分散固相萃取凈化/高效液相色譜法測定嬰幼兒奶粉與米粉中15種多環(huán)芳烴

汪晨霞，張瑞瑞，尋知慶，郭新東，黃金鳳，江藍(lán)藍(lán)

(廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，廣東 廣州 511447)

隨著人們對環(huán)境和食品安全的重視，有關(guān)PAHs的研究報(bào)道越來越多。前處理方法涉及索氏提取法[6]、超聲萃取法[7]、微波萃取法[8]等；測定方法包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9]、高效液相色譜-紫外檢測法[10]和熒光檢測法[11]等。嬰幼兒食品基質(zhì)較為復(fù)雜，并且測定的PAHs組分多、限量低，需要建立提取凈化效果好、檢測靈敏度高的檢測方法。目前已有少量使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定奶粉或米粉的研究[3,12]?；诙喹h(huán)芳烴含有大共軛體系的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，本文針對被EPA列為優(yōu)先控制污染物的16種PAHs，選用分析靈敏度高的高效液相色譜-熒光檢測法，測定了嬰幼兒奶粉和米粉中PAHs的殘留量。由于苊烯的熒光強(qiáng)度低，不適合采用熒光檢測法檢測，因此對其余15種PAHs進(jìn)行了定性定量分析。檢測方法可滿足限量要求，從而為嬰幼兒食品中多環(huán)芳烴殘留量的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測[13-14]提供了一定的參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(Waters 2695，配2489熒光檢測器)(美國Waters公司)；TurboVap LV氮吹儀(美國Caliper公司)；KQ-250DV數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；ZONKIA KDC-1044離心機(jī)(安徽中科中佳公司)；Milli-Q超純水器(美國Millipore公司)；JYL-C91T粉碎機(jī)(九陽公司)；MS3渦旋儀(德國IKA公司)。

試驗(yàn)樣品：隨機(jī)購買不同品牌的本地市售嬰幼兒奶粉和米粉各10個(gè)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)中間液(1 000 μg/L)：吸取多環(huán)芳烴混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.25 mL，用乙腈定容至50 mL。

多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取一定量的多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)中間液用乙腈定容，得到質(zhì)量濃度為1.0、2.0、5.0、10、20、50 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。所有標(biāo)準(zhǔn)溶液均保存于4 ℃條件下。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1樣品制備奶粉樣品：取200 g 樣品分裝于密封袋中混合搖勻，室溫保存。

米粉樣品：取200 g樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎混勻，分裝于密封袋中室溫保存。

1.3.2樣品提取奶粉樣品：稱取1.0 g(精確至0.001 g)樣品加至50 mL離心管中，加5 mL超純水溶解樣品，渦旋均勻，再加入各為0.2 mL的亞鐵氰化鉀(150 g/L)和乙酸鋅(300 g/L)沉淀蛋白，依次加入2 g NaCl、5 mL乙腈渦旋30 s，超聲提取30 min，3 800 r/min離心2 min，取上清液至離心管中；下層殘?jiān)儆靡译娉?0 min提取2次，合并全部上清液。

米粉樣品：稱取1.0 g(精確至0.001 g)樣品加至50 mL離心管中，加50 mg淀粉酶和5 mL溫水，渦旋均勻，依次加2 g NaCl和5 mL乙腈渦旋30 s，超聲提取30 min，3 800 r/min離心2 min，取上清液至離心管中；下層殘?jiān)儆靡译娉?0 min提取2次，合并全部上清液。

1.3.3樣品凈化在上清液中加入200 mg PSA，渦旋1 min，3 800 r/min離心2 min，取全部上清液至氮吹管中，氮吹至近干，用乙腈定容至1 mL，渦旋混勻，過0.22 μm有機(jī)系濾膜待測。

1.4 檢測條件

色譜柱：Waters PAH C18液相色譜柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量為20 μL；流速1.0 mL/min；流動相：A為乙腈，B為超純水，梯度洗脫程序：0～3 min，50%A；3～20 min，50%～100%A；20～25 min，100%A；25～27 min，100%～50%A；27～30 min，50%A。

熒光檢測器：參考文獻(xiàn)[15-16]中一些PAHs的最佳激發(fā)及發(fā)射波長，結(jié)合不同PAHs保留時(shí)間的差異，得到熒光檢測程序見表1。

表1 熒光檢測程序Table 1 Fluorescence detection program

圖1 15種多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)溶液(20 μg/L)的色譜圖Fig.1 Chromatogram of 15 PAHs standard(20 μg/L)1.NAP；2.ACP；3.FLU；4.PHE；5.ANT；6.FLT；7.PYR；8.BaA；9.CHR；10.BbF；11.BkF；12.BaP；13.DBA；14.BPE；15.IPY

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測條件的優(yōu)化

15種多環(huán)芳烴目標(biāo)物在短時(shí)間內(nèi)用液相色譜分離的難度較大，因此選用多環(huán)芳烴專用色譜柱以及梯度洗脫來達(dá)到更好的分離效果。通過對柱溫、流速、洗脫條件和熒光檢測程序的優(yōu)化，得到了最佳的色譜分離及檢測條件。此條件下30 min內(nèi)所有目標(biāo)物全部出峰，峰形對稱、分離效果好，均能滿足定性定量的分析要求，標(biāo)準(zhǔn)譜圖見圖1。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)化

