丙烯酰胺母源性暴露對(duì)仔鼠海馬齒狀回DCX和GAP?43表達(dá)的影響

楊德慧 賴勝敏 古梓婷 劉鴻慶 馬宇昕 羅利 李國(guó)營(yíng) 劉靖

廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室（廣州 510006）

丙烯酰胺（acrylamide，ACR）是一種可溶于水的乙烯基單體，其復(fù)合體聚丙烯酰胺廣泛應(yīng)用于化工行業(yè)［1］。業(yè)已證實(shí)ACR對(duì)人和動(dòng)物具有神經(jīng)毒性，能夠選擇性地?fù)p害中樞神經(jīng)和周?chē)窠?jīng)的神經(jīng)元終末，出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)、肢體乏力、四肢麻木、感覺(jué)障礙等一系列臨床癥狀［2］。然而關(guān)于ACR神經(jīng)發(fā)育毒性報(bào)道較少，胎兒和嬰兒正處于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育重要階段，特別是血腦屏障尚未發(fā)育成熟，可能更容易受到各種有害因素的損傷，特別是神經(jīng)毒物。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中，雙皮質(zhì)素（doublecortin，DCX）和生長(zhǎng)相關(guān)蛋白?43（growth associated protein?34，GAP?43）共同參與了神經(jīng)元生成和發(fā)育的全過(guò)程。其中，DCX是一種微管相關(guān)蛋白，在神經(jīng)元分化和遷移過(guò)程中階段性地表達(dá)于神經(jīng)元的突起和胞體上，其陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量可以反映海馬齒狀回新生神經(jīng)元的增殖情況［3］。另外，GAP?43是一種促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)與合成的胞膜上的特異性磷酸蛋白，能夠促進(jìn)神經(jīng)元軸突的延伸［4］。

因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立ACR母源性暴露，檢測(cè)仔鼠海馬齒狀回DCX和GAP?43的表達(dá)情況進(jìn)行探討ACR對(duì)神經(jīng)元的生長(zhǎng)發(fā)育的影響，為研究ACR的神經(jīng)發(fā)育毒性提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有利于優(yōu)生優(yōu)育。

1 材料與方法

1.1 主要試劑ACR（美國(guó)Sigma公司，純度99.9%）、Rabbit Anti?DCX（美國(guó) Abcam 公司）、Rabbit Anti?GAP?34（武漢博士德生物公司）、HRP標(biāo)記山羊抗兔（美國(guó)Ear thox公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6周齡級(jí)SD大鼠由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK（粵）2013?0002。雌鼠32只，雄鼠16只，體質(zhì)量140～160 g，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在SPF級(jí)的條件下自由攝食和飲水，雌鼠懷孕后單籠飼養(yǎng)。

1.3 動(dòng)物分組及染毒SD大鼠體成熟后，雌雄以1∶1進(jìn)行交配，孕鼠隨機(jī)分為4組，分別為對(duì)照組（0 mg/kg）、低（4.5 mg/kg）、中（9 mg/kg）和高（18 mg/kg）劑量組，每組8只。于母鼠妊娠第15天開(kāi)始灌胃給藥，連續(xù)給藥至分娩后第13天，分娩后第14天，對(duì)仔鼠進(jìn)行取材。

1.4 動(dòng)物取材仔鼠出生后第14天，在4%水合氯醛腹腔注射麻醉下，以0.9%生理鹽水沖洗和4%多聚甲醛溶液灌注，灌注固定后取腦置于4%多聚甲醛中固定48 h，組織常規(guī)脫水和石蠟包埋，用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)切片常規(guī)脫蠟至水，在0.01 mol/L pH 6.0檸檬酸緩沖液中微波修復(fù)20 min，3%H2O2?PBS室溫處理30 min，5%BSA封閉液37℃封閉30 min，于4℃冰箱孵育一抗過(guò)夜。次日滴加HRP標(biāo)記的二抗在37℃孵育40 min。DAB顯色4.5 min，切片置于ddH2O終止顯色。蘇木素染色15 s，自來(lái)水返藍(lán)2 min。切片繼續(xù)脫水后用中性樹(shù)脂封片。封片后選取每組每只大鼠2張切片，隨機(jī)選取3個(gè)視野，用Image pro?plus 6.0圖像分析軟件計(jì)算免疫陽(yáng)性表達(dá)物積分光密度值（IOD）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用Image pro?plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行光密度值分析，陽(yáng)性表達(dá)物的平均光密度值，以表示，結(jié)果采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ACR對(duì)P14仔鼠海馬齒狀回GAP?43表達(dá)的影響 見(jiàn)圖1，GAP?43陽(yáng)性表達(dá)物為黃棕色物質(zhì)，環(huán)繞細(xì)胞核分布，呈中空狀。GAP?43能夠調(diào)節(jié)軸突的生長(zhǎng)，是神經(jīng)元發(fā)育過(guò)程中的標(biāo)志位之一。與對(duì)照組和低劑量組相比較，中、高劑量組仔鼠海馬齒狀回GAP?43均明顯有減少（P＜0.01）。見(jiàn)圖2。

