EP4基因沉默對(duì)甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞生長(zhǎng)及遷移的影響

鐘榮譽(yù) 徐芬 艾鶴英 周丹莉 楊小穎 孫遼

1中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝病科（廣東珠海 519000）；2中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝病科，廣東省糖尿病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣州 510630）

甲狀腺癌是目前內(nèi)分泌系統(tǒng)最為常見(jiàn)的惡性腫瘤，流行病學(xué)調(diào)查顯示，近幾十年來(lái)其發(fā)病率逐步上升，已嚴(yán)重影響公眾健康［1］。而甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是其最主要病理類(lèi)型，約占79%～94%［2］。其中約5%～20%PTC患者經(jīng)過(guò)傳統(tǒng)的手術(shù)、I131、TSH抑制等治療后，仍發(fā)生局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，目前尚無(wú)有效的治療手段［3］。因此，通過(guò)尋找新的治療靶點(diǎn)，從而改善這部分患者預(yù)后顯得極為重要。

既往研究表明，前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）及其關(guān)鍵合成酶環(huán)氧合酶?2（cyclooxygenase?2，COX?2）在甲狀腺乳頭狀癌組織中表達(dá)升高且參與了其發(fā)生發(fā)展［4-5］。PGE2通過(guò)下游4種前列腺素E 受體（prostaglandin E receptor，EP）介導(dǎo)其作用，分別為EP1～4，其中前列腺素E受體4（prosta?glandin E receptor 4，EP4）與腫瘤關(guān)系密切，在多種腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［6］。同時(shí)我們前期研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺乳頭狀癌的腫瘤組織及細(xì)胞株中EP4表達(dá)明顯升高［4，7］，提示其可能在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)病中扮演著重要角色，但目前EP4與甲狀腺乳頭狀癌的關(guān)系尚不清楚。因此，本研究通過(guò)下調(diào)甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞中EP4的表達(dá)，研究其對(duì)K1細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移的影響，進(jìn)一步了解EP4在甲狀腺乳頭狀癌中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞株購(gòu)自European Collection of Authenticated Cell Cultures（ECACC）。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液、0.25%胰酶（GIBCO，美國(guó)）。陰性對(duì)照慢病毒及靶向沉默EP4慢病毒載體（上海吉?jiǎng)P基因有限公司），嘌呤霉素（Sigma?Aldrich，美國(guó)）。總RNA提取試劑TRIpure（Roche，瑞士），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA，日本），SYBR Green I Mas?ter試劑盒（Roche，瑞士），引物合成（Invitrogen，美國(guó)）?？偟鞍滋崛≡噭㏑IPA裂解液、EDTA、蛋白酶抑制劑（thermo，美國(guó)），BCA蛋白定量試劑盒（ther?mo，美國(guó)），EP4抗體（Cayman，美國(guó)），GAPDH抗體（Proteintech Group，美國(guó)）。CCK?8試劑盒（Dojindo，日本）。Annexin V?APC/PI凋亡試劑盒（Invitrogen，美國(guó)）。Transwell小室（Corning，美國(guó)）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)K1細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期進(jìn)行換液及傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 慢病毒載體轉(zhuǎn)染K1細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)分為3組，分別為空白對(duì)照組（black control group，未轉(zhuǎn)染慢病毒）、陰性對(duì)照組（negative control group，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照慢病毒）和EP4沉默組（EP4 knockdown group，轉(zhuǎn)染靶向沉默EP4慢病毒）。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，0.25%胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，以2.5×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板。鋪板過(guò)夜后，更換新鮮培養(yǎng)基，分別加入陰性對(duì)照病毒液、靶向沉默EP4病毒液進(jìn)行細(xì)胞感染。繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，更換為新鮮正常培養(yǎng)基。感染72 h后，加入含2 μg/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基進(jìn)行嘌呤霉素抗性篩選7 d。