2.2.1樣品提取方式奶粉及米粉樣品基質(zhì)較為復(fù)雜，考慮到多環(huán)芳烴為親脂類化合物，而皂化反應(yīng)可以減少脂類物質(zhì)帶來的干擾，因此本實(shí)驗(yàn)比較了溶劑直接提取及經(jīng)50% KOH-甲醇皂化加熱反應(yīng)后再用溶劑提取兩種前處理方式的效果。結(jié)果顯示，溶劑直接提取的回收率優(yōu)于皂化反應(yīng)后再提取的方式。并且雖然皂化反應(yīng)后樣品處理較為完全，但在反應(yīng)過程中引入了較多的雜質(zhì)會對目標(biāo)物的定性定量分析造成干擾。綜上所述，溶劑直接提取方式處理時(shí)間短、雜質(zhì)干擾少，因此采用該方法對樣品進(jìn)行提取。

圖2 不同提取溶劑的回收率對比Fig.2 Recoveries comparison of different extraction solvents the PAHs numbers denoted were the same as those in Fig.1

2.2.2樣品提取溶劑待測目標(biāo)物數(shù)量較多，綜合考慮PAHs的性質(zhì)，選用正己烷、甲苯、乙腈3種低、中低、中高極性溶劑進(jìn)行篩選。結(jié)果如圖2所示，采用正己烷和甲苯提取，不同目標(biāo)物的回收率差異較大(在12.8%～90.6%之間)，而乙腈極性中等偏大，能夠很好兼顧多個(gè)目標(biāo)物的性質(zhì)，待測物質(zhì)的提取回收率均達(dá)80%以上，能夠滿足檢測要求，因此選擇乙腈為提取溶劑。

圖3 凈化前后加標(biāo)奶粉樣品的色譜圖(10 μg/L)Fig.3 Chromatograms of spiked sample before and after PSA purification(10 μg/L) the peak numbers denoted were the same as those in Fig.1

2.2.3樣品凈化方法為減少基質(zhì)效應(yīng)的影響，采用固相萃取材料對提取液進(jìn)一步凈化。分別選取分散固相萃取材料PSA、Florisil及HLB固相萃取柱進(jìn)行凈化，通過比較發(fā)現(xiàn)：HLB柱的回收率均不高于50%，F(xiàn)lorisil柱凈化后有5種PAHs的回收率低于40%，PSA分散固相萃取后所有目標(biāo)物的回收率均大于80%。圖3為加標(biāo)奶粉樣品使用PSA凈化前后的色譜圖，凈化前13號化合物二苯并[a,h]蒽與某雜質(zhì)的分離不完全，凈化后該雜質(zhì)大部分被除去。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PSA凈化效果明顯，操作簡單、回收率高，因此選擇PSA分散固相萃取進(jìn)行凈化。

2.3 線性范圍及檢出限

采用保留時(shí)間定性，峰面積外標(biāo)法進(jìn)行定量。在最佳檢測條件下，分別測定1.0～50 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)工作液的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，以被測目標(biāo)物的峰面積(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得到15種多環(huán)芳烴的線性回歸方程，見表2。結(jié)果表明，15種多環(huán)芳烴在所測濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.995。

根據(jù)1.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液計(jì)算所得的信噪比(S/N)，結(jié)合前處理過程，計(jì)算得到該方法各目標(biāo)物的檢出限(LODs，S/N=3)為0.05～0.3 μg/kg(表2)，能夠滿足日常檢測要求。

表2 15種多環(huán)芳烴的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限Table 2 Linear equations，linear ranges，correlation coefficients and LODs of 15 PAHs

2.4 方法精密度及回收率

按最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件，選取陰性奶粉和米粉樣品進(jìn)行加標(biāo)回收，考察方法的回收率及精密度。分別添加1.0、2.0、10 μg/kg 3個(gè)水平，每個(gè)水平平行測定6次，計(jì)算回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)?；厥章蕿?6.5%～106.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.7%～7.5%，結(jié)果如表3所示，方法的回收率和精密度均能達(dá)到檢測要求。

2.5 實(shí)際樣品的測定

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下測定了市售20種不同品牌的嬰幼兒奶粉和米粉。結(jié)果顯示，15種多環(huán)芳烴的檢測結(jié)果均小于檢出限。

表3 15種多環(huán)芳烴的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Spiked recoveries and RSDs of 15 PAHs(n=6)

3 結(jié) 論

本文采用高效液相色譜-熒光檢測法建立了同時(shí)測定嬰幼兒奶粉及米粉中作為優(yōu)先控制污染物的15種多環(huán)芳烴的分析方法，并優(yōu)化了檢測條件、提取方法以及凈化方式。方法學(xué)技術(shù)指標(biāo)考察結(jié)果表明，本方法的選擇性好、線性范圍寬、精密度高、回收效果好、檢出限低，各項(xiàng)指標(biāo)均能滿足日常檢測分析要求，適用于嬰幼兒食品中食品污染物多環(huán)芳烴的測定，有利于嬰幼兒食品安全日常風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測工作的開展。

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