大鼠肝臟細(xì)胞BRL-3A放射性損傷中沒食子鞣質(zhì)的保護(hù)作用實驗研究

孫巖娜， 李 莉， 艾斯克爾·吐拉洪， 肖 蕾， 伊利亞爾·努如拉， 張月芬， 包永星， 張 侖， 張 華

(新疆醫(yī)科大學(xué)1第一附屬醫(yī)院腫瘤中心二科， 烏魯木齊 830054; 2附屬腫瘤醫(yī)院放射科， 烏魯木齊 830011)

肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種惡性腫瘤，其致死病因及發(fā)病率在全世界范疇內(nèi)分別高居第三及第六位[1]。近年來基于精準(zhǔn)放療技術(shù)的迅猛發(fā)展，放射治療技術(shù)成為一種有效無創(chuàng)傷治療癌癥的手段，但射線易導(dǎo)致放射性肝損傷(radiation induced liver damage，RILD)，可嚴(yán)重制約放射治療[2]，具有高度致死性，就目前為止行之有效的藥物治療方案尚未發(fā)現(xiàn)。沒食子(Turkish galls, MSZ)是沒食子蜂(Cunips gallae-tinctoriae Oliv )的幼蟲，均歸屬于沒食子蜂科昆蟲。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤和抗輻射作用[3-4]，但對于放射性肝臟損傷的防治作用尚不明確，本研究通過體外培養(yǎng)大鼠肝臟細(xì)胞系BRL-3A，通過射線照射后利用不同濃度的沒食子提取物進(jìn)行干預(yù)，目的在于闡述沒食子鞣質(zhì)和它的有效提取物對放射性肝細(xì)胞的保護(hù)作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1主要材料和試劑BRL-3A品系大鼠肝細(xì)胞系(武漢普諾生命科技有限公司)；胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(GIBCO公司)；MTT試劑、DMSO(Sigma公司)；Trizol RNA試劑(北京樂博生物公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR Master Mix(Roch公司)；RIPA試劑(索萊寶生物)；Caspase-3，Caspase-9單抗和兔抗鼠二抗(Cell Signaling公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)將凍存管中BRL-3A細(xì)胞置于37℃溫水中迅速融化后置入離心機以1 000 rp轉(zhuǎn)速離300 s，丟棄上清液。取含10%胎牛血清的DMED培養(yǎng)液，將離心產(chǎn)物入其中，攪拌混勻。將細(xì)胞接種于50 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置入37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。根據(jù)實驗設(shè)計，分為空白對照組、0 Gy假照射組、10 Gy照射組、10 Gy照射+MSZ組、MSZ組，每組6重復(fù)，其中MSZ濃度配置為0.1、0.3、0.5、1.0 mg/mL)。

1.3X射線參數(shù)設(shè)置使用6 MV X線照射，計量率為400 cGy/min，波源距100 cm，將1.0 cm的等效膜鋪于培養(yǎng)皿，進(jìn)而保證劑量相同，吸收劑量設(shè)置為10 Gy。

1.4制備沒食子和有效提取物藥液基于超聲波甲醇技術(shù)。稱取適量沒食子藥材粉碎，沒食子粉末(過孔徑250 μm篩)，50 g經(jīng)70%甲醇超聲處理1 h，室溫避光浸泡24 h，提取3次。減壓濃縮濾液，真空抽吸并烘干得到浸膏。加入適量的水使其懸浮狀態(tài)，然后用乙醚萃取，再用乙酸乙酯回收。先用蒸餾水將藥物配成50 mg/mL的母液擱置冰箱(4℃)備用。

1.5檢測各組細(xì)胞活力采用MTT的方法，可于96孔板上按照2×103個細(xì)胞/孔接種對數(shù)期細(xì)胞，以100 μL/孔體積為標(biāo)準(zhǔn)，后放于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，參數(shù)定為飽和濕度37℃及5%CO2，設(shè)6個平行孔/組。將配成的5 mg/mL MTT溶液根據(jù)所需的量按10 μL/100 μL的比例與無血清DMEM混勻，分別于照射后24、48、72 h取離培養(yǎng)板，將孔內(nèi)培養(yǎng)液丟棄掉，含MTT的培養(yǎng)液100 μL加入每孔中，37℃避光孵育4 h后丟棄，每孔加150 μL DMSO，震蕩10 min后，可充分溶解藍(lán)紫色結(jié)晶。于酶標(biāo)儀上雙波長490 nm和570 nm處分別測定每孔的吸光度(OD)值數(shù)。

1.6RT-PCR檢測Caspase-3和Caspase-9的mRNA水平采用Trizol法，根據(jù)說明書提取各組細(xì)胞總RNA。RNA質(zhì)檢合格后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)說明書在25 μL EP管中按如下20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，引物配置見表1(引物序列由上海生工合成，以ACTB為內(nèi)參)。按引物說明書，加合適的ddH2O稀釋引物配成母液(100 μmol)，取10 μmol母液稀釋10倍配成工作液。據(jù)RT-PCR反應(yīng)試劑盒，在25 μL EP管中按如下20 μL 體系行Real-TimePCR反應(yīng)。利用相對定量2-△△Ct法評估各組目的基因mRNA的表達(dá)水平，實驗反復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，兩獨立樣本采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析。非正態(tài)性數(shù)據(jù)選用非參數(shù)檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 引物配置

