光譜法聯(lián)合分子對(duì)接研究人血清白蛋白與新的抗腫瘤活性小分子的體外結(jié)合

劉 舉，宮 雪，徐 亮*，張 力，宮 平

(1.遼寧大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036;2.遼寧大學(xué) 生命科學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036;3.沈陽(yáng)藥科大學(xué) 基于靶點(diǎn)的藥物設(shè)計(jì)與研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 110016)

人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是一種人體血漿內(nèi)十分重要的、含量最為豐富的蛋白質(zhì)，約占血清總蛋白的60%。HSA可與許多內(nèi)源性和外源性物質(zhì)(如氨基酸、膽紅素、代謝物、脂肪酸、金屬離子、藥物等) 結(jié)合，具有存儲(chǔ)和轉(zhuǎn)運(yùn)的重要功能[1]。因此，HSA通常被用作研究生物活性物質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的模型蛋白。HSA的三維晶體結(jié)構(gòu)由585個(gè)氨基酸殘基組成，包含3條同源的α-螺旋結(jié)構(gòu)域：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。每條結(jié)構(gòu)域各自均包含A和B兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域，例如ⅡA或者ⅡB。每個(gè)主結(jié)構(gòu)域中的兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域均以槽口相對(duì)的方式形成圓筒狀結(jié)構(gòu)。幾乎所有疏水性氨基酸均包埋在圓筒腔內(nèi)部，形成疏水腔[2]。Sudlow等[3]研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)藥物在HSA上主要有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)：SiteⅠ和SiteⅡ，分別位于亞結(jié)構(gòu)域ⅡA 和ⅢA的疏水腔內(nèi)。

圖1 LJC-116的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of LJC-116

LJC-116(如圖1)是對(duì)Type Ⅱ類小分子c-Met激酶抑制劑的4-苯氧基喹啉這一基本母核進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，運(yùn)用拼合原理、電子等排原理，將具有抗腫瘤作用的藥效團(tuán)引入母核中，從而設(shè)計(jì)成的具有全新結(jié)構(gòu)的4-苯氧基喹啉類Type Ⅱ型小分子c-Met激酶抑制劑。該化合物以3-甲氧基4-羥基苯乙酮為原料經(jīng)14步反應(yīng)合成制得，分子式為：C34H35F2N7O5，分子量：659.27。體外抗腫瘤活性測(cè)試表明該化合物具有較好的抗腫瘤活性，該化合物對(duì)HT-29、H460、A549、MKN-45的抗增殖活性均與N-[3-氟-4-[[6-甲氧基-7-[[3-(嗎啉-4-基)丙基]氧]喹啉-4-基]氧]苯基]-N′-(4-氟苯基)環(huán)丙烷-1,1-二甲酰胺(Foretinib)相當(dāng)，其IC50值分別為0.080、0.14、0.11、0.030 μmol/L[4]。

目前，作為全新合成的具有抗腫瘤活性的小分子c-Met激酶抑制劑，LJC-116與HSA相互作用的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本文考察了在模擬生理?xiàng)l件下，LJC -116與HSA的體外結(jié)合性質(zhì)。利用熒光探針競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)研究了LJC-116與HSA的結(jié)合部位。采用熒光光譜法以及結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)性質(zhì)計(jì)算了結(jié)合作用的驅(qū)動(dòng)力。通過(guò)雙對(duì)數(shù)方程計(jì)算了兩者之間的結(jié)合常數(shù)，利用熒光光譜、紫外光譜法結(jié)合F?rster偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移理論方程計(jì)算了兩者之間的能量轉(zhuǎn)移效率以及結(jié)合距離。本研究有望為小分子c-Met激酶抑制劑類藥物的體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)情況研究提供一定的有用信息，同時(shí)也有助于了解藥物對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

LJC-116[4]合成提純后直接用于本研究。HSA(美國(guó)Sigma公司);氯化鈉(NaCl)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;布洛芬(Ibuprofen)、華法林(Warfarlin)購(gòu)自安耐吉化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

