11

圖3 表達EUGT11的不同重組菌株對轉(zhuǎn)化RA生產(chǎn)RD的影響
Fig.3 Effect of different EUGT 11 expressing E. coli strains on biocatalysis of RD from RA
誤差線: ± SE; 不同字母比較不同表達EUGT11 突變改造宿主的全細胞催化RA 生產(chǎn)RD 的能力，p<0.05

菌株SG1～SG3均為僅敲除大腸桿菌底盤中原有的G1P消耗途徑的突變株，以它們?yōu)樗拗鞅磉_EUGT11催化生產(chǎn)RD的結(jié)果顯示針對底盤原有G1P的改造并不能有效提高內(nèi)源UDPG的供應(yīng)(圖3)。而結(jié)合引入異源途徑增加G1P的合成后，RD產(chǎn)量就獲得了顯著增加，說明以大腸桿菌為宿主過表達糖基轉(zhuǎn)移酶進行全細胞催化糖基化反應(yīng)時，僅僅對原有UDPG合成通路進行分支代謝敲除是不夠的，還需要引入外源途徑方可滿足催化反應(yīng)需要(圖3)。針對UDPG代謝通路的改造以提高其內(nèi)源性供應(yīng)的嘗試已有不少，F(xiàn)AN[17]等人嘗試通過增強表達從6-磷酸葡萄糖到UDPG這條代謝路徑中的參與酶基因(pgm、ugp、glgX以及spy)來增加內(nèi)源性UDPG的供給，但除了增加ugp表達之外，其余針對6-磷酸葡萄糖(glucose-6-phosphate，G6P)及G1P的改造效果并不明顯。BRUYN[18-19]等人也發(fā)現(xiàn)，僅僅針對底盤自身的G1P消耗通路的相關(guān)基因敲除不能有效提高G1P含量，這可能與G6P與G1P均系中心代謝的樞紐，受到嚴(yán)格調(diào)控有關(guān)。本文中僅敲除E.coliBL21(DE3)G1P消耗途徑并不能有效提高RD產(chǎn)量，與前人工作結(jié)果一致?，F(xiàn)有文獻結(jié)果表明針對底盤內(nèi)源性UDPG供給的改造，需要引入外源合成UDPG的模塊才能有效提高UDPG供應(yīng)[18-25]，這也與本研究所得結(jié)果一致。

2.2 轉(zhuǎn)化條件對轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

獲得UDPG供給改造工程菌pYF09-SG4后需要進一步研究各催化條件對催化反應(yīng)的影響。前期以E.coliBL(DE3)為宿主構(gòu)建工程菌催化生產(chǎn)RD時，已經(jīng)研究了包括反應(yīng)緩沖液pH、表面活性劑、細胞用量、檸檬酸鈉濃度、UDPG濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間等催化條件，獲得了一些表達EUGT11細胞催化的優(yōu)化參數(shù)[15]。本文針對改造后宿主構(gòu)建的工程菌可能發(fā)生變化的催化條件，均進行了單因素研究。

在不添加外源UDPG進行全細胞催化時，表面活性劑Triton X100的最佳添加量為體積分數(shù)0.1%，繼續(xù)增加用量不僅無法提高RD產(chǎn)量，還會使整個體系在后續(xù)分離純化過程中產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，增加分離難度，且高濃度Triton X100還可能存在細胞毒性，降低RD產(chǎn)量(圖4-A)。催化反應(yīng)在磷酸鈉緩沖液pH 8.0時效果最佳，這與前期的研究結(jié)果一致，提示在催化反應(yīng)體系pH 8.0糖基轉(zhuǎn)移酶EUGT11效率高(圖4-B)[15]。檸檬酸鈉濃度在80及100 mmol/L時相較其他低濃度的RD產(chǎn)量更高，可能是在高濃度檸檬酸鈉條件下，細胞EMP途徑可獲得更有效的抑制，即細胞可更好地維持在靜息狀態(tài)進行生物催化反應(yīng) (圖4-C)。細胞用量在50 mL發(fā)酵液對應(yīng)菌體時RD產(chǎn)量最高(圖4-D)，過低的細胞用量達不到催化效果，而多余的細胞可能會影響催化體系的傳質(zhì)從而無法實現(xiàn)高效催化，這與前期以BL21(DE3)進行催化的趨勢相同[15]。RD產(chǎn)量隨底物RA添加量的增加而有所增加，但變化并不顯著，提示還有其他更關(guān)鍵的因素在影響生物催化反應(yīng)(圖4-E)。轉(zhuǎn)化時間1 d時達到最高，隨后開始下降，2 d后趨于平衡(圖4-F)。催化反應(yīng)最佳溫度為42 ℃，進一步升高溫度可能破壞蛋白結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致催化活性下降(圖4-G)。所有條件中，蔗糖濃度對RD產(chǎn)量的影響是最大的，增加體系內(nèi)蔗糖濃度可以極大提高RD產(chǎn)量，實現(xiàn)〉95%的底物轉(zhuǎn)化，提示低蔗糖濃度條件下UDPG的合成機制沒有充分運轉(zhuǎn)起來，導(dǎo)致UDPG供應(yīng)不足，從而使之成為了整個催化反應(yīng)的瓶頸(圖4-H)。催化反應(yīng)的體系需要添加500 g/L高濃度蔗糖才能到達最高產(chǎn)量,可能是源于大腸桿菌B株系列的BL21(DE3)缺乏蔗糖透性酶，胞外蔗糖無法有效地進入細胞內(nèi)部[26]。而高濃度的蔗糖一方面可以通過濃度梯度進入細胞，另一方面可以通過高滲透壓導(dǎo)致細胞通透性提高而進入細胞。在SCHM?LZER[20]的研究中，以E.coliBL21(DE3)為宿主催化合成UDPG，外源添加蔗糖的濃度也高達50%，與本研究結(jié)果相似。

A-表面活性劑Triton X100對RD產(chǎn)量的影響；B-緩沖液pH對RD產(chǎn)量的影響；C-檸檬酸鈉對RD產(chǎn)量的影響；D-菌量對RD產(chǎn)量的影響；E-RA濃度對RD產(chǎn)量的影響；F-生物轉(zhuǎn)化時間對生產(chǎn)RD的影響；G-催化溫度對RD產(chǎn)量的影響；H-蔗糖濃度對RD產(chǎn)量的影響
圖4 細胞催化條件對pYF09-SG4生物催化RA生產(chǎn)RD的影響
Fig.4 Effect of different conditions on biocatalysis of RD by pYF09-SG4
(誤差線±SE，不同字母表示顯著差異，p<0.05)

3 結(jié)論

本研究建立了利用水稻糖基轉(zhuǎn)移酶EUGT11及經(jīng)過UDPG通路改造的大腸桿菌全細胞催化合成甜菊糖苷RD的方法。為了解決大腸桿菌內(nèi)源糖供體不足UDPG的問題，對E.coliBL21(DE3)進行UDPG合成途徑中代謝分支的相關(guān)基因敲除改造，同時在染色體中整合了蔗糖磷酸化酶基因(BasP)及G1P尿苷基轉(zhuǎn)化酶基因(UgpA)，使UDPG得以富集。以經(jīng)改造的SG4宿主菌表達EUGT11催化RA生產(chǎn)RD，經(jīng)過條件優(yōu)化后可催化1 mmol/L RA(約1 g/L)生成約1.1 g/L RD，底物轉(zhuǎn)化率達98.5%，為工程化生產(chǎn)稀少組分RD奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。