乳鐵蛋白修飾的去氫駱駝蓬堿長循環(huán)磁納米脂質(zhì)體的制備和體外性質(zhì)評價

王 梅， 唐小慧， 單 宇， 康瑩瑩， 王瑞珂

(新疆醫(yī)科大學藥學院, 烏魯木齊 830011)

去氫駱駝蓬堿(Harmine, HM)為蒺藜科(Zygophyllaceae)植物駱駝蓬(PeganumharmalaL)的種子中提取出的一種β-咔保林類生物堿，研究表明，其藥理作用十分廣泛[1-3]。其中抗腫瘤作用受到廣泛關(guān)注，研究表明去氫駱駝蓬堿對消化道癌、肝癌等多種癌癥有效。另外，研究表明，去氫駱駝蓬堿很易透過血腦屏障，但去氫駱駝蓬堿大劑量用藥后存在中樞神經(jīng)毒副作用，應(yīng)用后可引起震顫、驚厥、興奮中樞，繼而產(chǎn)生中樞抑制，甚至導(dǎo)致死亡，從而限制了其在臨床的應(yīng)用[4-5]。

磁納米脂質(zhì)體(Magnetoliposomes, ML)是將磁納米粒包裹在脂質(zhì)體的內(nèi)水相或鑲嵌在脂質(zhì)雙分子層內(nèi)形成的磁納米粒和脂質(zhì)體“合二為一”的脂質(zhì)體[6-7]，兼具磁納米粒和脂質(zhì)體的雙重特性。一方面，納米粒被包裹在脂質(zhì)體內(nèi)，可克服磁納米粒體內(nèi)易代謝、半衰期短的缺點，同時還可保留磁納米粒所具有的磁靶向及局部熱療作用；另一方面，磁納米脂質(zhì)體仍具有脂質(zhì)體的易于包載藥物、靶向、緩釋、提高藥物穩(wěn)定性、減少藥物毒性等特點，磁納米脂質(zhì)體在腫瘤的治療研究中已顯示出良好的應(yīng)用前景[8-10]。同時，采用乳鐵蛋白(Lactoferrin，Lf)作為腦靶向分子，可增加藥物在腫瘤部位尤其是腦腫瘤部位細胞攝取[11-13]。

在以上基礎(chǔ)上，本研究設(shè)計了一種乳鐵蛋白修飾的長循環(huán)磁納米脂質(zhì)體，并將去氫駱駝蓬堿包裹在乳鐵蛋白修飾的磁納米脂質(zhì)體內(nèi)，旨在利用磁納米粒的磁靶向和乳鐵蛋白的分子靶向雙重靶向以及脂質(zhì)體的包裹作用，將去氫駱駝蓬堿富集到腫瘤細胞尤其是腦腫瘤細胞，殺滅腦腫瘤細胞，并降低藥物的毒副作用。本研究制備乳鐵蛋白修飾的去氫駱駝蓬堿長循環(huán)磁納米脂質(zhì)體，并對其形態(tài)、粒徑、電位、包封率、釋放度進行考察，以初步探討制備乳鐵蛋白修飾的去氫駱駝蓬堿長循環(huán)磁納米脂質(zhì)體的可行性。

1 材料

1.1儀器紫外可見分光光度計(UV-9100D，北京萊伯泰科儀器有限公司)； Malvern Nano-290型激光粒徑測定儀(英國馬爾文儀器有限公司)；KQ-50B超聲清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)；H -7650透射電鏡(日本HI-TACHI)。

1.2藥品與試劑去氫駱駝蓬堿(含量98.02%，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，20140108)；大豆卵磷脂(上海金畔藥業(yè)有限公司，20110216)；二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC) (Avanti lipid Co.)；膽固醇(Avanti lipid Co.)；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG-2000)(Avanti lipid Co.)；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-羧基交連物(DSPE-PEG-2000- COOH)(美國Nanocs)；檸檬酸包裹的磁納米粒(粒徑30nm,實驗室自制)；其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1HM長循環(huán)磁納米脂質(zhì)體的制備稱取大豆卵磷脂、DPPC、膽固醇、DSPE-PEG2000(質(zhì)量比為10∶10∶5∶1)溶于體積比為2∶1的適量氯仿∶乙醚混合溶劑中，加入檸檬酸包裹的磁納米粒水溶液5 mg及HM 2.5 mg，超聲1～2 h，直至形成穩(wěn)定的乳劑，減壓蒸發(fā)除去有機溶劑，達到膠態(tài)后，加入少量水水化，繼續(xù)減壓蒸發(fā)除去殘留溶劑，即得脂質(zhì)體混懸液，將此混懸液室溫放置3 h以上，依次通過0.45、0.22 μm微孔濾膜18～20次，即得去氫駱駝蓬堿長循環(huán)磁納米脂質(zhì)體。采用不同藥脂比、不同磷脂和膽固醇用量分別制備HM長循環(huán)磁納米脂質(zhì)體，比較形成的各脂質(zhì)體的包封率，以優(yōu)化脂質(zhì)體的處方。