UV-2550型紫外-可見(jiàn)分光光譜儀(日本島津公司);F-7000型熒光光譜儀(日本日立公司);AL204型分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);微量進(jìn)樣器(上海安亭微量進(jìn)樣器廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1溶液配制及光譜測(cè)定方法HSA儲(chǔ)備液用Tris-HCl-NaCl(pH 7.4)緩沖溶液溶解后放置于冰箱冷藏保存；LJC-116與布洛芬、華法林儲(chǔ)備液的配制均先將相應(yīng)藥品溶于少量乙醇后，再用Tris-HCl-NaCl緩沖溶液稀釋至適當(dāng)濃度。

288、299、310 K 3個(gè)溫度下熒光光譜測(cè)定、熒光的內(nèi)濾光效應(yīng)校正、288 K下紫外光譜測(cè)定以及288 K下熒光探針實(shí)驗(yàn)見(jiàn)文獻(xiàn)[5-8]。

1.2.2分子對(duì)接研究使用分子對(duì)接軟件AutoDock 4.2.5.1和AutoDock Tools 1.5.6研究LJC-116和HSA之間的相互作用。分子對(duì)接需要LJC-116和HSA的三維結(jié)構(gòu)。對(duì)于LJC-116，首先使用ChemDraw繪制出其二維結(jié)構(gòu)，然后使用Chem 3D生成三維結(jié)構(gòu)。HSA蛋白的三維結(jié)構(gòu)下載于PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/pdb)，其PDB ID為1AO6，然后使用Pymol 1.8.2.0將三維結(jié)構(gòu)中所有水分子去除，并添加極性氫原子。在分子對(duì)接前，使用AutoDock Tools 1.5.6為L(zhǎng)JC-116和HSA添加Gasteiger電荷，合并非極性氫，并將原子轉(zhuǎn)換為AutoDock類型。分子對(duì)接時(shí)的盒子中心坐標(biāo)為33.175，30.604，34.136，盒子大小為70×70×70格點(diǎn)，其中格點(diǎn)間距離為0.375 ?。對(duì)接過(guò)程中能量?jī)?yōu)化采用拉馬克遺傳算法，評(píng)價(jià)函數(shù)使用半經(jīng)驗(yàn)自由能評(píng)價(jià)函數(shù)，遺傳算法最大搜索步數(shù)和最大代數(shù)分別設(shè)為25 000 000和27 000，其余參數(shù)均為默認(rèn)值。對(duì)接共產(chǎn)生100個(gè)LJC-116與HSA的結(jié)合構(gòu)象，根據(jù)構(gòu)象的聚類與結(jié)合能分布情況選擇合適的結(jié)合構(gòu)象進(jìn)行分析。本研究使用了PyMOL 1.8.2.0和Ligplot+1.4.5[9]對(duì)結(jié)合構(gòu)象進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 LJC-116濃度對(duì)HSA紫外光譜的影響

圖2 不同濃度LJC-116存在下HSA的紫外吸收光譜Fig.2 UV-Vis absorption spectra of HSA in different concentrations of LJC-116[LJC-116](a-e) ：0.5,1.0,1.5,2.0,2.5(×10-5 mol/L); [LJC-116](f-k) ：0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5(×10-5 mol/L)，[HSA](f-k) ：5.0×10-6 mol/L；T=288 K

LJC-116濃度對(duì)HSA紫外光譜的影響見(jiàn)圖2。從圖2可以看出，HSA在280 nm處有最大吸收峰，而LJC-116 的吸收峰位于295 nm和320 nm，兩者的吸收光譜部分重疊。加入LJC-116 后，隨著LJC-116 濃度的增加，HSA 在280 nm處的吸收峰位略有紅移。說(shuō)明LJC-116 使包埋在HSA 分子內(nèi)部的色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)殘基部分裸露于水相，同時(shí)疏水基團(tuán)之間的疏水作用增強(qiáng)，引起電子軌道躍遷能量減小，造成HSA的紫外吸收光譜圖表現(xiàn)出吸收峰紅移。在320 nm處，對(duì)比加入LJC-116后的HSA吸光度值與兩者單純吸光度值之和發(fā)現(xiàn)：AHSA+ALJC-116

