駱駝刺單體化合物的制備及其抗人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖活性的研究

馬曉玲， 劉雪松， 魏鴻雁， 韓莉莉

(1新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，烏魯木齊 830002; 2新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046; 3新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院婦科，烏魯木齊 830002)

駱駝刺(AlhagisparsifoliaShap)是新疆干旱沙漠地區(qū)特有的一種落葉灌木，它也是沙漠戈壁“三寶”之一，具有開通阻滯、止咳祛痰、消除異常黏液質(zhì)等功效，是用于腹痛腹脹、痢疾腹瀉、風(fēng)濕病、滋補(bǔ)強(qiáng)壯、平衡體液和異常膽液質(zhì)的常見藥方[1]。刺糖是駱駝刺在高溫干旱環(huán)境中由于抗逆性而分泌的糖粒。課題組對(duì)烏魯木齊市郊和烏魯木齊以北地區(qū)的駱駝刺與吐魯番托克遜縣駱駝刺進(jìn)行了比較，然而近年來由于烏魯木齊周邊等地氣候較溫和，其駱駝刺已不產(chǎn)生刺糖[2]。因此，本研究采用吐魯番地區(qū)含刺糖駱駝刺作為研究對(duì)象。本研究借鑒本課題組前期發(fā)現(xiàn)的駱駝刺提取物抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)的研究基礎(chǔ)[3-6]，為了深入探討駱駝刺提取物對(duì)宮頸癌細(xì)胞的影響，通過體外培養(yǎng)人宮頸癌Hela細(xì)胞，觀察駱駝刺提取物和從中分離得到的化合物對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖(G2期)的影響，明確駱駝刺中具有抗腫瘤活性的成分，為利用駱駝刺活性成分治療宮頸癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1試劑與儀器

1.1.1 試劑與藥材 DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone 公司)， 胎牛血清(Gibco 公司，F(xiàn)BS)，0.25%胰酶(Hyclone公司)，PBS 緩沖溶液(Thermo公司， 雙抗(青霉素-鏈霉素 PS)，四甲基偶氮鹽(Sigma公司，MTT)，5-氟尿嘧啶(上海旭東海普藥業(yè)有限公司，5-Fu)，硅膠 G 薄層板，硅膠 GF254 薄層板(青島海洋化工有限公司)，C18柱色譜(大連江申分離科學(xué)技術(shù)公司)，ODS 制備型色譜柱(YMC公司)，葡聚糖凝膠色譜柱 (sephadex LH- 20，GE Healthcare Bio-Science AB 公司)，色譜甲醇(美國 fisher scientific，色譜純)，石油醚，甲醇，乙醇，乙酸乙酯，正丁醇，濃硫酸，二甲基亞砜(DMSO)等試劑均為分析純(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)。駱駝刺采自新疆吐魯番地區(qū)，經(jīng)新疆中藥民族藥研究所王果平副研究員鑒定其為豆科駱駝刺屬植物駱駝刺(AlhagisparsifoliaShap.)。

1.1.2 細(xì)胞株 人宮頸癌Hela細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)。

1.1.3 儀器 電熱真空干燥箱 DZF-2B (北京永光明醫(yī)療儀器廠)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 V-100 (上海愛朗儀器有限公司)，冷卻水循環(huán)裝置 CCA-1111 (上海愛朗儀器有限公司)，循環(huán)水式多用真空泵 SHB-III (鄭州長城科工貿(mào)有限公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱 BC-J80S (上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，潔凈工作臺(tái) SW-CJ-2F(蘇州尚田潔凈技術(shù)有限公司)，冷凍離心機(jī) MIKRO 220R (德國Hettich)，酶標(biāo)儀 BioTeK(上海佛秋樂貿(mào)易有限公司)，優(yōu)普超純水機(jī) UPT-I-5T/L (成都超純科技有限公司)，Bruker ARX-300和AV-600型核磁共振儀(德國Bruker Internation AG),高效液相色譜儀(島津SPD-20A),循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司SHZ-Ⅲ),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠RE-5210A)。

1.2方法

1.2.1 提取分離 干燥的吐魯番駱駝刺地上部分(9 kg)，浸泡0.5 h，用70%乙醇回流提取3次(2、1.5、1.5 h)，濃縮得到乙醇提取物(呈浸膏狀)1 550 g，乙醇提取物經(jīng)水分散后(9 L)，分別用等體積石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，得石油醚萃取物(22.4 g)，乙酸乙酯萃取物(93.0 g)，正丁醇萃取物(260.0 g)和水相萃取物(346.8 g)。

1.2.2 不同極性萃取物抗Hela細(xì)胞增殖活性的篩選[7-8]將細(xì)胞從液氮中取出，迅速置于37 ℃水浴鍋中解凍，然后吸入離心管，加入3 mL細(xì)胞培養(yǎng)液(10%胎牛血清 DMEM 培養(yǎng)液)，1 000 r/min離心 5 min，棄去上清液，將細(xì)胞重懸于1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，并轉(zhuǎn)移至 10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，混勻后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)(37℃、5% CO2)。每2天更換1次培養(yǎng)液，觀察細(xì)胞形態(tài)，維持細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期備用。

取對(duì)數(shù)生長期的 Hela細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液后細(xì)胞計(jì)數(shù), 將細(xì)胞密度調(diào)整為6×104個(gè)/mL，鋪板，培養(yǎng)24 h后給藥?？瞻讓?duì)照組給予等體積的 PBS；給藥組分別加入培養(yǎng)基配置的不同濃度的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取粗提物，其濃度依次為32、16、8、4、2、1 mg/mL，陽性對(duì)照組加入不同濃度的5-FU，每個(gè)濃度設(shè) 3個(gè)復(fù)孔，再培養(yǎng)48 h后，加入5 mg/mL的MTT液 (10 μL/孔)4 h后，棄去上清加入DMSO 100 μL/孔。于搖床上震蕩5～10 min , 使完全混勻溶解結(jié)晶，在酶標(biāo)儀上于570 nm處測(cè)吸光度，每個(gè)劑量設(shè)平行重復(fù)3孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按以下公式計(jì)算抑制率，擬合后求半抑制濃度(IC50)值。抑制率 =(1-A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組)×100%。

1.2.3 吐魯番駱駝刺乙酸乙酯萃取物的純化 取80 g乙酸乙酯萃取物，采用硅膠吸附柱色譜依次用石油醚-乙酸乙酯(100∶0～ 0∶100)進(jìn)行梯度洗脫，洗脫液經(jīng)硅膠薄層鑒別后，合并組成相似的餾分，對(duì)Fr. 1進(jìn)行硅膠吸附柱色譜，用石油醚:甲醇做洗脫劑，得到化合物17(5.5 mg)和18(7.8 mg)。對(duì)Fr. 2進(jìn)行硅膠吸附柱色譜，用石油醚：乙酸乙酯(100∶15)作洗脫劑，得到化合物1(400.6 mg)。對(duì)Fr. 3進(jìn)行硅膠吸附柱色譜，用二氯甲烷：甲醇(42∶56)作洗脫劑，得到Fr. 3-1，再對(duì)其進(jìn)行Sephadex LH-20凝膠柱色譜，用二氯甲烷：甲醇洗脫，即得化合物23(13.7 mg)。對(duì)Fr. 4進(jìn)行開放ODS柱色譜，用甲醇：水洗脫，得到Fr. 4-1、Fr. 4-2和Fr. 4-3，再對(duì)其采用制備型高效液相色譜進(jìn)行分離，分別得到化合物10(21.3 mg)，13(5.6 mg)，2(12.3 mg)。對(duì)Fr. 5用甲醇洗脫并重結(jié)晶得到化合物12(70.5 mg)。對(duì)Fr. 6進(jìn)行開放ODS柱色譜，用甲醇：水洗脫，得到Fr. 6-1，采用制備型高效液相色譜對(duì)Fr. 6-1進(jìn)行分離，得到化合物3(5.6 mg)和4(7.8 mg)。對(duì)Fr. 7進(jìn)行硅膠吸附柱色譜，用二氯甲烷：甲醇作洗脫劑，得到化合物11(500.3 mg)。對(duì)Fr. 8進(jìn)行開放ODS柱色譜，用甲醇：水洗脫，得到Fr. 8-1、Fr. 8-2和Fr. 8-3，在對(duì)其采用制備型高效液相色譜進(jìn)行分離，分別得到化合物16(10.4 mg)，21(13.3 mg)，22(19.4 mg)。

