蒙藥蒙古山蘿卜花中總黃酮的含量測(cè)定方法△

金 蓉 賽 那 蘇曉麗 郭 偉 劉 暢 馬月宏* 周海霞

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110;2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110； 3.內(nèi)蒙古包頭市北方重工集團(tuán)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭 014030)

蒙古山蘿卜花，又稱(chēng)藍(lán)盆花，別名輪鋒菊，松蟲(chóng)草[1]，為川續(xù)斷科藍(lán)盆花(山蘿卜)屬植物。約100種，產(chǎn)于歐洲、亞洲、非洲南部和西部，主產(chǎn)地中海地區(qū)。我國(guó)有9種2變種，主要分布于內(nèi)蒙古、黑龍江、吉林、遼寧、河北等省?！吨腥A人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》(蒙藥分冊(cè))[2]中規(guī)定作為正品藥用，該蒙藥味甘、澀，性鈍、燥、膩、重、涼，具解熱、清“協(xié)日”之功效，蒙醫(yī)臨床用于肺熱、肝熱、咽喉熱等，主治肝火頭痛、發(fā)燒、肺熱咳嗽、黃疸等病[3]；藏醫(yī)多用于肺熱、肝熱、咽喉熱等疾病的治療。

現(xiàn)代藥理研究表明蒙古山蘿卜花植物中所含化學(xué)成分類(lèi)型較多，主要有黃酮類(lèi)、三萜類(lèi)、環(huán)烯醚萜、香豆素類(lèi)、酚類(lèi)、有機(jī)酸和揮發(fā)油等結(jié)構(gòu)類(lèi)型[4]。藥理作用有解熱抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、鎮(zhèn)靜、增強(qiáng)免疫、抗菌、保護(hù)腎臟、減肥等功能[5]，尤其是在抗氧化和抑菌等方面效果顯著[6]。主要有效成分為黃酮類(lèi)和三萜類(lèi)[7]。因此，我們很有必要建立一種經(jīng)濟(jì)、快捷的蒙古山蘿卜花中總黃酮的體外含量測(cè)定方法，為進(jìn)一步探究其體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)過(guò)程及作用機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 蒙古山蘿卜花藥材購(gòu)自天康蒙藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20140418，20150729；經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室及蒙醫(yī)藥學(xué)院蒙藥炮制實(shí)驗(yàn)室鑒定為川斷續(xù)科植物華北藍(lán)盆花的干燥花序。蘆丁對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品鑒定所)；其余試劑均為分析純。

TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；ZTB-B磁力攪拌電熱套(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司)；AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；RE-201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；SHZ-CA循環(huán)水式多用真空泵(鞏義市英峪儀器廠(chǎng))；sigma3-18高速低溫離心機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品10.0mg，置于50mL容量瓶中，加入10%的乙醇適量，超聲使溶解，再加入30%乙醇，稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為200mg·L-1蘆丁對(duì)照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備 將干燥蒙古山蘿卜花藥材粉粹后過(guò)40目篩，制成實(shí)驗(yàn)中所使用的蒙古山蘿卜花藥材粗粉。精密稱(chēng)定蒙古山蘿卜花粗粉17g，加70%乙醇200mL，加熱回流1h，抽濾，濾渣用70%乙醇洗滌，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至約200mL，得到的濃縮液用70%乙醇定容于250mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，備用。精密量取蒙古山蘿卜花提取液1mL，置于200mL容量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

1.2.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 精密量取1.2.1項(xiàng)下蘆丁對(duì)照品溶液1.0mL，置于25mL容量瓶中，加30%的乙醇至6.0mL，在加5%的亞硝酸鈉溶液1.0mL，搖勻，放置6min；加10%的硝酸鋁溶液1.0mL，搖勻，放置6min；加10%的氫氧化鈉溶液10.0mL，加30%乙醇至刻度，搖勻，放置10min。以相應(yīng)的試劑作空白，于分光光度計(jì)200～800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。得出在509nm處有最大吸收，故選擇509nm波長(zhǎng)作為測(cè)定波長(zhǎng)。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制[8]精密稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品10mg，加10%乙醇溶解，室溫下超聲10min，轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中，用30%乙醇定容即得對(duì)照品溶液。精密吸取該3.0mL，4.5mL，6.0mL，7.5mL，9.0mL，10.5mL分別置于25mL容量瓶中加30%乙醇至10.5mL，按1.2.3項(xiàng)下“加5%亞硝酸鈉溶液1.0mL”。放置10min后，以相應(yīng)試劑做空白，于509nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以濃度(C)與吸光度(A)進(jìn)行直線(xiàn)回歸。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)附圖1，得到回歸方程為Y=0.0076X+0.0404(R=0.9997)。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

