玉米自交系B73銨轉運蛋白基因家族分析

李紅梅，韓國民

農業(yè)過程中通常會使用大量的氮肥來滿足農作物的需求，但由于作物對氮肥的吸收不完全造成了水環(huán)境的污染[1-2]。植物生長過程中需要大量的氮素，它作為植物體內核酸和蛋白質等的主要成分，對作物的產量起著非常重要的作用，大約為40%～50%。植物對氨素的吸收主要是通過銨轉運蛋白（Ammonium transporter，AMT）進行的[3-5]，研究發(fā)現(xiàn)低濃度的銨態(tài)氮（20～200 umol/L）能促進植物的生長，但過量會對種子的發(fā)芽和發(fā)育起到抑制作用，并會引起黃葉甚至死亡的現(xiàn)象。為了更好研究植物對氨素的吸收機制，對銨轉運蛋白的研究就非常必要。自1994年在釀酒酵母和擬南芥中分離鑒定出介導銨離子的銨轉運蛋白基因以來，越來越多學者投入到了銨轉運蛋白的研究工作中，目前已在水稻、番茄、百脈根、甘藍型油菜等多種植物中分離并鑒定了銨轉運蛋白。植物中的銨轉運蛋白家族可分為AMT1和AMT2兩類，它們在功能上相互補充或重疊[6-9]。研究表明，位于細胞膜上的銨轉運蛋白，首先通過根將土壤環(huán)境中的氨素進行吸收，再經過長距離運輸將NH4+輸送到整個植株體。而從全基因組角度全面進行玉米AMT基因的研究還沒有報道，其AMT基因的數(shù)目和功能還不清楚，有待進一步研究。

本研究對象是玉米自交系B73，其基因數(shù)據(jù)來源于玉米基因組測序網站（http：//www.maizegenome.org/data_portal.html）。先通過生物信息技術方法對其AMT基因的組成進行預測，再對其在染色體上的位置、表達情況、外顯子、內含子的差異及保守基序和系統(tǒng)進化樹進行詳細的分析，為進一步分析玉米AMT基因的功能打下基礎，增加對玉米中氨素吸收機制的了解，為最終減少化肥的使用及降低農業(yè)污染提供一定的理論支撐。

1 AMT候選基因的確定及其蛋白信息

首先利用BioEdit軟件建立玉米全蛋白序列數(shù)據(jù)的本地數(shù)據(jù)庫；然后利用pfam數(shù)據(jù)庫(http：//pfam.janelia.org/search/sequence)中的隱馬爾可夫模型(HMM)將其與擬南芥AMT結構域的氨基酸序列進行BLAST序列比對，初步篩選出候選基因序列；再進行Pfam分析驗證其蛋白是否含有保守的AMT結構域，并去除不含有保守的AMT結構域的基因序列；最后利用ClustalW方法對候選AMT基因蛋白序列進行多序列比對，去掉候選基因中的重復序列，即得到預測的AMT基因。為確保預測結果準確性，本實驗對每個蛋白基因的ORF序列在NCBI網站進行BLAST搜索及本地同源性分析，去除部分不可靠序列，預測出候選AMT基因，最終得到8個含有AMT結構的基因，各基因的位置將其分別命名為ZmAMT-1，ZmAMT-2，ZmAMT-3，ZmAMT-4，ZmAMT-5，ZmAMT-6，ZmAMT-7，ZmAMT-8。從獲得的8個銨轉運蛋白信息知，玉米自交系B73銨轉運蛋白的氨基酸殘基數(shù)目為460～500，等電點（PI）介于6.50～8.20，大多數(shù)接近中性或偏堿性。具體如表1所示。

表1 玉米AMT基因及蛋白信息

2 玉米AMT基因的染色體定位

將玉米AMT基因序列分別與基因組DNA數(shù)據(jù)進行比對，得到基因在染色體上的定位信息，再將其分布繪制成圖（圖1）。從圖1上可以看出玉米AMT基因不是均勻地分布在染色體上，其中1，2，6，8，10號染色體上各有1個AMT基因，且大多分布在染色體末端；5號染色體上含有3個AMT基因，其分布是最多的。