1.4 QRT?PCR實(shí)驗(yàn)采用TRIpure試劑裂解細(xì)胞，分別提取3組K1細(xì)胞總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照qRT?PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)配制總體積為20 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性5 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)；95℃反應(yīng)5 s，65℃反應(yīng)1 min。β?actin上游引物：5′?ACAGAGCCTCGCCTTTGCCGAT?3′，下游引物：5′?CTTGCACATGCCGGAGCCGTT?3′；EP4 上游引物：5′?AATTCGTCCGCCTCCTTGAG?3′，下游引物：5′?CACCACCCCGAAGATGAACA?3′。β?actin作為內(nèi)參基因，以 2?ΔΔCT法計(jì)算 EP4 基因 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 Western blot實(shí)驗(yàn)使用RIPA裂解液分別提取3組細(xì)胞總蛋白，并用BCA法進(jìn)行蛋白定量，與5×上樣緩沖液混勻配平，煮沸變性后進(jìn)行SDS?PAGE電泳。然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h。TBS洗膜后，EP4（1∶200）、GAPDH（1∶1 000）一抗，4℃下孵育過(guò)夜。TBS洗膜后，加入IRDye 800紅外熒光二抗（1∶10 000），室溫孵育1 h，Odyssey掃描成像系統(tǒng)顯像。采用Im?age?Pro Plus軟件進(jìn)行圖像分析，GAPDH作為內(nèi)參蛋白進(jìn)行校正，以目的蛋白/內(nèi)參蛋白的灰度比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 CCK8實(shí)驗(yàn)將3組K1細(xì)胞消化稀釋至濃度為5×104/mL的單細(xì)胞懸液，按5×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板，同時(shí)設(shè)空白調(diào)零孔，每組設(shè)置5個(gè)平行復(fù)孔。分別在培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK?8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)其吸光度。

1.7 Annexin V?APC/PI凋亡實(shí)驗(yàn)使用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，每組分別收集5×105個(gè)細(xì)胞至流式管，200×g離心6 min，去除上清。分別用預(yù)冷1×PBS、1×Binding buffer各洗滌細(xì)胞1次。用100 μL 1×Binding buffer懸浮細(xì)胞后，加入5 μL AnnexinV?APC 溶液，室溫避光孵育 10 min。200×g離心6 min，去除上清。加入含5 μL PI溶液的1×Binding buffer 200 μL重懸細(xì)胞后，4℃避光進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.8 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)將3組細(xì)胞消化后，用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至5×105/mL單細(xì)胞懸液，取100 μL細(xì)胞懸液加入transwell小室上室，下室加入500 μL完全培養(yǎng)基。在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h后，取出上室，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次。4%多聚甲醛固定30 min后，用棉簽擦去上室未遷移的細(xì)胞。0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗滌3次，顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野細(xì)胞并拍照計(jì)數(shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 13.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，Graphpad Prism 6.0作圖，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建EP4基因沉默的K1細(xì)胞株QRT?PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了靶向沉默EP4慢病毒后，與陰性對(duì)照組比較，K1細(xì)胞EP4 mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.01），而空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖1。同時(shí)，Western blot結(jié)果顯示，EP4沉默組EP4蛋白表達(dá)明顯少于陰性對(duì)照組（P＜0.05），且兩對(duì)照組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖2。上述結(jié)果表明EP4基因沉默K1細(xì)胞株構(gòu)建成功。

2.2 CCK8法檢測(cè)K1細(xì)胞生長(zhǎng)情況成功構(gòu)建EP4敲減的K1細(xì)胞株后，采用CCK8法分別于24、48、72 h檢測(cè)其細(xì)胞生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示，EP4沉默組K1細(xì)胞的生長(zhǎng)較陰性對(duì)照組受到明顯抑制（P＜0.01），而空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖3。

圖1 各組K1細(xì)胞EP4 mRNA表達(dá)水平Fig.1 Expression of EP4 mRNA in each group of K1 cells

圖2 各組K1細(xì)胞EP4蛋白表達(dá)水平Fig.2 Expression of EP4 protein in each group of K1 cells

圖3 EP4 shRNA對(duì)K1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of EP4 shRNA on the growth of K1 cells

2.3 Annexin V?APC/PI法檢測(cè)K1細(xì)胞凋亡率采用AnnexinV?APC/PI雙染細(xì)胞后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)3組細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，EP4沉默組較陰性對(duì)照組其細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.01），空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

2.4 Transwell法檢測(cè)K1細(xì)胞遷移能力慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，transwell結(jié)果顯示，EP4沉默組K1細(xì)胞遷移能力較陰性對(duì)照組顯著降低（P＜0.01），而空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖5。

圖4 EP4 shRNA對(duì)K1細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effect of EP4 shRNA on the apoptosis of K1 cells

