下調(diào)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的實(shí)驗(yàn)研究

，，，

內(nèi)皮細(xì)胞在維持血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮核心作用，內(nèi)皮功能障礙將會(huì)導(dǎo)致血管收縮、白細(xì)胞黏附、膠原蛋白受損、血小板激活、血栓形成、氧化應(yīng)激及血管壁的炎癥反應(yīng)參與一系列心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[1]。因此，改善內(nèi)皮功能成為心血管疾病新的治療靶點(diǎn)。其中腎素-血管緊張素(RAS)系統(tǒng)，尤其是血管緊張素Ⅱ在內(nèi)皮功能障礙的發(fā)生、發(fā)展及動(dòng)脈粥樣中發(fā)揮核心作用，限制血管緊張素Ⅱ生物活性仍然是心血管疾病治療的基石[2]。因此，限制調(diào)控血管緊張素Ⅱ生成的限速酶血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)成為改善內(nèi)皮功能的關(guān)鍵。目前，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI)以及血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(angiotensinⅡ receptor blocker，ARB)已經(jīng)被大量臨床研究證實(shí)能夠逆轉(zhuǎn)心血管重構(gòu)、降低病死率、改善預(yù)后，但傳統(tǒng)的ACE阻斷非血管特異、組織特異、血管壁特異[3]。因此，本研究嘗試構(gòu)建腺病毒載體使其攜帶有ACE基因短發(fā)夾RNA(shRNA)，然后通過(guò)下調(diào)原代培養(yǎng)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)ACE的基因表達(dá)，通過(guò)ACE基因水平干預(yù)RAS系統(tǒng)表達(dá)，探索RNAi技術(shù)阻斷內(nèi)血管皮細(xì)胞ACE的表達(dá)在心血管疾病基因治療領(lǐng)域中的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 主要材料 已經(jīng)先期由本研究小組構(gòu)建完成的p-ACE-sh-RNA質(zhì)粒，增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(EGFP)序列、人源U6啟動(dòng)子，Taq DNA聚合酶、質(zhì)粒pGenesil-1克隆至兩個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶的EcoR1和Sac1之間位點(diǎn)。內(nèi)含有大鼠ACE靶向性的 sh-RNA片段、AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)主要包括3 Cre、穿梭質(zhì)粒pDC316-EGFP -shRNA-U6、p BHGlox-E1腺病毒骨架質(zhì)粒與HEK- 293細(xì)胞等(北京本元正陽(yáng)公司)。T4 DNA連接酶、各種限制性?xún)?nèi)切酶等。 轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(Gibco)、RNase A(TaKaRa)、PCR回收純化產(chǎn)物試劑盒(寧波中鼎公司)。質(zhì)粒抽提盒(QIAGEN)，胎牛血清(Hyclone)，氯化銫(Sigma)DMEM，F(xiàn)12培養(yǎng)基(Gibco)。超絕UNIQ-10柱總RNA抽提試劑盒(上海生工生物工程公司)。其余各種試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?。探針、引物的設(shè)計(jì)及合成由上海基康生物技術(shù)工程有限公司完成。

1.2 目的基因的獲取 采用熱休克法將p-ACE-shRNA質(zhì)粒取1 μL轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH-5α，接種入LB 培養(yǎng)基5 mL中，取出少部分其單克隆，在37 ℃培養(yǎng)振蕩約18 h，取3 mL菌液從中提取質(zhì)粒。在HindIII限制酶和BamHI限制酶共同作用下，在37 ℃水浴酶切中過(guò)夜。酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳之后取1 μL 6×Loading Buffer與5 μL酶切產(chǎn)物混勻上樣后進(jìn)行電泳來(lái)獲取目的基因(10 V/cm)。