圖1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

1.2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密量取1.2.1項(xiàng)下蘆丁對(duì)照品溶液1.0mL，置于25mL容量瓶中，按1.2.3項(xiàng)下“加5%亞硝酸鈉液1.0mL”。放置10min后，以相應(yīng)試劑做空白，于509nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。連續(xù)測(cè)定5次，計(jì)算精密度，結(jié)果測(cè)得吸光度的RSD為0.056%，(n=5)，表明精密度良好。

1.2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密量取1.2.1項(xiàng)下蘆丁對(duì)照品溶液1.0mL于25mL容量瓶中，按1.2.3項(xiàng)下“加5%亞硝酸鈉液1.0mL”。放置10、15、20、25、30、35、40、45、50min后，以相應(yīng)試劑做空白，于509nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。測(cè)定同一試液在不同時(shí)間的總黃酮含量，以判斷試液的穩(wěn)定性，結(jié)果表明，樣品的吸光度在30min內(nèi)保持穩(wěn)定。

1.2.7 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 精確量取2mL1.2.1項(xiàng)下蘆丁對(duì)照品溶液，5份于50mL容量瓶中，同2.1.5項(xiàng)下處理，以相應(yīng)試劑做空白，于509nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定5份溶液的吸光度，計(jì)算重現(xiàn)性，結(jié)果測(cè)得吸光度的RSD為0.42%，(n=5)，表明重現(xiàn)性良好。

1.2.8 回收率實(shí)驗(yàn) 精確量取1.2.2中供試品溶液0.3mL，平行3份；精確量取1.2.1中蘆丁對(duì)照品溶液0.5mL，平行3份，分別置于25mL容量瓶中。加30%乙醇至7.0mL，再按1.2.3項(xiàng)下“加入5%亞硝酸鈉溶液1.0mL”，加30%乙醇至刻度，搖勻后放置10min，依法測(cè)定吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上讀出各組濃度(mg·L-1)，計(jì)算回收率，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

2 含量測(cè)定

精密量取1.2.9中含測(cè)溶液0.3mL，置于25mL容量瓶中，加30%乙醇至7.0mL，再加入5%亞硝酸鈉溶液1.0mL，搖勻后放置6min；再加入10%硝酸鋁溶液1.0mL，搖勻后放置6min；最后加10%氫氧化鈉溶液10mL，加30%乙醇至刻度，搖勻后放置10min，以相應(yīng)的試劑做空白，于波長(zhǎng)509nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮的含量在4.0%以上。

表3 含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色體系，其原理是先以NaNO2還原黃酮類(lèi)化合物，再加Al(NO3)3絡(luò)合，最后加NaOH溶液顯色，產(chǎn)生紅色化合物進(jìn)行比色測(cè)定。該顯色體系具有一定的局限性，其限定測(cè)定波長(zhǎng)為500～510nm，并且一般采用的對(duì)照品多為蘆丁[9]。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中由于3種試劑加入的量不同，步驟繁瑣，所以可以進(jìn)一步將該顯色體系的試劑加入量進(jìn)行正交優(yōu)化。對(duì)于提取方法的考察，參考趙子龍等對(duì)于天然植物中總黃酮的提取方法研究[10]，選用了乙醇回流提取法，加入乙醇濃度70%，提取時(shí)間1h，提取次數(shù)1次。選取2個(gè)不同批號(hào)的蒙古山蘿卜花中藥飲片，其中總黃酮的含量均在4%以上。

[1]國(guó)家中醫(yī)藥管理局中華草本編委會(huì).中華本草·蒙藥卷[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2004:385.

[2]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部．中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn):蒙藥分冊(cè)[S]．1998: 52.

[3]麻劍南.蘋(píng)果梨果皮和藍(lán)盆花的化學(xué)成分及生物活性研究[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古大學(xué)，2015.

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[10]趙子龍，薛培鳳，倪佩東，等.天然藥物中總黃酮的提取工藝研究進(jìn)展[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012,34(6)：512-515.