3 討論

前列腺素E2屬于花生四烯酸的衍生物，參與了肝癌［8］等多種腫瘤增殖、遷移、侵襲過(guò)程。已有研究表明，在甲狀腺乳頭狀癌中PGE2及其關(guān)鍵合成酶COX?2呈高表達(dá)［4］。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò) COX?2抑制劑阻滯PGE2合成可以顯著抑制TPC?1細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲［5，9］。上述研究提示，PGE2在甲狀腺乳頭狀癌的生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。COX?2是催化花生四烯酸合成PGE2的關(guān)鍵限速酶，正常生理狀態(tài)下在大多數(shù)組織中表達(dá)很少，而在炎癥、腫瘤等病理過(guò)程中表達(dá)顯著增強(qiáng)［7，10-11］。多項(xiàng)臨床研究已發(fā)現(xiàn)抑制 COX?2 活性具有預(yù)防結(jié)直腸腫瘤的作用，但會(huì)增加消化道及心血管不良事件的風(fēng)險(xiǎn)，因此限制了其臨床應(yīng)用，而其下游EP受體成為新的研究方向［12-14］。

圖5 EP4 shRNA對(duì)K1細(xì)胞遷移的影響（×200）Fig.5 Effect of EP4 shRNA on the migration of K1 cells（× 200）

EP4是PGE2下游受體的一種亞型，屬于跨膜G蛋白偶聯(lián)受體，在體內(nèi)廣泛分布，參與了機(jī)體腫瘤形成、心肌肥大、血管舒張與重構(gòu)、骨重構(gòu)、胃腸道穩(wěn)態(tài)、炎癥及腎和女性生殖系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)等過(guò)程［6］。多項(xiàng)研究已證實(shí)EP4在結(jié)直腸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程起著重要作用［15-16］。同時(shí)我們前期研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁正常甲狀腺及良性結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織相比，甲狀腺乳頭狀癌腫瘤組織中EP4表達(dá)顯著升高［4］，這提示其可能參與了甲狀腺乳頭狀癌發(fā)病過(guò)程，但EP4表達(dá)水平與PTC的關(guān)系尚未闡明。

由于EP4對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)具有重要作用，EP4可通過(guò)磷酸化激活下游Akt等蛋白，從而影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)［17］。而EP4對(duì)K1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響尚未清楚。因此，本研究通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建了EP4沉默甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞株，以探討EP4對(duì)K1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。結(jié)果顯示，通過(guò)慢病毒載體下調(diào)EP4蛋白表達(dá)后K1細(xì)胞生長(zhǎng)受到顯著抑制。在PARIDA等［18］研究中發(fā)現(xiàn)GW627368X可選擇性阻滯EP4進(jìn)而抑制宮頸癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)凋亡。同時(shí)在HANN等［19］研究中表明姜黃素可抑制頭頸部多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，其通過(guò)下調(diào)EP4表達(dá)而發(fā)揮其抗腫瘤作用，這些研究均表明EP4在抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中具有重要作用，與本研究結(jié)論一致。此外，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示EP4也參與了K1細(xì)胞凋亡過(guò)程，EP4蛋白表達(dá)下調(diào)后K1細(xì)胞凋亡顯著增加，這進(jìn)一步證實(shí)了EP4基因沉默具有抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。細(xì)胞遷移是腫瘤進(jìn)展轉(zhuǎn)移一個(gè)重要生物學(xué)過(guò)程，在ZHANG等［20］研究中發(fā)現(xiàn)EP4參與了腎癌細(xì)胞的遷移過(guò)程，敲減EP4可以抑制其腫瘤細(xì)胞遷移，延緩其進(jìn)展。而甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞的遷移是否受到EP4調(diào)控尚不清楚，因此本研究進(jìn)一步探討其對(duì)K1細(xì)胞遷移的影響。研究結(jié)果表明下調(diào)EP4表達(dá)可以明顯抑制甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞遷移。上述結(jié)果提示EP4可能在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)病中起著重要作用。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了EP4基因沉默甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞株，并發(fā)現(xiàn)下調(diào)EP4基因表達(dá)能夠抑制甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞生長(zhǎng)及誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡，并明顯降低其細(xì)胞遷移能力。這提示靶向抑制EP4可能是治療人甲狀腺乳頭狀癌一種新的方法。EP4可通過(guò)多條信號(hào)通路發(fā)揮其作用，但EP4對(duì)K1細(xì)胞生長(zhǎng)及遷移影響的機(jī)制目前尚不清楚，為此我們下一步將對(duì)其進(jìn)行具體的機(jī)制探討。同時(shí)由于體外培養(yǎng)無(wú)法完全模擬體內(nèi)環(huán)境，因此我們后續(xù)將進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入研究。

［1］CHEN W，ZHENG R，BAADE P D，et al.Cancer statistics in China，2015［J］.CA Cancer J Clin，2016，66（2）：115?132.