1.3 pDC316-EGFP-ACE-U6-shRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建 酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下收集質(zhì)粒pDC316-EGFP-shRNA-U6的5.2 kb片段酶切產(chǎn)物、質(zhì)粒pACE-shRNA的60 bp片段酶切產(chǎn)物，回收DNA片段。DNA連接酶在16 ℃水浴連接過(guò)夜，用熱休克法取連接產(chǎn)物5 μL轉(zhuǎn)化入DH-5α 感受態(tài)大腸桿菌，在37 ℃下培養(yǎng)振蕩18 h，之后取出菌液3 mL提取質(zhì)粒，再用酶切等方法篩選出重組正確的質(zhì)粒，命名為pDC316-EGFP-ACE-U6-shRNA。之后pDC316-EGFP-ACE-U6-shRNA重組質(zhì)粒再進(jìn)行酶切鑒定，送上海英駿生物公司進(jìn)行重組質(zhì)粒鑒定。

1.4 雙質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，同源重組而產(chǎn)生重組腺病毒 在轉(zhuǎn)染的前1 d，293細(xì)胞被接種至六孔板中，每孔大約有5×105個(gè)細(xì)胞，準(zhǔn)備DMEM+10% Hyclone的胎牛血清的培養(yǎng)基，置于含有5% CO2的 37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。待細(xì)胞生長(zhǎng)到80%～90%底面積時(shí)，取穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。同時(shí)用脂質(zhì)體Lipofectamine2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，用培養(yǎng)液DMEM進(jìn)行稀釋?zhuān)D(zhuǎn)染之后需要觀察出毒跡象。仔細(xì)觀察后發(fā)現(xiàn)出毒現(xiàn)象即為細(xì)胞會(huì)呈葡萄狀，變大變圓，并開(kāi)始出現(xiàn)明顯的噬斑。一定要等待大部分細(xì)胞病變而且底部脫落之后再進(jìn)行收毒。將其命名為Ad5-EGFP-ACE-shRNA。

1.5 將重組腺病毒Ad5-EGFP-ACE-shRNA進(jìn)行PCR鑒定 293細(xì)胞被放在25 cm2的細(xì)胞瓶中培養(yǎng)，等到細(xì)胞長(zhǎng)到底面積90%時(shí)，取上述第一代毒種(P1)接種至該細(xì)胞上，等到細(xì)胞發(fā)生完全病變時(shí)可按上述方法進(jìn)行凍融細(xì)胞3次，燃后收集已經(jīng)離心病毒的上清液，即為第二代的毒種(P2)。最后進(jìn)行目的基因的PCR鑒定，PCR的反應(yīng)條件為：55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)；然后72 ℃5 min。之后再進(jìn)行毒種生產(chǎn)、純化和滴度測(cè)定。

1.6 大鼠ECs的培養(yǎng)與鑒定 首先可以在無(wú)菌條件下解剖取出大鼠胸主動(dòng)脈，然后采用組織貼塊法進(jìn)行血管ECs培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底時(shí)即開(kāi)始傳代，免疫熒光Ⅷ因子相關(guān)抗原檢測(cè)陽(yáng)性即鑒定為ECs，實(shí)驗(yàn)采用第3代～第4代的細(xì)胞。