圖1 各實(shí)驗(yàn)組仔鼠海馬GAP?43的表達(dá)情況（IHC×400）Fig.1 Effect of ACR on expression of GFAP in the hippocampal mother rats

表1 ACR染毒對(duì)仔鼠海馬齒狀回GAP?43表達(dá)的影響Tab.1 Effect of ACR on expression of GAP?43 in the hippocampal dentate of offsprings（n=8） x± s

2.2 ACR對(duì)P14仔鼠海馬齒狀回DCX表達(dá)的影響本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)P14仔鼠海馬齒狀回中DCX的陽(yáng)性表達(dá)來(lái)檢測(cè)神經(jīng)元突起形成的情況。與對(duì)照組相比較，ACR中、高劑量組仔鼠海馬齒狀回DCX的陽(yáng)性表達(dá)物均顯著減少（P＜0.01）。

3 討論

圖2 各實(shí)驗(yàn)組仔鼠海馬DCX的表達(dá)情況（IHC×400）Fig.2 Effect of ACR on expression of DCX in the hippocampal mother rats

表2 ACR染毒對(duì)仔鼠海馬齒狀回DCX表達(dá)的影響Tab.2 Effect of ACR on expression of DCX in the hippocampal dentate of offsprings（n=8）±s

表2 ACR染毒對(duì)仔鼠海馬齒狀回DCX表達(dá)的影響Tab.2 Effect of ACR on expression of DCX in the hippocampal dentate of offsprings（n=8）±s

注：與對(duì)照組相比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別對(duì)照組低劑量組中劑量組高劑量組IOD of DCX 9.37±0.70 7.75±0.39 6.21±0.33*4.43±0.56**

ACR是生產(chǎn)聚丙烯酰胺的原材料，廣泛應(yīng)用于各行業(yè)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)業(yè)已證實(shí)ACR具有多種毒性，并在人體發(fā)現(xiàn)其神經(jīng)毒性。ACR可以通過(guò)多種途徑進(jìn)行傳播，胎盤(pán)和哺乳亦是ACR傳播的方式［1］。ACR的神經(jīng)毒性具有累積性，低劑量長(zhǎng)期染毒和高劑量短期染毒均可導(dǎo)致明顯的神經(jīng)毒性［5］。ACR母源性暴露后，胎兒和嬰兒的健康與安全受到威脅［6］。海馬屬于邊緣系統(tǒng)的一部分，不但與學(xué)習(xí)、記憶、情緒等相關(guān)，其中齒狀回顆粒下層（subgranular zone，SGZ）更是神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)再生的重要部位之一。神經(jīng)干細(xì)胞位于海馬門(mén)區(qū)與顆粒細(xì)胞層之間的顆粒下層，新生成的神經(jīng)元從顆粒下層移入顆粒層，接受突觸傳入沖動(dòng)，把軸突伸進(jìn)苔狀纖維通路，整合到海馬功能的神經(jīng)環(huán)路中，參與海馬的學(xué)習(xí)記憶等功能活動(dòng)［7］。有研究顯示，母鼠通過(guò)飲水?dāng)z入ACR后，仔鼠海馬齒狀回Reelin免疫反應(yīng)細(xì)胞和谷氨酸脫羧酶67免疫反應(yīng)細(xì)胞呈劑量依賴性的增加，ACR干擾了海馬齒狀回神經(jīng)元的遷移和定位［8］。而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程中，神經(jīng)元所分泌的蛋白GAP?43和DCX共同參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元的生長(zhǎng)與發(fā)育。因此，我們通過(guò)檢測(cè)仔鼠海馬GAP?43和DCX表達(dá)情況，研究ACR對(duì)神經(jīng)元發(fā)育的影響。