圖3 LJC-116與HSA相互作用的熒光光譜圖Fig.3 Fluorescence spectra of HSA+LJC-116 solutions LJC-116 concentration(a-f)：0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5×10-5 mol/L；[HSA]=5.0×10-6 mol/L,T=299 K

2.2 熒光光譜討論

2.2.1LJC-116對(duì)HSA猝滅方式的確定HSA的內(nèi)源熒光主要來(lái)自Trp和Tyr，圖3為HSA在不同濃度LJC-116存在下的熒光發(fā)射光譜。 隨著LJC-116濃度的增加，HSA的內(nèi)源熒光(280 nm激發(fā))呈規(guī)律性降低，同時(shí)峰位稍有紅移(0.3 nm)，表明HSA與LJC-116發(fā)生了作用，氨基酸殘基所處微環(huán)境極性增加。

HSA溶液的熒光發(fā)射峰位于348 nm處。 測(cè)定HSA在288、299、310 K 3個(gè)溫度下的熒光光譜數(shù)據(jù)，利用 Stern-Volmer(S-V)方程，計(jì)算了LJC-116+HSA體系的猝滅常數(shù)[7]。

F0/F=1+KSV[Q]=1+Kqτ0[Q]

(1)

各參數(shù)含義見(jiàn)文獻(xiàn)[10]。 根據(jù)式(1)以F0/F對(duì)[Q]作圖可得一條直線，如圖4A所示[6]。

由圖4A與表1可看出，S-V曲線均具有較好的線性關(guān)系(r2>0.99)，說(shuō)明兩者之間只發(fā)生一種猝滅。在288、299、310 K溫度下，由直線的斜率求得HSA+LJC-116體系的KSV分別為4.320×103、3.810×103、3.540×103L·mol-1。 在3個(gè)溫度下，HSA+LJC-116體系的Kq分別為:Kq=4.324×1011L/(mol·s)，r2=0.999 0(288 K);Kq=3.814×1011L/(mol·s)，r2=0.997 5(299 K);Kq=3.542×1011L/(mol·s)，r2=0.998 9(310 K)。3個(gè)溫度下的Kq值均大于2.0×1010L/(mol·s)，此外，S-V曲線的斜率隨溫度的升高而降低，表明LJC-116在實(shí)驗(yàn)濃度下對(duì)HSA的熒光猝滅效應(yīng)不是動(dòng)態(tài)猝滅，而是通過(guò)復(fù)合物形成[7]。 因此，LJC-116與HSA的猝滅類型是靜態(tài)猝滅。 此結(jié)果與紫外可見(jiàn)光譜判斷的猝滅類型一致[11]。

表1 3個(gè)溫度下HSA+LJC-116體系的KSV、Kq、KA、n、ΔG0、ΔH0和ΔS0Table 1 Quenching constants(KSV and Kq),stability constants(KA)，binding site numbers(n) and thermodynamic parameters calculated according to Stern-Volmer plots and double logarithm plots of HSA+LJC-116 system at three temperatures

2.2.2LJC-116與HSA的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)當(dāng)小分子獨(dú)立結(jié)合在高分子的1組位點(diǎn)時(shí),可用雙對(duì)數(shù)方程來(lái)確定結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)[15]。

lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlg[Q]

(2)