1.7 Ad5-EGFP-ACE-shRNA重組腺病毒轉(zhuǎn)染大鼠的血管ECs 當(dāng)大鼠的血管ECs生長(zhǎng)至80%～90%瓶底融合時(shí)給予傳代，無(wú)菌蓋玻片的6孔板以5×105個(gè)/孔接種放置，細(xì)胞同步化后分為空白對(duì)照組、陽(yáng)性病毒組和陰性病毒組3組。在接種后24 h，細(xì)胞達(dá)60%～80%融合后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，加入等量維持液，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，直接將病毒滴加入培養(yǎng)基中，每孔按照1∶10接種。熒光顯微鏡下觀察48 h后EGFP表達(dá)情況。分別在轉(zhuǎn)染前及轉(zhuǎn)染之后24 h、48 h、72 h收集試驗(yàn)細(xì)胞。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ACE mRNA表達(dá) 根據(jù)參試劑盒說(shuō)明書(shū)來(lái)提取總的RNA，然后可以反轉(zhuǎn)錄成cDNA。在GenBank上選取大鼠的ACE mRNA序列(序列號(hào)NM_012544)，ACE探針序列為5’-FTGGCACTTGTCTGTCACTGGAGCCTGATP-3’，上游引物為5’-GCCTCCCAACGAGTTAGAAGAG-3’，下游引物為5’-CGGGACGTGGCCATTATATT-3’；β-actin探針序列為5’-FTCCAGCCTTCCTTCCTGGGTATGGAATC-3’，上游引物為5’-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3’，下游引物為5’-GGATGTCAACGTCACACTTCATG-3’；探針修飾：P代表TAQMAN-MGB基團(tuán)，F(xiàn)代表FAM。首先樣品的目的基因與管家基因(β-actin)被進(jìn)行PCR的擴(kuò)增，之后制備標(biāo)準(zhǔn)的樣品曲線。其產(chǎn)物需要進(jìn)行梯度稀釋用于做標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR的反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火、延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)。在GeneAmp 5700 sequence Detector System進(jìn)行樣品擴(kuò)增同時(shí)可以收集熒光信號(hào)，之后分析結(jié)果。為消除mRNA定量與RT及PCR反應(yīng)效率的差異對(duì)結(jié)果的影響，實(shí)驗(yàn)中仍然需要同步進(jìn)行內(nèi)對(duì)照β-actin絕對(duì)拷貝數(shù)之定量檢測(cè)，目的用以計(jì)算檢測(cè)基因與β-actin絕對(duì)拷貝數(shù)之比作為檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 pACE-shRNA質(zhì)粒的酶切鑒定(見(jiàn)圖1) pACE-shRNA質(zhì)粒經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切預(yù)期得到60bp的小片段和4.8kb兩條帶。結(jié)果與預(yù)期相符。

1代表BamHI+HindIII雙酶切pACE-shRNA質(zhì)粒； M1代表DL15 000(上樣5 μL，條帶大小分別為15000、10000、7500、5000、2500、1000、250)；M2代表DL2 000(上樣5 μL，條帶大小分別為2000、1000、750、500、250、100)。

圖1 pACE-shRNA質(zhì)粒的酶切鑒定電泳圖

2.2 酶切鑒定及測(cè)序鑒定 pDC316-EGFP-ACE-shRNA-U6重組質(zhì)粒設(shè)計(jì)在質(zhì)粒pDC316-EGFP-ACE-U6-shRNA中shRNA的編碼序列之后插入了一個(gè)SalI位點(diǎn)，所以，一條線性化條帶5.2 kb預(yù)計(jì)經(jīng)SalI單酶切產(chǎn)生，得到的電泳結(jié)果(見(jiàn)圖2)與預(yù)計(jì)的相符，可以證實(shí)該重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定構(gòu)建正確。

用引物Cdcksi-r在英駿公司進(jìn)行測(cè)序比對(duì)后表明：測(cè)出的序列與U6啟動(dòng)子序列完全相同。已經(jīng)成功將shRNA的序列構(gòu)建到重組質(zhì)粒pDC316-EGFP-ACE--U6-shRNA中，因此，重組質(zhì)粒pDC316-EGFP-ACE-shRNA-U6的構(gòu)建被證實(shí)正確。

1代表SalI單酶切pDC316-EGFP-ACE-shRNA-U6質(zhì)粒；2代表pDC316-EGFP-ACE-shRNA-U6質(zhì)粒；M1代表DL2 000(上樣5μL，條帶大小分別為2000、1000、750、500、250 、100)；M2代表DL15 000(上樣5 μL，條帶大小分別為15 000、10 000、7 500、5 000、2 500、1 000)。