1.2.4 吐魯番駱駝刺正丁醇萃取物的純化 取250 g正丁醇萃取物，利用HPD100大孔吸附樹脂進(jìn)行粗分，以不同濃度乙醇-水梯度洗脫，得到30%乙醇-水洗脫物120.0 g，90%乙醇-水洗脫物75.0 g。取90%乙醇-水洗脫物70.0 g，采用硅膠吸附柱色譜，依次用二氯甲烷：甲醇(100:0～0:100)進(jìn)行洗脫，洗脫液經(jīng)硅膠薄層鑒別后合并組成相似的流分，對(duì)Fr. 1進(jìn)行開放ODS柱色譜，用甲醇：水洗脫，得到Fr. 1-1和Fr. 1-2，采用制備型高效液相色譜對(duì)Fr. 1-1進(jìn)行分離，得到化合物8(13.4 mg)，9(20.3 mg)，對(duì)Fr. 1-2采用制備型高效液相色譜進(jìn)行分離得到化合物7(5.6 mg)。對(duì)Fr. 2用甲醇洗脫并重結(jié)晶得到化合物14(600.3 mg)。對(duì)Fr. 3進(jìn)行開放ODS柱色譜用甲醇：水洗脫，得到Fr. 3-1和Fr. 3-2，再對(duì)其都采用制備型高效液相色譜進(jìn)行分離，分別得到化合物5(13.2 mg)和6(12.3 mg)。對(duì)Fr. 4進(jìn)行開放ODS柱色譜用甲醇：水洗脫，得到Fr. 4-1、Fr. 4-2和Fr. 4-3，再對(duì)其采用制備型高效液相色譜進(jìn)行分離，分別得到化合物15(13.4 mg)，19(13.2 mg)和20(13.4 mg)。對(duì)Fr. 5進(jìn)行開放ODS柱色譜用甲醇：水洗脫，得到化合物24(3.0 mg)。

1.2.5 駱駝刺中各單體化合物對(duì)Hela細(xì)胞的活性篩選 取對(duì)數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液后細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞密度調(diào)整為6×104個(gè)/mL，鋪板，培養(yǎng)24 h后給藥?？瞻讓?duì)照組給予等體積的 PBS；給藥組分別加入不同濃度的化合物，其濃度依次為200、100、50、25、12.5、6.25 μg/mL。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差(one way ANOVE)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1活性篩選

2.1.1 不同極性的駱駝刺提取物 乙酸乙酯部位和正丁醇部位對(duì)Hela細(xì)胞有明顯的抑制作用，其IC50值分別為20.0和16.9 mg/mL，見表1。后續(xù)本研究對(duì)乙酸乙酯部位和正丁醇部位進(jìn)行了化合物的分離和活性篩選。

2.1.2 駱駝刺中各單體化合物對(duì)Hela細(xì)胞的活性篩選 化合物8、15、21、23對(duì)Hela細(xì)胞增殖有較強(qiáng)的抑制作用，其IC50值分別為44.7、23.1、91.2、41.2 μg/mL，見表2。

表1 不同極性駱駝刺提取物對(duì)Hela細(xì)胞的抑制率和IC50值

表2 單體化合物的活性篩選

2.2結(jié)構(gòu)鑒定

2.2.1 化合物8 淡黃色針晶 (甲醇) ，1H-NMR(600 Hz，CD3 OD): 7.65(1H，d，J=8.4 Hz，H-5)，6.98(1H，d，J=1.8 Hz，H-2′)，6.82(1H，dd，J1=1.8 Hz， J2=7.8 Hz，H-6′), 6.80 (1H，d，J=7.8 Hz，H-5′)， 6.51 (1H，dd，J1=2.4 Hz，J2=8.4 Hz，H-6)，6.36(1H，d，J=2.4 Hz，H-8)，5.35(1H，dd，J1=3.0 Hz，J2=12.6 Hz，H-2)，2.98(1H，dd，J1=12.6 Hz，J2=16. 2 Hz，H-3b)，2.65(1H，dd，J1=2.4 Hz，J2=16. 2 Hz，H-3a);13C-NMR(CD3OD): 190.5 (C=O)，165.2(C-7)，164.4 (C-9)，146.2(C-4′)，145.9(C-3′)，132.0(C-5)， 129.4(C-1′)，119.2(C-6′)，116.0(C-2′)，115.2(C-5′)，114.7(C-6)，111.1(C-8)，103.6(C-10)，80.5(C-2)，44. 7(C-3)。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物8為紫鉚素。其結(jié)構(gòu)圖見圖1。

