基于表面增強拉曼光譜的小鼠流感血清檢測技術

張會敏 曲新艷 周喆 王升啟

1山東省中醫(yī)藥研究院（濟南250014）；2山東省分析測試中心（濟南 250014）；3中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所（北京100850）

流感病毒可引起急性呼吸道傳染病，其中以甲型流感病毒傳染性最強，且易發(fā)生變異，易引起爆發(fā)性的流行。目前，甲型H1N1流感病毒檢測的常用技術主要有病毒分離培養(yǎng)法、RT?PCR檢測［1］、膠體金檢測等。表面增強拉曼光譜技術（surface?enhanced Raman spectroscopy，SERS）具有對樣品無損傷、用量少，檢測簡單、靈敏度高、特異性高的優(yōu)點，同時克服了常規(guī)拉曼光譜信號弱的缺點，因而近年來在臨床診斷、生物檢測、藥品非法添加快檢等［2-6］領域得到了較為廣泛的應用。國外學者通過SERS鑒定新出現的流感病毒［7］，研究表明無需樣品擴增或標記，SERS還可直接識別與毒力相關的流感NA突變［8］。因此，本文以納米銀溶膠為活性基底，采用便攜式拉曼光譜儀分別檢測正常組、模型組、達菲組小鼠血清拉曼增強光譜，并進行正交校正的偏最小二乘辨別分析（OPLS?DA），初步探索基于表面增強拉曼光譜的流感血清檢測方法，旨在為建立一種快速、簡便、低成本，可用于甲型H1N1流感病毒檢測的新技術提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料流感病毒株：甲型流感病毒亞型FM1小鼠適用株，由中國疾病預防控制中心提供。干預藥物：磷酸奧司他韋片（達菲），臨用前配成1 mg/mL；麻醉藥物：戊巴比妥鈉，實驗前用生理鹽水配成10 mg/mL；實驗動物：SPF級BALB/c小鼠，雄性，體質量18～20 g，購自維通利華實驗動物有限公司［許可證號：SCXK（京）2012?0001］。

1.2 實驗試劑和儀器主要試劑：檸檬酸鈉、氯金酸；抗壞血酸、高氯酸銀；單晶硅片（浙江立晶）。主要儀器：i?Raman Plus BWS465?785H 便攜式拉曼光譜儀、back?illuminated CCD檢測器、低溫高速離心機、萬分之一電子天平、加樣槍、加熱磁力攪拌器、超聲清洗儀、Millli?Q超純水系統(tǒng)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組將60只小鼠［體質量（18±1）g，雄性］，按體質量分層隨機分為正常對照組（C）、病毒感染組（V）、達菲組（D）3組，每組20只（其中10只小鼠用于觀察死亡率、生存指數，評價流感模型造模是否成功）。適應性喂養(yǎng)48 h后開始造模實驗。腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，麻倒后，吸取20 μL 4LD50的病毒液滴鼻攻毒，注意讓小鼠充分吸入病毒液。給藥方法：于感染病毒1 d后灌胃給藥，每只小鼠灌胃給藥劑量為0.2 mL/10 g，每天同一時間灌胃1次，正常對照組和模型組每天以等體積的生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃6 d，觀察14 d。

1.3.2 血清制備分別于感染病毒后第3、5天兩個時間點，每組取小鼠3只，摘眼球方式取血，實驗前禁食不禁水8 h。不加抗凝劑，靜置2 h后，以轉速3 000 r/min離心10 min，取上清液即為血清。分裝之后保存于-80℃冰箱內，備用。

1.3.3 RT?PCR測定肺組織中流感病毒RNA復制數稱取第3、5天各組肺組織（RNA Later浸泡）50 mg，置含有0.5 mL Trizol試劑的 EP管（2 mL，RNase?Free）中，將EP管置于勻漿機中研磨（60 Hz，60 s），Trizol法提取肺組織總RNA。按照Aglilent RNA 6000 Pico Quick Start Guide說明書，使用AGI?LENT 2100測定總肺組織總RNA完整性，然后使用甲型流感病毒/乙型流感病毒核酸檢測試劑盒（PCR熒光探針法）檢測肺勻漿中流感病毒RNA復制數。