圖2重組質(zhì)粒pDC316-EGFP-ACE--U6-shRNA酶切鑒定電泳圖

2.3 Ad5-EGFP-ACE-shRNA重組腺病毒的PCR的鑒定、測(cè)序及滴度測(cè)定經(jīng)鑒定Ad5-EGFP-ACE-shRNA能擴(kuò)增出目的基因，大小約在500bp左右(見(jiàn)圖3)。

1代表Ad5-EGFP-ACE-shRNA-U6DNA原液；2代表Ad5-EGFP-ACE-shRNA-U6DNA稀釋10倍；3代表Ad5-EGFP-ACE-shRNA-U6DNA稀釋100倍；4代表陽(yáng)性對(duì)照(pDC316-EGFP-ACE-shRNA-U6)；5代表陰性對(duì)照；M代表DL2 000Marker(2 000、1 000、750、500、250、100)。

圖3 PCR電泳圖

DNA測(cè)序結(jié)果同前比對(duì)表明，以位點(diǎn)特異性基因重組方式產(chǎn)生的重組腺病毒所克隆的序列和已知序列完全一致，未發(fā)現(xiàn)有移碼或突變，表明腺病毒骨架質(zhì)粒和穿梭質(zhì)粒發(fā)生了重組。

滴度測(cè)定結(jié)果表明：Ad5對(duì)照腺病毒的感染性滴度(TCID50/mL)為7.3×109，Ad5-EGFP-ACE-shRNA 的感染性滴度(TCID50/mL)為 8×109。

2.4 293細(xì)胞被Ad5-EGFP-ACE-shRNA重組腺病毒轉(zhuǎn)染結(jié)果 293細(xì)胞被Ad5-EGFP-ACE-shRNA重組腺病毒轉(zhuǎn)染(見(jiàn)圖4)，熒光顯微鏡即可觀察到轉(zhuǎn)染48 h后被轉(zhuǎn)染細(xì)胞出現(xiàn)綠色的熒光(見(jiàn)圖5)，表明有GFP的表達(dá)。光學(xué)顯微鏡下觀察到出現(xiàn)綠色熒光的細(xì)胞且細(xì)胞內(nèi)顆粒增多、圓縮、聚集、噬斑形成突起減少，可見(jiàn)“葡萄串”樣形態(tài)學(xué)特征(見(jiàn)圖6)，有感染能力的腺病毒顆粒被證實(shí)包裝成功。

圖4轉(zhuǎn)染前的293細(xì)胞

圖5重組腺病毒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后48 h(熒光顯微鏡)

圖6 重組腺病毒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后噬斑照片(光學(xué)顯微鏡)

2.5 大鼠血管ECs的培養(yǎng)及鑒定 倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn)大鼠血管ECs核圓、居中、細(xì)胞邊界清晰，呈多角形，偶見(jiàn)雙核，單層細(xì)胞觀察到可呈鋪路石狀排列(見(jiàn)圖7)。對(duì)原代和傳代的細(xì)胞進(jìn)行Ⅷ因子的鑒定：在熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞呈多邊形，胞漿發(fā)出綠色熒光，核圓形或橢圓形，邊界清晰，大鼠血管ECs被證實(shí)培養(yǎng)成功(見(jiàn)圖8)。

圖7 大鼠內(nèi)皮細(xì)胞(×100)

圖8大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞Ⅷ因子免疫熒光鑒定(×200)

2.6 Ad5-EGFP-ACE-shRNA重組腺病毒轉(zhuǎn)染大鼠血管ECs之后EGFP的表達(dá) Ad5-EGFP-ACE-shRNA重組腺病毒在轉(zhuǎn)染大鼠血管ECs 48 h后即可在熒光顯微鏡之下觀察看到病毒載體所編碼的EGFP表達(dá)，證實(shí)該病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞成功；同時(shí)可見(jiàn)到感染細(xì)胞可出現(xiàn)很強(qiáng)的凝聚性并形成細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞的折光性增強(qiáng)，有時(shí)呈現(xiàn)串狀(見(jiàn)圖9)。轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到95%以上。

圖9 Ad5-EGFP-ACE-shRNA
轉(zhuǎn)染大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞后48 h(×200)