2.2Lf修飾的HM長循環(huán)磁納米脂質(zhì)體制備稱取大豆卵磷脂、DPPC、膽固醇、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-COOH (質(zhì)量比為10∶10∶5∶1∶1)按“2.1”項下方法制備帶有-COOH活性基團的HM長循環(huán)磁納米脂質(zhì)體。將1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)(EDC:NHS:DSPE-PEG2000-COOH=30∶30∶3)加入上述脂質(zhì)體中，室溫下攪拌10 min。加入Lf，室溫下孵育4 h，即得到Lf包裹的HM磁納米脂質(zhì)體。

2.3Lf修飾的HM長循環(huán)磁納米脂質(zhì)體形態(tài)、粒徑、電位測定取Lf修飾的HM長循環(huán)磁納米脂質(zhì)體0.5 mL,加水稀釋至2 mL，從中取1滴，滴于銅網(wǎng)上，晾干后采用透射電鏡觀察脂質(zhì)體的形態(tài)。取Lf修飾的HM長循環(huán)磁納米脂質(zhì)體和未偶聯(lián)Lf的HM長循環(huán)磁納米脂質(zhì)體各0.5 mL,分別加水稀釋至2 mL，采用粒徑測定儀測定各脂質(zhì)體的粒徑和電位。

2.4Lf修飾的HM長循環(huán)磁納米脂質(zhì)體的包封率測定

2.4.1 HM含量測定方法建立 精密稱取HM標準品用甲醇溶解制得100 μg/mL標準貯備液，從中吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分別用甲醇稀釋，制得2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 μg/mL系列標準品溶液。取10 μg/mL標準品溶液于200～400 nm范圍內(nèi)進行紫外掃描，取HM磁納米脂質(zhì)體和空白脂質(zhì)體，分別用甲醇溶解后同法進行紫外掃描，結(jié)果標準品溶液和HM磁納米脂質(zhì)體均在299 nm有最大吸收，空白脂質(zhì)體對測定干擾很小，故確定299 nm為檢測波長。將各濃度標準溶液分別在299 nm處測定吸光度，以吸光度A值對濃度C作線性回歸，得標準曲線方程，同時進行精密度、回收率考察，建立HM的含量測定方法。

2.4.2 超濾離心法測定包封率

2.4.2.1 空白脂質(zhì)體透過能力考察 空白脂質(zhì)體的透過能力考察采用磷脂與硫氰酸鐵胺反應(yīng)后的生成物在485 nm有最大吸收的原理進行測定。具體為：精密吸取空白脂質(zhì)體0.5 mL加水2 mL稀釋，置于超濾離心管以13 000 r/min離心20 min,取1 mL下層濾液于試管中，另取三氯化鐵和硫氰酸銨配制顯色劑，在下層濾液中加顯色劑2 mL,補加氯仿，使試管中氯仿的最終體積為4 mL。置于旋渦混合器混合，再以2 000 r/min離心4 min,小心吸去上層溶液，取下層溶液，以氯仿為空白，在300～800 nm波長處掃描，在最大吸收波長處測定吸光度，如果未檢測到磷脂吸光度，說明超濾膜可以完全截留脂質(zhì)體。

2.4.2.2 包封率測定方法的回收率考察 精稱HM 12.5 mg加水溶解，從中吸取0.3、0.5、1.0 mL，用甲醇稀釋至10 mL，測定吸光度，計算含量，作為離心前的含量。另精密吸取HM溶液0.3、0.5、1.0 mL，各加空白脂質(zhì)體0.5 mL,置于超濾離心管中，以13 000 r/min離心15 min，所得濾液加甲醇稀釋至10 mL，測定吸光度，計算含量，作為離心后的含量，計算回收率?；厥章视嬎愎綖椋?/p>

回收率=離心后含量/離心前含量×100%

2.4.2.3 超濾離心法測定脂質(zhì)體包封率 精密吸取Lf修飾的HM長循環(huán)磁納米脂質(zhì)體0.5 mL，加水2 mL稀釋后置于截留分子量為8 000的超濾管中，13 000 r/min離心15 min，取濾液1 mL加甲醇稀釋至10 mL,置于UV上測定吸光度，計算含量，作為離心后游離藥物的含量。精密吸取此脂質(zhì)體0.5 mL，直接加甲醇破乳并定容至10 mL，置于紫外分光光度計上測定吸光度，計算含量，作為離心前藥物總含量。包封率按下式計算：