1.3.4 納米膠體銀溶液的制備Lee法：稱取36 mg硝酸銀于燒瓶中，加200 mL水溶解，將溶液加熱至沸騰并磁力攪拌。然后，迅速加入4 mL新鮮1%（W/V）檸檬酸鈉溶液，保持溶液沸騰1 h，連續(xù)攪拌，至顏色變黃、灰，說明已形成納米膠體銀（AgNPs）溶液，冷卻，備用。

1.3.5 待測樣品處理取各組小鼠血清與納米膠體銀溶液按照不同比例混合，考察并優(yōu)選合適的比例；按照優(yōu)選出的比例將血清與納米膠體銀溶液混勻，靜置30 min，取2 μL混合液點樣于直徑為0.4 cm的硅片上，每份血清平行點樣3份，待室溫下干燥后，置拉曼光譜儀上進行SERS圖譜測定，每個血清樣本測量3次，取平均值。

1.3.6 SERS光譜測試條件激發(fā)光波長為785 nm，光譜測量范圍為500～1 800 cm-1，光譜分辨率為2.0 cm-1，激發(fā)功率位20 mW，積分時間為10 s。

1.4 統(tǒng)計學方法使用Bwspec4軟件進行背景扣除和光譜平滑處理，并進行歸一化處理，以減少光譜強度差異帶來的影響；運用Simca?P+14.0對各組SERS數據進行正交校正的偏最小二乘辨別分析（OPLS?DA）。

2 結果

2.1 血清:Ag NPs不同混合比例考察結果對血清與納米膠體銀溶液混合比例進行了一系列考察，考察范圍為血清：Ag NPs（4∶1）至血清：Ag NPs（1∶20），SERS圖譜見圖1。由圖1可見，血清：Ag NPs（4∶1）至血清：Ag NPs（1∶4）對應的 SERS 特征峰逐漸尖銳，說明隨著加入的Ag NPs增多，峰型越尖銳，激發(fā)強度增強，SERS特征峰越明顯；但當加入的Ag NPs從4倍增大到20倍過程中，峰型基本上一致，沒有明顯變化。經譜峰對比，最終選擇血清：Ag NPs（1∶4）作為血清與納米膠體銀溶液混合的最適比例。

圖1 血清：Ag NPs不同混合比例考察結果Fig.1 Results of Serum：Ag NPs mixed proportion

2.2 小鼠流感血清SERS特征圖譜由各組小鼠血清SERS譜圖2可知，1 650和1 330 cm-1分別是血清白蛋白的酰胺Ⅰ和酰胺Ⅲ貢獻的拉曼特征峰［9］。1 006 cm-1為蛋白質的側鏈苯丙氨酸的單基取代苯基環(huán)，該峰在蛋白質的拉曼光譜中屬于強峰。1 204和1 590 cm-1也屬于苯丙氨酸的殘基特征峰［11］。在810 cm-1處有非常強的譜峰，屬于天冬氨酸的拉曼光譜。634、1 130 cm-1譜帶屬于碳水化合物D-甘露糖的特征譜帶［10］。血清中含量很低的糖類在銀膠體粒子聚集形成的“熱點”處，局域電場的強度得到提高，從而導致的SERS光譜也能被探測到。1 130、1 440 cm-1譜帶屬于脂類的特征拉曼峰［12］。在納米膠體銀作為SERS襯底下，血清中含量高的白蛋白及量非常低的成分如糖類和脂類都可以獲得的拉曼光譜［13］，見表1。參考文獻報道血清SERS圖譜特征峰歸屬對15個峰進行了初步的震動模式指認。并選取1 076 cm-1作為分析譜線的標準，比較各組血清SERS圖譜特征峰強度差異，見表2。

圖2 各組小鼠血清SERS圖譜比較Fig.2 Comparison of serum SERS spectrum of mice in each group

流感病毒感染第3天時，流感病毒感染組小鼠血清在1 440、758、710 cm-1處SERS特征峰強于正常組，這些拉曼峰主要歸屬于磷脂、D?甘露糖及輔酶、乙酰輔酶類成分；而流感病毒感染第5天時，流感病毒感染組小鼠血清在1 650、1 590、1 440、1 204、1 180、1 130、950、634 cm-1處SERS特征峰強于正常組，這些拉曼峰主要歸屬于酰胺I、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、磷脂、乙?；咸烟?、β?胡蘿卜素、D?甘露糖、酪氨酸。可見，從感染流感病毒后第3～5天，流感病毒感染組小鼠血清SERS各特征峰信號明顯增強。