圖1 玉米AMT基因染色體物理位置定位

3 玉米AMT基因外顯子、內含子差異對比分析

將玉米的候選AMT基因序列導入Geneious軟件，用ClustalW軟件分別與各自所在的染色體全部基因進行比對，然后將比對結果的圖形經過處理整合到一起，得到玉米AMT基因外顯子、內含子差異對比分析圖（圖2）。從圖2上可以看出ZmAMT-1和ZmAMT-6含有2個內含子及3個外顯子，ZmAMT-3，ZmAMT-4和ZmAMT-7只含有1個內含子及2個外顯子，其位置和大小各不相同；而ZmAMT-2，ZmAMT-5和ZmAMT-8只有1個外顯子，不含有內含子，在轉錄過程中不會發(fā)生內含子的剪切，相對于有內含子的基因來說，能夠更快地進入翻譯階段，此特殊結構可能和玉米在逆境中吸收氨有關系。

圖2 玉米AMT基因外顯子、內含子差異對比

4 AMT基因氨基酸序列比對和保守基序motif分析

將玉米AMT基因的氨基酸序列導入Geneious軟件，對其蛋白的等電點(PI)、分子量(MW)以及氨基酸的數(shù)目(aa)進行分析。結果表明，ZmAMT-1，ZmAMT-3，ZmAMT-4，ZmAMT-6 和ZmAMT-7的氨基酸序列較為相近，而ZmAMT-2，ZmAMT-5和ZmAMT-8的氨基酸序列具有相似的保守基序的種類和數(shù)目。利用相關軟件對玉米AMT基因的氨基酸序列進行比對和保守motif的分析（圖3），其共同存在的motif序列見表2。其中motif1，2，3，4，5，8出現(xiàn)在所有的AMT序列中，motif10，11，13，14，17，18，19只出現(xiàn)在ZmAMT-2，ZmAMT-5和ZmAMT-8中，motif6，7，9，12只出現(xiàn)在 ZmAMT-1，ZmAMT-3，ZmAMT-4，ZmAMT-6和ZmAMT-7中，而motif15，16，20比較特別，分布沒有規(guī)律；可知不同類型的AMT基因在motif數(shù)目和種類是有所區(qū)別的，初步推斷ZmAMT-2，ZmAMT-5和 ZmAMT-8及 ZmAMT-1，ZmAMT-3，ZmAMT-4，ZmAMT-6和ZmAMT-7兩組成員幾乎含有相同的保守基序，其位置分布也較為保守。

圖3 玉米AMT基因保守性基序的motif分析

表2 共有的保守基序序列

5 玉米AMT類型基因系統(tǒng)進化樹的構建

決定基因功能特點的重要因素之一是基因在染色體上的分布，對構建的玉米自交系B73中AMT基因的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）及玉米自交系B73與其他模式生物中AMT基因的系統(tǒng)進化樹（圖5）進行分析可知，玉米的8個AMT基因主要分布在兩個分支上，其中ZmAMT-2，ZmAMT-5和ZmAMT-8分布在同一分支上，此分支上包含有其他物種AMT1亞家族基因，說明這3種基因可以歸為AMT1亞家族，水稻的12個AMT基因中也僅有3個屬于AMT亞家族；而ZmAMT-1，ZmAMT-3，ZmAMT-4，ZmAMT-6和ZmAMT-7分布在同一支上，此分支上包含有其他物種的AMT2亞家族基因，說明這5種基因可以劃分為AMT2亞家族。根據(jù)結構決定功能論的理論，可以推測出8個玉米AMT蛋白在氨的吸收和轉運中分別發(fā)揮不同的功能[10-12]。同為禾本科的水稻和玉米與小麥具有較近的進化距離，它們的同源性較高，但玉米與雙子葉植物的序列一致性略低。

圖4 玉米自交系B73中AMT基因的系統(tǒng)進化樹

圖5 玉米自交系B73及其他模式生物中AMT基因的系統(tǒng)進化樹

6 玉米AMT基因電子表達分析

運用電子表達譜的方法對玉米AMT基因進行分析后可知，每個基因的表達部位都存在一定的差異，說明玉米中8個AMT基因之間存在著差別。只有ZmAMT-8基因在穗絲中有表達；只有ZmAMT-4在子房中表達；ZmAMT-4和ZmAMT-6在花蕊中表達；ZmAMT-4和ZmAMT-7在胚芽中表達；ZmAMT-1，ZmAMT-3，ZmAMT-6和ZmAMT-7都在花粉和胚乳中表達；而ZmAMT-2，ZmAMT-4，ZmAMT-6和ZmAMT-8在玉米的根中表達，說明這4個基因在根對銨離子吸收中可能發(fā)揮著重要的作用；所有AMT基因都在葉子中表達。研究表明，AtAMT1.1特異性表達在根、莖、葉和芽中,AtAMT1.2主要在根中表達，微弱的表達在莖和葉中，而AtAMT1.3只在根中表達；OsAMT5均表現(xiàn)為葉特異性表達，在植株體內的功能主要是參與NH4+在器官和組織中的循環(huán)和轉運。這些特異性表達的銨轉運蛋白基因的存在說明植物的銨轉運過程是一個嚴格控制的過程，銨轉運蛋白除了在養(yǎng)分吸收中起重要作用外，可能還在根生長所需的營養(yǎng)轉運中起作用[13-15]。后期需要對玉米這4個基因的功能進一步分析，研究結果將有助于了解根中銨離子吸收及轉移機制。