2.7 Ad5-EGFP-ACE-shRNA轉(zhuǎn)染大鼠血管ECs之后對(duì)ACE mRNA表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組和陰性病毒組相比，轉(zhuǎn)染之后24 h陽(yáng)性病毒組Ad5-EGFP-ACE-shRNA細(xì)胞的ACE mRNA表達(dá)并無(wú)明顯變化；而48 h顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；72 h時(shí)更低；表明Ad5-EGFP-ACE-shRNA可以明顯下調(diào)ACE mRNA的表達(dá)。而轉(zhuǎn)染前后各時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組和陰性病毒組ACE mRNA表達(dá)卻無(wú)顯著變化(見(jiàn)表1)。結(jié)果提示RNAi所介導(dǎo)的基因沉默作用主要是通過(guò)靶mRNA的下調(diào)而產(chǎn)生的。

表1 各組細(xì)胞干預(yù)前后對(duì)ACE/β-actin mRNA表達(dá)的影響(±s)

3 討 論

全世界每年約有1 700萬(wàn)人死于心血管疾病，居死亡原因首位。盡管心血管介入技術(shù)及新型藥物的研制正在迅猛發(fā)展，但目前的治療現(xiàn)狀仍然不是很滿(mǎn)意?？上驳氖墙┠陙?lái)國(guó)際上對(duì)RNAi技術(shù)的研究已經(jīng)取得極大進(jìn)展，通過(guò)RNAi技術(shù)使致病基因沉默，成功阻斷特異性致病基因表達(dá)技術(shù)已經(jīng)非常成熟，體內(nèi)基因敲除技術(shù)也正在興起，該項(xiàng)技術(shù)已廣泛用于生命科學(xué)的多個(gè)領(lǐng)域，也為心血管疾病的基因治療帶來(lái)希望[4-6]。近些年來(lái) ，國(guó)際上多位學(xué)者運(yùn)用RNAi技術(shù)對(duì)心血管疾病的基因治療進(jìn)行了大量研究[7-8]。我們的研究成功地構(gòu)建了攜帶有ACE-shRNA基因片段的重組腺病毒載體Ad5-EGFP-ACE-shRNA，并獲得了較高的病毒滴度，成功轉(zhuǎn)染了大鼠ECs，有效地抑制了ACE mRNA 表達(dá)，證實(shí)在原代培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中RNAi技術(shù)能發(fā)揮基因下調(diào)作用，減少血管緊張素Ⅱ的生成，從而為心血管疾病ACE靶點(diǎn)的基因治療帶來(lái)希望，并為心血管疾病基因診斷及治療帶來(lái)新的希望。

皮細(xì)胞在維持血管穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，是多種心血管疾病發(fā)病的重要機(jī)制，改善內(nèi)皮功能對(duì)多種心血管疾病均具有極大的保護(hù)效應(yīng)。其中RAS系統(tǒng)，尤其是血管緊張素Ⅱ在內(nèi)皮功能障礙的發(fā)生、發(fā)展及動(dòng)脈粥樣中發(fā)揮核心作用，限制血管緊張素Ⅱ生物活性無(wú)疑是心血管疾病治療的基石[1-3]。因此限制調(diào)控血管緊張素Ⅱ生成的限速酶——血管緊張素轉(zhuǎn)化酶成為改善內(nèi)皮功能的關(guān)鍵。目前，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶以及血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑已經(jīng)被大量臨床研究證實(shí)能夠降低心血管發(fā)病率逆轉(zhuǎn)重構(gòu)、改善預(yù)后、降低病死率。