包封率=(離心前藥物總量-離心后游離藥物含量)/離心前藥物總量×100%

2.4.3 葡聚糖凝膠柱洗脫法測定Lf包裹的HM長循環(huán)磁納米脂質(zhì)體的包封率[14]

2.4.3.1 洗脫曲線的考察 取溶脹好的SephadexG-50(粒徑100～300 μm)適量裝柱，保持徑高比為1∶10(cm∶cm)，用pH=7.2磷酸鹽緩沖液平衡柱后，吸取0.5 mL脂質(zhì)體液上柱用pH=7.2磷酸鹽緩沖液洗脫，洗脫流速為1 mL/min。收集洗脫液(2 mL/管)，所有洗脫液用甲醇溶解后，在299 nm下測定紫外吸收，代入標準曲線計算含量，以含量為縱坐標，洗脫流份為橫坐標繪制洗脫曲線。

2.4.3.2 包封率測定方法的回收率考察 精密吸取0.5 mL含藥脂質(zhì)體上柱洗脫，收集脂質(zhì)體流份，從脂質(zhì)體流份中取0.5 mL再次上柱洗脫，接取二次過柱的脂質(zhì)體流份，將二次過柱脂質(zhì)體流份和首次過柱得脂質(zhì)體流份分別用甲醇溶解，在299 nm下測定紫外吸光度，求算含量，按下式計算脂質(zhì)體回收率，脂質(zhì)體回收率(%)=二次過柱脂質(zhì)體流份中藥物含量/首次過柱脂質(zhì)體流份中藥物含量×100%。

2.4.3.3 Lf修飾的HM長循環(huán)磁納米脂質(zhì)體包封率的測定 取制備好的Lf包裹的HM磁納米脂質(zhì)體0.5 mL，上樣于Sephadex G-50柱，用pH=7.2磷酸鹽緩沖液洗脫，流速為1mL/min，接取第2～4管脂質(zhì)體流份，加入甲醇破乳溶解，紫外分光光度法測定含量，作為純脂質(zhì)體中藥物含量。另取0.5 mL Lf包裹的HM磁納米脂質(zhì)體直接加甲醇破乳溶解，紫外分光光度計測定吸光度，求算含量，作為脂質(zhì)體中藥物總量，按下式計算包封率。包封率計算公式為：

包封率=純脂質(zhì)體中藥物含量/脂質(zhì)體中藥物總量×100%

2.5Lf修飾的HM長循環(huán)磁納米脂質(zhì)體的釋放度測定精密吸取5 mL HM磁納米脂質(zhì)體裝入截留分子量為12 000的透析袋中，用封口夾夾住透析袋兩端，置于溶出儀中，加入2 00 mL pH=7.2磷酸鹽緩沖液作為釋放介質(zhì)，37℃下勻速轉(zhuǎn)動。于10、20、30 min及1、2、3、4、6、8、24、48、72 h各取樣2 mL，并同時補加等量pH=7.2磷酸鹽緩沖液，樣品用甲醇溶解后，在299 nm處測定吸光度，求算平均累積溶出百分率，以平均累積溶出百分率為縱坐標，釋放時間為橫坐標，繪制釋放曲線。另精密稱取等量去氫駱駝蓬堿原料藥，用pH=7.2磷酸鹽緩沖液溶解后，裝入透析袋，同法進行釋放度測定，以進行比較。

3 結(jié)果

3.1脂質(zhì)體形態(tài)、粒徑、電位測定采用透射電鏡法測定去氫駱駝蓬堿磁納米脂質(zhì)體的形態(tài)，結(jié)果見圖1。粒徑測定儀測定脂質(zhì)體的粒徑和電位，結(jié)果見表1、圖2、圖3。

3.2Lf修飾的HM磁納米脂質(zhì)體的包封率

3.2.1 HM含量測定方法建立 經(jīng)過最大吸收波長檢測、標準曲線制備、精密度和回收率考察，確定紫外分光光度法測定HM含量。最大吸收波長為299 nm，標準曲線方程為C=11.289A-0.282 6(r2=0.999 2),日內(nèi)、日間精密度和加樣回收率RSD值均<2%，平均回收率為(100.64±4.61)%。

Lf修飾的HM長循環(huán)磁納米脂質(zhì)體(×60 000)

空白脂質(zhì)體(×30 000)

圖1 Lf修飾的HM長循環(huán)磁納米脂質(zhì)體和空白脂質(zhì)體形態(tài)

圖2 HM長循環(huán)磁納米脂質(zhì)體的粒徑分布

3.2.2 超濾離心法測定Lf修飾的HM磁納米脂質(zhì)體的包封率

3.2.2.1 空白脂質(zhì)體透過能力考察 將空白脂質(zhì)體超濾離心后，收集下層濾液，進行磷脂紫外光譜掃描，結(jié)果見圖4。由結(jié)果可知，掃描圖中未見最大吸收波長，吸光度基本接近于零，說明下層濾液中無空白脂質(zhì)體，脂質(zhì)體可以和游離藥物分開。