［2］楊雷，王寧.甲狀腺癌流行病學(xué)研究進(jìn)展［J］.中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2014，48（8）：744?748.

［3］KIM W B.A closer look at papillary thyroid carcinoma［J］.En?docrinol Metab（Seoul），2015，30（1）：1?6.

［4］SUN L，WEI X，LIU X，et al.Expression of prostaglandin E2 and EP receptors in human papillary thyroid carcinoma［J］.Tu?mour Biol，2016，37（4）：4689?4697.

［5］SCARPINO S，DURANTI E，STOPPACCIARO A，et al.COX?2 is induced by HGF stimulation in Met?positive thyroid papil?lary carcinoma cells and is involved in tumour invasiveness［J］.J Pathol，2009，218（4）：487?494.

［6］YOKOYAMA U，IWATSUBO K，UMEMURA M，et al.The prostanoid EP4 receptor and its signaling pathway［J］.Pharma?col Rev，2013，65（3）：1010?1052.

［7］周丹莉，艾鶴英，徐芬，等.EP4對(duì)人甲狀腺乳頭狀癌TPC?1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響［J］.中山大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)科學(xué)版），2016，37（3）：396?401.

［8］MA J，CHEN M，XIA S K，et al.Prostaglandin E2 promotes liver cancer cell growth by the upregulation of FUSE?binding protein 1 expression［J］.Int J Oncol，2013，42（3）：1093?1104.

［9］KAJITA S，RUEBEL K H，CASEY M B，et al.Role of COX?2，thromboxane A2 synthase，and prostaglandin I2 synthase in papillary thyroid carcinoma growth［J］.Mod Pathol，2005，18（2）：221?227.

［10］STACK E，DUBOIS R N.Regulation of cyclo?oxygenase?2［J］.Best Pract Res Clin Gastroenterol，2001，15（5）：787?800.

［11］周菲菲，黃榮，蔣軍，等.直腸癌環(huán)氧化酶?2的表達(dá)預(yù)測(cè)新輔助放療敏感性的臨床價(jià)值［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2017，33（8）：1290?1293.

［12］HUANG W K，CHIOU M J，YU K H，et al.The association between low?dose aspirin use and the incidence of colorectal cancer：a nationwide cohort study［J］.Aliment Pharmacol Ther，2013，38（4）：432?439.

［13］B?CK M，YIN L，INGELSSON E.Cyclooxygenase?2 inhibitors and cardiovascular risk in a nation?wide cohort study after the withdrawal of rofecoxib［J］.Eur Heart J，2012，33（15）：1928?1933.

［14］COXIB AND TRADITIONAL NSAID TRIALISTS'（CNT）COL?LABORATION，BHALA N，EMBERSON J，et al.Vascular and upper gastrointestinal effects of non?steroidal anti?inflamma?tory drugs：meta?analyses of individual participant data from randomised trials［J］.Lancet，2013，382（9894）：769?779.

［15］WANG D，F(xiàn)U L，SUN H，et al.Prostaglandin E2 promotes colorectal cancer stem cell expansion and metastasis in mice［J］.Gastroenterology，2015，149（7）：1884?1895.

［16］HIKEN J F，MCDONALD J I，DECKER K F，et al.Epigene?tic activation of the prostaglandin receptor EP4 promotes resis?tance to endocrine therapy for breast cancer［J］.Oncogene，2017，36（16）：2319?2327.

［17］PARIDA S，PAREKH A，DEY G，et al.Molecular inhibition of prostaglandin E2 with GW627368X：Therapeutic potential and preclinical safety assessment in mouse sarcoma model［J］.Cancer Biol Ther，2015，16（6）：922?932.

［18］PARIDA S，PAL I，PAREKH A，et al.GW627368X inhibits proliferation and induces apoptosis in cervical cancer by inter?fering with EP4/EGFR interactive signaling［J］.Cell Death Dis，2016，7：e2154.

［19］HANN S S，CHEN J，WANG Z，et al.Targeting EP4 by cur?cumin through cross talks of AMP?dependent kinase alpha and p38 mitogen?activated protein kinase signaling：the role of PGC?1α and Sp1［J］.Cell Signal，2013，25（12）：2566?2574.

［20］ZHANG Y，THAYELE PURAYIL H，BLACK J B，et al.Pros?taglandin E2 receptor 4 mediates renal cell carcinoma intravasa?tion and metastasis［J］.Cancer Lett，2017，391：50?58.