表1 小鼠流感血清SERS圖譜特征峰的歸屬及其振動模式Tab.1 Characteristic attribution and vibrational modes of the SERS spectrum peaks of mice serum

表2 各組SERS圖譜特征峰差異Tab.2 Difference of characteristic peaks of SERS spectra in each group（n=9）

2.3 統(tǒng)計分析結果

2.3.1 OPLS?DA分析結果運用OPLS?DA對第3、5天正常組、病毒組、達菲組3種血清SERS光譜分別進行組間差異分析。由圖3可見，在流感病毒感染第3天時，正常組與流感病毒感染組血清樣本之間具有明顯的組內聚集和組間分離的趨勢，該模型的預測能力評估參數分別為R2X（cum）=0.662，R2Y（cum）=0.359，Q2（cum）=0.225，表明該模型的耐用性較高，而預測能力一般。由圖4可見，在流感病毒感染第5天時，正常組與流感病毒感染組血清樣本之間具有顯著的組內聚集和組間分離的趨勢，該模型的預測能力評估參數分別為R2X（cum）=0.849，R2Y（cum）=0.707，Q2（cum）=0.555，表明該模型的耐用性較高，模型預測能力良好。由得分圖可直觀3種血清的得分值雖有少量的交叉重疊，但3種血清表現出較為明顯的分離趨勢。

圖3 流感病毒感染第3天各組血清樣本得分圖Fig.3 Serum samples score of third day after influenza virus infection

2.3.2 ROC曲線評估結果ROC曲線可反映模型預測能力的敏感性和特異性連續(xù)變量的綜合指標。ROC曲線下面積（AUC）越大，模型預測能力越高。采用ROC曲線對OPLS?DA建立的3種血清SERS圖譜模型進行評估，見圖5、6。在流感病毒感染第3天時，正常組、流感病毒感染組、達菲組3組的AUC分別為0.883、0.889、0.821；在流感病毒感染第5天時，正常組、流感病毒感染組、達菲組3組的AUC分別為1.00、0.969、0.994。結果表明，OPLS?DA分析能夠對3組血清進行良好的區(qū)分、鑒別。

圖4 流感病毒感染第5天各組血清樣本得分圖Fig.4 Serum samples score of fifth day after influenza virus infection

注：1，正常組；2，病毒組；3，達菲組。AUC（1）=0.882 716，AUC（2）=0.888 889，AUC（3）=0.820 988

2.4 各組肺組織中流感病毒RNA復制數的比較被感染器官內病毒RNA的量決定了病毒復制的含量和病變的程度。RT?PCR結果顯示，正常組小鼠肺組織內無病毒RNA表達，被流感病毒感染后，病毒組及達菲組小鼠第3天和第5天肺組織病毒RNA復制數均顯著增高。小鼠感染流感病毒后，給藥第3、5天，病毒組及達菲組肺組織中病毒RNA復制數差異均有顯著性（P＜0.01），見圖7。

3 討論

本文采用流感病毒滴鼻感染法造模，每組設置10只小鼠用于觀察死亡率、存活率，來評價流感模型造模是否成功。結果顯示，與正常組相比，病毒模型組動物病死率為100%，平均存活時間為6.4 d，達菲組動物病死率為10%，平均存活時間為13.3 d。結合感染小鼠均出現不同程度的流感樣發(fā)病癥狀，如弓背、聳毛、精神不振、毛發(fā)無光澤，喘息、發(fā)抖、飲食下降、閉眼，第5天開始出現聚堆，行走搖擺不定，極少活動等現象，說明流感模型造模成功。

圖6 感染第5天各組血清SERS圖譜的ROC曲線圖Fig.6 ROC curve of serum SERS spectrum in each group after fifth day infection

圖7 各組肺組織中流感病毒RNA復制數的比較Fig.7 Comparison of the number of RNA replicas of influenza virus in lung tissues of each group