在本研究中，ACR暴露后，與對(duì)照組相比較，中、高劑量組仔鼠海馬齒狀回GAP?43的表達(dá)明顯下降。GAP?43是一種磷酸蛋白，特異性地表達(dá)于神經(jīng)元胞膜上，調(diào)節(jié)軸突的生長(zhǎng)、突觸的形成和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放［9-10］。在神經(jīng)元發(fā)育過(guò)程中，GAP?43引導(dǎo)軸突生長(zhǎng)和調(diào)節(jié)突觸聯(lián)系中發(fā)揮著重要作用［9］。GAP?43表達(dá)的含量與軸突的生長(zhǎng)、突觸的塑造狀態(tài)相一致［11］。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中，GAP?43有較高的表達(dá)，被認(rèn)為是神經(jīng)元發(fā)育和再生的一個(gè)內(nèi)在決定因子，能夠促進(jìn)神經(jīng)元軸突的生長(zhǎng)［12］。GAP?43的減少將降低軸突結(jié)構(gòu)的可塑性，包括軸突與樹(shù)突的發(fā)芽，其表達(dá)與神經(jīng)元軸突和樹(shù)突的功能呈正相關(guān)［13?14］。由此筆者推測(cè)，GAP?43表達(dá)減少后，神經(jīng)元軸突和樹(shù)突的發(fā)育受到了抑制。另外，本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ACR暴露后仔鼠海馬齒狀回DCX亦顯著表達(dá)減少。DCX是一種微管相關(guān)蛋白，在神經(jīng)元分化、遷移過(guò)程中階段性地表達(dá)于神經(jīng)元周?chē)耐黄鸷桶w上，參與神經(jīng)元突起的形成與發(fā)育［3］。DCX可促進(jìn)微管聚合并穩(wěn)定其網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，在神經(jīng)元遷移過(guò)程中控制著神經(jīng)元的聚合，穩(wěn)定細(xì)胞骨架［15］。DCX表達(dá)下降，提示ACR母源性暴露可能導(dǎo)致仔鼠海馬神經(jīng)發(fā)生、分化受到抑制。有實(shí)驗(yàn)報(bào)道，把ACR注射到小鼠體內(nèi)后，能夠抑制其海馬齒狀回增殖活性，新生神經(jīng)元減少［16］。ACR母源性暴露后，仔鼠海馬齒狀回GAP?43和DCX的表達(dá)均下降，提示ACR可能影響海馬神經(jīng)元的增殖、分化以及神經(jīng)元軸突的延伸。ACR的神經(jīng)發(fā)育毒性作用可能是多因素的，其作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，母源性暴露后ACR能夠減少仔鼠大腦GAP?43和DCX的表達(dá)，可能抑制了海馬神經(jīng)元的生長(zhǎng)發(fā)育。而海馬區(qū)與學(xué)習(xí)、記憶等高級(jí)功能密切相關(guān)，ACR母源性暴露后可能會(huì)影響到仔鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力發(fā)展［17］。

［1］ERKEKOGLU P，BAYDAR T.Acrylamide neurotoxicity［J］.Nutr Neurosci，2014，17（2）：49?57.

［2］LOPACHIN R M，GAVIN T.Acrylamide?induced nerve termi?nal damage：relevance to neurotoxic and neurodegenerative mechanisms［J］.J Agric Food Chem，2008，56（15）：5994?6003.

［3］FRANCIS F，KOULAKOOF A，BOUCHER D，et al.Double?cortin is a developmentally regulated，microtubule?associated protein expressed in migrating and differentiating neurons［J］.Neuron，1999，23：247?256.

［4］陳慶友，師巖，王中華.丁苯酞改善血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能及其對(duì)海馬區(qū)GAP?43和突觸素表達(dá)的影響［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2016（8）：1830?1831.

［5］LOPACHIN R M.Acrylamide neurotoxicity： neurological，morhological and molecular endpoints in animal models［J］.Adv Exp Med Biol，2005，561：21?37.

［6］FRIEDMAN M A，TYL R W，MARR M C，et al.Effects of lac?tational administration of acrylamide on rat dams and offspring［J］.Reprod Toxicol，1999，13（6）：511?520.

［7］ZHAO C，DENG W，GAGE F H.Mechanisms and functional implications of adult neurogenesis［J］.Cell，2008，132（4）：645?660.

［8］OGAWA B，OHISHI T，WANG L，et al.Disruptive neuronal development by acrylamide in the hippocampal dentate hilus af?ter developmental exposure in rats［J］.Arch Toxicol，2011 ，85（8）：987?994.

［9］DONNEIIL C J，PARK M，SPILLANE M，et al.Axonally syn?thesized β?actin and GAP?43 proteins support distinct modes of axonal growth［J］.J Neurosci，2013，33（8）：3311?3322.

［10］MUTTUCUMARU N，POWERS S J，ELMORE J S，et al.Acrylamide?forming potential of potatoes grown at different loca?tions，and the ratio of free asparagine to reducing sugars at which free asparagine becomes a limiting factor for acrylamide?formation［J］.Food Chem，2017，220：76?86.

［11］GUPTA S K，MISHRA R，KUSUM S，et al.GAP?43 is essen?tial for the neurotrophic effects of BDNF and positive AMPA re?ceptor modulator S18986［J］.Cell Death Differ，2009，16（4）：624?637.

［12］張征宇，袁寶莉，鄧素娟.1，6?二磷酸果糖對(duì)腦白質(zhì)損害大鼠皮質(zhì)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43表達(dá)的影響［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2011，27（13）：2330?2333.

［13］CHEN M Y，WANG E H，WOODSON W J，et al.Optogenetic neuronal stimulation promotes functional recovery after stroke［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2014，111（35）：12913?12918.

［14］SHAH A M，ISHIZAKA S，CHENG M Y，et al.Optogenetic neuronal stimulation of the lateral cerebellar nucleus promotes persistent functional recovery after stroke［J］.Sci Rep，2017，7：46612.

［15］MERZ K，LIE D C.Evidence that Doublecortin is dispensable for the development of adult born neurons in mice［J］.PLoS One，2013，8（5）：e62693.

［16］PARK H R，KIM M S，KIM S J，et al.Acrylamide induces cell death in neural progenitor cells and impairs hippocampal neurogenesis［J］.Toxicol Lett，2010，193（1）：86?93.

［17］劉富，兵尹力，朱宇航，等.異氟醚對(duì)老年大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬NMDAR1表達(dá)的影響［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2016，32（1）：34?37.