2 結(jié)果

2.1沒食子鞣質(zhì)和有效提取物在大鼠肝臟BRL-3A細(xì)胞增殖過程中的作用依據(jù)預(yù)實驗的結(jié)果，將MSZ的濃度梯度限度分別設(shè)定為：0.1、0.3、0.5、1.0 mg/mL，以倒置顯微鏡10倍值數(shù)前提下，0 Gy假照射組細(xì)胞分裂較快，呈團分布，10 Gy射線照射后明顯抑制BRL-3A的生長，細(xì)胞增殖速度減慢，邊緣不清晰，核增大。10 Gy照射+MSZ組和10 Gy照射組比較，10 Gy照射+MSZ組各濃度下細(xì)胞數(shù)目均較10 Gy照射組增多，在0.5 mg/mL濃度下48 h最為明顯，提示MSZ可能對細(xì)胞具有保護(hù)作用(圖1-3)。

2.2MTT法檢測MSZ對細(xì)胞的保護(hù)作用MTT結(jié)果顯示，X射線照射48 h后抑制作用最大，72 h后差異逐漸減小；與此同時，MSZ的保護(hù)作用也在48 h最為明顯，10 Gy照射+MSZ組各濃度與10 Gy照射組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

2.3RT-PCR檢測Caspase-3及Caspase-9mRNA的表達(dá)在48個小時以后RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)MSZ組各濃度下的Caspase-3以及Caspase-9的mRNA表達(dá)水平與空白對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；10 Gy照射+MSZ組各濃度下的Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)水平與10 Gy照射組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

a: MSZ 0.1 mg/mL

b: MSZ 0.3 mg/mL

c: MSZ 0.5 mg/mL

d: MSZ 1.0 mg/mL

圖10Gy照射組

a: MSZ 0.1 mg/mL

b: MSZ 0.3 mg/mL

c: MSZ 0.5 mg/mL

d: MSZ 1.0 mg/mL

圖210Gy照射組

a: MSZ 0.1 mg/mL

b: MSZ 0.3 mg/mL

c: MSZ 0.5 mg/mL

d: MSZ 1.0 mg/mL

圖3 10 Gy照射+MSZ組

注： 與10 Gy照射組比較，*P<0.05。

表3 Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)水平對比

注： 與10 Gy照射組比較，*P<0.05。

3 討論

肝細(xì)胞受到射線照射易產(chǎn)生RILD，該病臨床表現(xiàn)起病隱匿，如若發(fā)生就會呈進(jìn)行性演進(jìn)，再而導(dǎo)致肝纖維化和功能衰竭。典型RILD發(fā)生于放療后的4～8周，而部分報道闡明RILD最早可發(fā)生在放療完成后的2周，最遲發(fā)生在放射結(jié)束后7月左右，以乏力、腹水、肝臟腫大、堿性磷酸酶和(或)轉(zhuǎn)氨酶的明顯升高為特點[5-8]。病理學(xué)變化以中央小靜脈閉塞性改變?yōu)橹饕攸c，示進(jìn)行性肝纖維化過程[9]。

中醫(yī)藥在RILD治療方面研究越來越多，大量文獻(xiàn)表明，丹參素、番茄紅素、表兒茶酸、人參提取物、積雪草苷等中草藥成分能夠通過消除氧自由基、抗氧化、保護(hù)射線導(dǎo)致的DNA損傷等途徑減輕放射性損傷[10-13]。蜂膠是一種帶有芬芳味道的膠狀固體物質(zhì)，因其清除氧自由基的功效被用來防治氧化損傷[14-15]。最近的研究表明，蜂膠中含有的一種叫咖啡酸苯乙酯的生物學(xué)活性成分，可保護(hù)對四氯化碳引起的小鼠的肝臟損傷[16]，同時部分文獻(xiàn)表明，咖啡酸苯乙酯能夠通過抑制肝細(xì)胞凋亡、阻斷炎癥途徑降低腫瘤壞死因子α的水平防治放射性肝臟損傷[17]。Song等[18]人發(fā)現(xiàn)低濃度的染料木黃酮能夠減少射線導(dǎo)致的肝臟實質(zhì)細(xì)胞的凋亡、基因的變異和染色體的損傷，促進(jìn)DNA的修復(fù)。如上所述，中草藥成分在RILD治療方面的研究逐漸顯現(xiàn)出較好的發(fā)展趨勢，但仍需動物或臨床實驗進(jìn)一步明確。

在早期，我們的研究人員對沒食子鞣質(zhì)及活性進(jìn)行了研究，已發(fā)現(xiàn)其對于齲病的防治具有良好的效果，具有一定的抗腫瘤作用和抗輻射作用[3-5]。

在本研究中，我們采用體外培養(yǎng)的大鼠正常肝臟細(xì)胞系BRL-3A，給予單次10 Gy的照射，通過顯微鏡下觀察細(xì)胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)X射線對細(xì)胞的抑制作用在48 h最為明顯，72 h后差異逐漸減?。慌c此同時，MSZ的保護(hù)作用也在48 h最為明顯，與10 Gy照射組比較，10 Gy照射+MSZ組差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。在48個小時以后發(fā)現(xiàn)MSZ細(xì)胞的Caspase-3以及Caspase-9的mRNA表達(dá)水平與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；10 Gy照射+MSZ組的Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)水平與10 Gy照射組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示MSZ提取物能夠有效減少射線對細(xì)胞造成的損傷，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，同時也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡的指標(biāo)中Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)量變化,初步說明MSZ促進(jìn)細(xì)胞增殖可能和減少細(xì)胞凋亡相關(guān),但仍需要深入研究進(jìn)行后續(xù)驗證。

綜上所述,雖然目前尚未發(fā)現(xiàn)具有肯定作用的RILD的防護(hù)藥物，但是經(jīng)過不斷尋找和探索，MSZ可能成為具有潛在輻射防護(hù)作用的藥物。

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