2.2.2 化合物15 無色針狀結(jié)晶(甲醇)；三氯化鐵 -鐵氰化鉀反應(yīng)陽性, 提示結(jié)構(gòu)中存在酚羥基。1H-NMR(300 MHz, CD3 OD):9.68(1H, s, 7-CHO)、7.30 (1H, m, H-6)、7.28(1H, brs, H-2)、6.90 (1H, d, J=8.4 Hz, H-5)。13C-NMR(75 MHz, CD3 OD):193.1(C-7)、 153.7(C-4)、147.2(C-3)、130.8(C-1)、126.4(C-6)、116.2(C-5)、115.3(C-2)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]對(duì)照基本一致，故鑒定化合物15為原兒茶醛,其結(jié)構(gòu)圖見圖2。

圖1紫鉚素結(jié)構(gòu)圖

圖2原兒茶醛結(jié)構(gòu)圖

2.2.3 化合物21 白色無定形粉末；Molish反應(yīng)陽性；TLC FeCl3顯紅色。ESI-MS m/z 579[M-H]，417[M-H-162]；1H-NMR(500MHZ，CD3OD)δ:6.74(2H，s，2′6′-H)，6.68(2H，s，2″，6″-H)，4.88(1H，m，glc-1-H)，4.79(1H，d，2-H)，4.74(1H，d，6-H)，4.31(1H，dd，4-Ha)，4.30(1H，dd，Hb)，3.93(2H，m，4-Hb，8-Ha)，3.88(6H，s，3″，5″-OMe)，3.86(6H，s，3′，5′-OMe)，3.69(1H，dd，glc-6-Hb)，3.49(1H，dd，glc-6-Ha)，3.15(2H，m，1,5-H)；13C-NMR(500MHz，CD3OD)δ：153.0(C-3′，5′)，148.0(C-3″，5″)，138.2(C-1′)，131.7(C-1″)，104.0(C-2′，6′)，103.5(C-2″，6″)，103.2(C-glc-1),86.2(C-6)，85.8(C-2)，76.9(C-glc-5),76.4(C-glc-,3)，74.(C-glc-2)，71.5(C-4)，71.5(C-8)，70.0(C-glc-4),61.2(C-glc-6),55.7(OMe-3′,5′)，55.5(OMe-3″，5″)，54.3(C-1)，54.1(C-5)。該化合物的波譜數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[11]中報(bào)道的tortoside A一致，因此鑒定化合物21為tortoside A,其結(jié)構(gòu)圖見圖3。

圖3 tortoside A結(jié)構(gòu)圖

2.2.4 化合物23 無色油狀物，具有芳香氣味；EI-MSm/z 150(M+)；1H-NMR(CDCl3，300 MHz) δ: 6. 72(1H，d，J=1. 5 Hz，H-2)，6.89(1H，dd，J=7.0，1.5Hz，H-6)，6.70(1H， d， J=7.0 Hz， H-5)，4.60(1H，d，J=17.7Hz，H-8a)，4.13 (1H，d，J =10.8 Hz，H-8b) ，3.72(3H，s，3-OMe)，3.69(1H，dd，J=10.8，17.7 Hz，H-7);13C-NMR(CDCl3，75 MHz) δ: 146.6(C-3)，145.6 (C-4)，136.6(C-7)，130.3 (C-1)，120.1(C-6)，114.4(C-8)，111.5 (C-5)， 108.0 (C-2)，55.9(3-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道3-甲氧基-4-乙烯基苯酚(3-methoxy-4-vinylphenol) 的數(shù)據(jù)一致，因此鑒定化合物23為4-乙烯基3-甲氧基苯酚,其結(jié)構(gòu)圖見圖4。