3.2.2.2 超濾離心法測定包封率回收率考察 回收率考察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，回收率在87.65%～104.7%之間，回收率變異較大。表明該法不適用于Lf修飾的HM長循環(huán)磁納米脂質(zhì)體的包封率測定。

3.2.3 葡聚糖凝膠柱洗脫法測定Lf包裹的HM磁納米脂質(zhì)體的包封率

3.2.3.1 洗脫曲線的考察 結(jié)果見圖5，由洗脫曲線結(jié)果可知，脂質(zhì)體流份在第2～4管流出。脂質(zhì)體和游離藥物可以很好地分開。

3.2.3.2 包封率測定方法的回收率考察 結(jié)果見表2。由結(jié)果可知，用Sephadex G-50柱洗脫法測定脂質(zhì)體的包封率，其回收率變異較小，回收率較高，表明該法可做為Lf修飾的HM長循環(huán)磁納米脂質(zhì)體的包封率測定方法。

表2 包封率測定方法回收測定結(jié)果(n=3)

3.2.3.3 葡聚糖凝膠柱洗脫法測定包封率 采用葡聚糖凝膠柱洗脫法測定脂質(zhì)體的包封率，通過比較不同磷脂、膽固醇比例和不同藥脂比條件下所制得的HM長循環(huán)磁納米脂質(zhì)體的包封率結(jié)果，見圖6，可知在磷脂、膽固醇比例為10∶10∶5∶1，藥脂比為1∶20的處方條件下，所制得的3批HM長循環(huán)磁納米脂質(zhì)體的包封率最高，但考慮載藥量的大小，藥脂比1∶10的載量量要高于1∶20，因此最終選擇磷脂、膽固醇比例為10∶10∶5∶1，藥脂比為1∶10的處方為制備HM磁納米脂質(zhì)體最佳處方。通過比較HM磁納米脂質(zhì)體和Lf修飾后的HM磁納米脂質(zhì)體包封率值，結(jié)果修飾后包封率可達(71.28±2.94)%，未修飾HM磁納米脂質(zhì)體包封率為(66.20±12.32)%，兩者結(jié)果無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，說明Lf修飾不會影響脂質(zhì)體的包封率。

3.3Lf修飾的HM磁納米脂質(zhì)體的釋放度測定Lf修飾的HM磁納米脂質(zhì)體的釋放度測定結(jié)果見圖7。由結(jié)果可知，脂質(zhì)體與游離藥物相比，游離藥物在數(shù)小時內(nèi)釋放即已完全，而脂質(zhì)體在24 h后釋放才基本完全。表明藥物制成脂質(zhì)體后，釋藥更加緩慢,Lf修飾的HM磁納米脂質(zhì)體與未修飾HM磁納米脂質(zhì)體相比，釋藥更加緩慢。

圖6 不同磷脂、膽固醇比、藥脂比的包封率(n=3)

圖7 Lf修飾的HM磁納米脂質(zhì)體的釋放曲線 (n=3)

4 討論

本實驗采用逆相蒸發(fā)法制備了Lf修飾的HM長循環(huán)磁納米脂質(zhì)體，并對其體外性質(zhì)進行了考察。結(jié)果證實脂質(zhì)體已形成，對Lf包裹前后脂質(zhì)體的粒徑、電位進行測定，其粒徑結(jié)果分別為240.5 nm，407.8 nm，脂質(zhì)體荷負電。采用兩種方法測定了脂質(zhì)體的包封率。其中經(jīng)測定，超濾離心法測得脂質(zhì)體的包封率為(85.75±4.57)%，但因在對包封率測定方法的回收率考察中發(fā)現(xiàn)，回收率變異較大，且當超濾的樣品量達到2 mL時，回收率超過100%，經(jīng)過多次測定，回收率依然不能達到100%，因此本文未選用超濾離心法測定脂質(zhì)體的包封率。本文采用葡聚糖凝膠柱洗脫法測定Lf包裹的HM磁納米脂質(zhì)體的包封率，該測定方法回收率高，洗脫曲線表明脂質(zhì)體與游離藥物已分開，且該法簡便易行，可作為脂質(zhì)體包封率測定方法。經(jīng)測定Lf修飾的HM長循環(huán)磁納米脂質(zhì)體包封率可達(71.28±2.94)%。Lf修飾前后包封率變化不大，說明Lf修飾基本不會影響藥物的包封率。最后經(jīng)脂質(zhì)體釋放度考察，表明脂質(zhì)體與原料藥和未修飾的磁納米脂質(zhì)體相比，釋藥更加緩慢，說明該法制得的脂質(zhì)體具有一定的緩釋作用。

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