7 結束語

在實驗過程中主要采用了兩種方法對不同的數(shù)據(jù)庫進行了搜索，但結果都得到8個預測的AMT基因，說明在對某類基因家族進行確定時，既可以通過其結構域氨基酸序列對該物種的蛋白數(shù)據(jù)庫進行搜尋，也可以通過其他物種AMT基因ORF序列進行該物種的全基因組數(shù)據(jù)庫的搜尋。本文結果是通過生物信息學的方法進行預測得到的，其真實性還需要后續(xù)實驗驗證。隨著研究的深入和更多的植物全基因組測序工作的完成，通過全基因組數(shù)據(jù)進行基因家族分析也成為可能。文中在玉米最新的基因組數(shù)據(jù)的基礎上進行了AMT基因家族的分析，對該基因家族的組成、特點和親緣關系進行了深入的探討，為進一步對玉米的AMT基因功能的分析提供了資料，并增加了對玉米生長過程中氨吸收機制的了解，生產過程中合理使用化肥，為降低農業(yè)面源污染方面做一些有意義的探索。

參考文獻：

[1]崔鍵,馬友華,趙艷萍,等.農業(yè)面源污染的特性及防治對策[J].中國農學通報,2006,22(1)：335-340.

[2]鄧若磊,谷俊濤,路文靜,等.水稻銨轉運蛋白基因OsAMT1;4和OsAMT5的特征分析、功能和表達[J].中國農業(yè)科學,2007,40(11)：2395-2402.

[3]駱媛媛,柳參奎.植物中銨轉運蛋白的研究進展[J].基因組學與應用生物學,2009,28(2)：373-379.

[4]叢郁,楊順瑛,宋志忠,等.杜梨銨轉運蛋白基因的克隆表達及在梨屬植物中的SNP分析[J].西北植物學報,2011,31(10)：1942-1950.

[5]YUAN L,GRAFF L,LOQUE D,et al.AtAMT1;4,a pollen-specific high-affinity ammonium transporter of the plasma membrane in Arabidopsis[J].Plant and Cell Physiology,2009,50(1)：13-25.

[6]SUENAGAA,MORIYA K,SONODA Y,et al.Constitutive expression of a novel-type ammonium transporter OsAMT2 in rice plants[J].Plant and Cell Physiology,2003,44(2)：206-211.

[7]COUTURIER J,MONTANINI B,MARTIN F,et al.The expanded family of ammonium transporters in the perennial poplar plant[J].New Phytologist,2007,174(1)：137-150.

[8]李磊,羅杰,李紅,等.毛果楊全基因組銨轉運蛋白家族成員及其序列分析[J].西北農林科技大學學報(自然科學版),2011,39(2)：133-142.

[9]SCHNABLE P S,WARE D,FULTON R S,et al.The B73 maize genome：complexity,diversity,and dynamics[J].Science,2009,326(5956)：1112-1115.

[10]LIN Y X,JIANG H Y,CHU Z X,et al.Genome-wide identification,classification and analysis of heat shock transcription factor family in maize[J].BMC Genomics,2011,12：76.

[11]李園枚,傅明輝,蔣麗花.植物銨轉運蛋白研究進展[J].廣東農業(yè)科學,2012,19：142-145.

[12]李靜,張冰玉,蘇曉華,等.植物中的銨根及硝酸根轉運蛋白研究進展[J].南京林業(yè)大學學報,2012,36(4)：133-139.

[13]馬清,管超,夏曾潤,等.高等植物氮素轉運蛋白研究進展[J].蘭州大學學報(自然科學版),2015,51(2)：217-227.

[14]WANG YY,HSU P K,TSAYY F.Uptake allocation and sigaaling of nitrate[J].Trends in Plant Science,2012,17(8)：458-467.

[15]趙夢竹,馬金珠.干旱區(qū)不同類型土壤中硝酸鹽的分布特征及來源分析[J].蘭州大學學報(自然科學版),2014,50(3)：424-430.