動(dòng)脈粥樣硬化傳統(tǒng)的危險(xiǎn)因素包括高血壓、高脂血癥、糖尿病、肥胖、年齡、吸煙、心血管疾病家族史等，已被多位學(xué)者公認(rèn)，傳統(tǒng)的危險(xiǎn)因素只能解釋50%的動(dòng)脈粥樣硬化，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)ECs是動(dòng)脈粥樣硬化的早期表現(xiàn)，它可能是獨(dú)立于是AS獨(dú)立的、綜合的預(yù)測(cè)因素。然而近年來(lái)研究表明血管緊張素Ⅱ所致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、血管壁炎癥及氧化應(yīng)激在動(dòng)脈中發(fā)揮重要作用[1，9]。有研究表明，激活內(nèi)皮細(xì)胞表面的血管緊張素Ⅱ會(huì)加速NO的降解，減少內(nèi)皮依賴(lài)性血管擴(kuò)張，從而導(dǎo)致動(dòng)脈壁損傷，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表面LDL形成ox-LDL，啟動(dòng)動(dòng)脈粥樣硬化[10]。血管緊張素Ⅱ促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB生成，NF-κB通過(guò)增加ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、MCP-1、IL-1、IL-6生成而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生及進(jìn)展[11-14]；通過(guò)刺激NADP(H)和黃嘌呤氧化酶的活性而誘導(dǎo)氧自由基產(chǎn)生，加速動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程[15]；通過(guò)激活誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊纖維帽MMPs，導(dǎo)致纖維帽破裂從而誘發(fā)ACS[16]；本研究從基因水平阻斷ACE表達(dá)，減少血管緊張素Ⅱ的生成，理論上可以阻斷炎癥、氧化應(yīng)激及基質(zhì)金屬蛋白酶活動(dòng)在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用，有望為冠心病ACE靶點(diǎn)的基因治療帶來(lái)希望。

高血壓是全世界發(fā)病率最高的疾病之一，高血壓的發(fā)病是綜合的多因素疾病，內(nèi)皮功能障礙與高血壓密切相關(guān)。其中RAAS系統(tǒng)通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能在高血壓發(fā)病中發(fā)揮極為重要的作用[17]。最近目前已經(jīng)有不少學(xué)者利用miRNA技術(shù)研究了RAAS相關(guān)的miRNA對(duì)高血壓的影響。Marques等[18]發(fā)現(xiàn)遺傳性高血壓病人交感神經(jīng)過(guò)度激活，miR-181a 表達(dá)降低時(shí)，腎素生成增多，血壓升高。因此miR-181a 表達(dá)水平增加時(shí)會(huì)通過(guò)抑制交感神經(jīng)系統(tǒng)活性、減少腎素分泌來(lái)降低血壓； Hu等[19]研究發(fā)現(xiàn)miR-145過(guò)度表達(dá)會(huì)可下調(diào)ACE蛋白水平表達(dá)，導(dǎo)致血壓下降，但這種途徑并不會(huì)引起ACE mRNA的減少。相反激活ERK1/2 通路將會(huì)抑制 miR-145表達(dá)，上調(diào)ACE的表達(dá)水平導(dǎo)致血壓升高； Eskildsen等[20]體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)均證明miR-132、miRNA-212水平和血壓水平正相關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)miR-132、miR-212，通過(guò)激活Gαq依賴(lài)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與AngⅡ介導(dǎo)的高血壓的發(fā)生；最近的研究表明miR-155表達(dá)水平增高可下調(diào)ATG1RmRNA使血壓下降[21]；miR-124、miR-135a能夠抑制鹽皮質(zhì)激素受體基因表達(dá)減輕前負(fù)荷使血壓下降[22-23]；上述研究均為高血壓的基因診斷及治療帶來(lái)希望，但是本研究運(yùn)用RNAi技術(shù)降解ACE mRNA，下調(diào)ACE，可使血壓水平下降。且RNAi技術(shù)相比miRNA技術(shù)高效、更特異、更持久，周期短、成本低[4-6]，降壓效果及靶器官保護(hù)效應(yīng)可能比上述研究更持久，目前運(yùn)用RNAi技術(shù)沉默內(nèi)皮細(xì)胞ACE基因的研究報(bào)道甚少，本研究有望為高血壓的基因治療提供新的思路。

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