通過對測得的各組SERS譜峰進行歸屬指認發(fā)現，這些特征峰主要來自蛋白質、脂類、堿基、多肽、氨基酸、碳水化合物等成分中各種化學鍵（官能團）不同振動和轉動模式，包括伸縮振動、彎曲振動等。從感染流感病毒后第3～5天，流感病毒感染組小鼠血清SERS各特征峰信號明顯增強（表2），這些信號增強的特征峰主要為酰胺I、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、磷脂、乙酰基葡萄糖、β?胡蘿卜素、D?甘露糖、酪氨酸等。血清中各種成分主要來源于細胞分泌的蛋白質或細胞因子或者代謝物（包括藥物代謝物），血清中各種成分的改變是引起SERS譜峰差異的原因，而血清中各種成分的改變又可直接反映體內組織細胞生理和病理的變化?？梢?，這些發(fā)生變化的SERS特征峰所對應的成分與流感病毒對機體的影響有著密切的聯系。

OPLS?DA可以更好地區(qū)分組間差異，提高模型的有效性和解析能力。由OPLS?DA對第3、5天正常組、病毒組、達菲組3種血清SERS光譜分別進行組間差異分析結果可知，在第3、5天兩個時間點，這3種血清均表現出較為明顯的分離趨勢（圖3、4）。由ROC曲線對OPLS?DA建立的3種血清SERS圖譜模型評估結果可見，OPLS?DA分析能夠對3組血清進行良好的區(qū)分、鑒別。通過以上實驗結果可見，SERS檢測鑒別結果與RT?PCR檢測鑒別結果一致。因此，利用所建立的SERS技術，結合OPLS?DA多元分析方法，將有望用于快速鑒別和診斷機體是否感染了流感病毒。

［1］廖嘉儀，張濤.血清淀粉樣蛋白A聯合C反應蛋白對兒童甲型流感早期診斷價值的評價［J］.實用醫(yī)學雜志，2017，33（14）：2368?2370.

［2］邵鋒，陳坤，羅志輝，等.SERS技術在疾病診斷和生物分析中的應用［J］.化學進展，2012，24（12）：2391?2402.

［3］SCHLüCKER S.Surface?enhanced Raman spectroscopy：con?cepts and chemical applications［J］.Angew Chem lnt Ed Engl，2014，53（19）：4756?4795.

［4］俞允，何雁，陳偉煒，等.拉曼光譜在中藥檢測中的研究進展［J］.江西中醫(yī)學院學報，2013，25（2）：85?88.

［5］XIAO R，ZHANG X，RONG Z，et al.Non?invasive detection of hep atocellular carcinoma serum metabolic profile through surface ?en ?hanced Raman spectroscopy［J］.Nanomedicine，2016，12（8）：2475?2484.

［6］LI X，YANG T，LI S，et al.Noninvasive liver diseases detec?tion based on serum surface enhanced Raman spectroscopy and statistical analysis［J］.Opt Express，2015，23（14）：18361?18372.

［7］LIM J Y，NAM J S，YANG S E，et al.Identification of Newly Emerging Influenza Viruses by Surface?Enhanced Raman Spec?troscopy［J］.Anal Chem，2015，87（23）：11652?11659.

［8］CHOI J，MARTIN S J，TRIPP R A，et al.Detection of neur?aminidase stalk motifs associated with enhanced N1 subtype in?fluenza A virulence via Raman spectroscopy［J］.Analyst，2015，140（22）：7748?7760.

［9］ERIK R，FARQUHAR，JOSEPH P，et al.In vivo self?hydrox?ylation of an iron?substituted manganese?dependent extradiol cleaving catechol dioxygenase［J］.JBIC，2011，16（4）：589?597.

［10］NOTINGHER I.Raman Spectroscopy Cell?based Biosensors［J］.Sensors（Basel），2007，7（8）：1343?1358.

［11］KNEIPP J，KNEIPP H，WITTIG B，et al.Novel optical nano?sensors for probing and imaging live cells［J］.Nanomedicine，2010，6（2）：214?226.

［12］HODGESM D，KELLY J G，BENTLEY A J，et al.Combining immunolabel?ing and surface?enhanced Raman spectroscopy on cell membranes［J］.ACS Nano，2011，5（12）：9535?9541.

［13］王巍，潘志峰，唐偉躍，等.胃癌患者血紅蛋白的表面增強拉曼光譜分析［J］.光譜學與光譜分析，2015，35（12）：3402?3405.