圖44-乙烯基3-甲氧基苯酚結(jié)構(gòu)圖

3 討論

本研究采用液質(zhì)聯(lián)用、Sephadex LH-20凝膠柱色譜、ODS柱色譜法、和重結(jié)晶等技術(shù)對(duì)駱駝刺中的有效成分進(jìn)行分離和富集，篩選出抗腫瘤活性組分并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，可以為駱駝刺活性成分的深入研究提供參考。在活性篩選的研究中，首先利用 MTT法檢測(cè)各不同極性萃取部位對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制能力，明確其中的正丁醇和乙酸乙酯部位對(duì)Hela細(xì)胞具有一定的抑制作用，進(jìn)而對(duì)上述二種部位進(jìn)行篩選，利用5-FU與駱駝刺中各單體化合物進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其中化合物8、15、21和23對(duì)Hela細(xì)胞增殖有較強(qiáng)的抑制作用(P<0.05)，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，經(jīng)鑒定分別為紫鉚素，原兒茶醛，tortoside A，4-乙烯基-3-甲氧基苯酚。4種化合物都是首次從駱駝刺屬植物中分離的，化合物8、15、21的抗腫瘤作用與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[9，13]，而化合物23的抗腫瘤作用是本研究首次報(bào)道。本研究從細(xì)胞水平探索了駱駝刺對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響，而其具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步探討。

參考文獻(xiàn)：

[1] 楊霞,鄭江華,穆晨,等.氣候變化下駱駝刺潛在地理分布區(qū)預(yù)測(cè)[J].中國中藥雜志,2017,42(3):450-455.

[2] 米克熱木·沙衣布扎提,蔣志惠,吾買爾江·牙合甫, 等. 傳統(tǒng)維藥駱駝刺刺糖有效成分及藥理作用的研究進(jìn)展[J].中藥材, 2016,10(39):2397-2399.

[3] 馬曉玲, 魏鴻雁, 徐曉琴, 等. 駱駝刺提取物體內(nèi)外抗腫瘤作用及機(jī)制研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2015,27(3):517-520.

[4] 阿娜爾古麗·買買提. 新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2010～2013年Ⅰ期～Ⅱb期宮頸腺癌預(yù)后因素分析[D].新疆醫(yī)科大學(xué),2017.

[5] 馬曉玲, 魏鴻雁, 賈曉光, 等. 駱駝刺膠囊對(duì)大鼠長期毒性的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中藥藥理與臨床, 2014, 30(2): 113-115 .

[6] 馬曉玲，徐建國，夏提古麗·阿不利孜，等. 駱駝刺提取物對(duì)免疫抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的作用[J] . 新疆醫(yī)學(xué), 2017, 47(10): 1103-1105 .

[7] FAN L, STRASSER-WEIPPL K, LI J J, et al. Breast cancer in China[J]. Lancet Oncol，2014, 15(7):279-289 .

[8] QIONG M X, ZHAN S, WEN J H, et al. Antitumor activity of Pulsatilla chimensis (Bunge)Regel saponins in human liver tumor 7402 cells in vitro and in vivo[J]. Phytomedicine, 2012, 19(3-4): 293-300.

[9] 趙萍萍,霍仕霞,彭曉明,等.驅(qū)蟲斑鳩菊中紫鉚素、紫鉚花素的分離及其對(duì)人A375黑素瘤細(xì)胞黑素合成作用的影響[J].中國藥學(xué)雜志,2013,48(20):1724-1727.

[10] 劉世杰. 毛支清口服液的質(zhì)量控制、制備工藝及抗炎作用研究[D]. 中國民族大學(xué), 2013.

[11] 董潔, 袁將, 王加利, 等. 維藥阿納其根抗腫瘤活性部位篩選及其化學(xué)成分的分離鑒定[J]. 2017, 42(20): 3932-3937.

[12] 于純淼,于棟華,劉曉艷,等.牛蒡菊糖的研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā),2010,31(12):272-275.

[13] 楊琳, 趙慶春, 譚菁菁, 等. 桂枝的化學(xué)成分研究[J]. 實(shí)用藥物與臨床, 2010, 13(3) : 183-185.