式中,KA為L(zhǎng)JC-116與HSA的結(jié)合常數(shù)，n為L(zhǎng)JC-116與HSA之間的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，[Q]是游離體系中LJC-116的濃度，但由于其濃度未知，因此計(jì)算中以猝滅劑LJC-116的濃度代替。 將lg [(F0-F)/F]對(duì)lg [Q]作圖(圖4B)，所得直線斜率為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，截距的負(fù)對(duì)數(shù)值為結(jié)合常數(shù)。 因此從表1可得，在288 K時(shí)，HSA+LJC-116體系中KA=4.629×104L/mol，n=1.006 4，在299 K時(shí)，KA=4.172×104L/mol，n=1.008 2，在310 K時(shí)KA=3.808×104L/mol，n=1.006 55。 這表明，LJC-116與HSA之間相互作用的結(jié)合常數(shù)大小順序?yàn)椋篐SA+LJC-116(310 K)

2.2.3LJC-116與HSA的作用力類型LJC-116與HSA之間作用類型的判斷對(duì)藥物設(shè)計(jì)有著重要的指導(dǎo)作用?；诓煌瑴囟认碌腒A，結(jié)合以下熱力學(xué)公式，可求出結(jié)合反應(yīng)過(guò)程中的焓變(ΔH)、熵變(ΔS) 和自由能變(ΔG)。

ΔG=-RTlnKA

(3)

lnKA=-ΔH/(RT)+ΔS/R

(4)

ΔG=ΔH-TΔS

(5)

由表1可知，在3種不同溫度下，ΔG0均為負(fù)值，表明結(jié)合過(guò)程是自發(fā)的。 ΔS(66.45)>0，且 ΔH(-65.82)<0。 根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)的正負(fù)性與結(jié)合作用力的關(guān)系，可判定LJC-116與HSA的結(jié)合為疏水作用和氫鍵共同作用所致[15]。 LJC-116的分子結(jié)構(gòu)中包含2個(gè)疏水的苯環(huán)以及含N原子的1個(gè)喹啉環(huán)、1個(gè)哌嗪環(huán)以及三氮唑。苯環(huán)與HSA的疏水基團(tuán)易形成疏水作用，而含雜原子的哌嗪環(huán)和三氮唑與HSA易形成氫鍵作用。其中雜原子N又是氫鍵的良好受體，易與HSA形成氫鍵。

圖5 HSA的熒光光譜與LJC-116紫外吸收光譜的重疊Fig.5 Spectral overlap of fluorescence of HSA solution and absorption of LJC-116 solution [HSA]=[LJC-116]=5.0×10-6 mol/L；T=288 K

2.2.4LJC-116與HSA的結(jié)合距離LJC-116與HSA的Trp殘基之間的結(jié)合距離(r)采用能量轉(zhuǎn)移效率(E)來(lái)評(píng)價(jià)。根據(jù)F?rster偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移理論方程，E由式(6)描述[20]：

E=1/[1+(r/R0)6]

(6)

式中，r是供體(HSA)和受體(LJC-116)之間的結(jié)合距離，R0是能量轉(zhuǎn)換率為50%時(shí)的結(jié)合距離，可通過(guò)式(7)計(jì)算[20]：

(7)

式中，K2是偶極子的空間取向因子，n是介質(zhì)的折射率，J是供體(HSA)的發(fā)射光譜和受體(LJC-116)吸收光譜的重疊積分，φD是供體(HSA)在缺少受體(LJC-116)下的量子產(chǎn)率。在此情況下，HSA分子中K2、n、φD分別為2/3、1.336和0.118[14]。 也可通過(guò)式(8)計(jì)算J[17]：

J=∑f(λ)ε(λ)λ4δλ/σf(λ)δλ

(8)

其中，ε(λ)是LJC-116在波長(zhǎng)λ處的摩爾吸光系數(shù)，f(λ)是HSA在波長(zhǎng)λ處的熒光強(qiáng)度。通過(guò)上式，R0和r可進(jìn)一步被計(jì)算。圖5展現(xiàn)了HSA溶液熒光發(fā)射光譜和LJC-116紫外-可見(jiàn)吸收光譜的重疊。此外，能量傳遞的效率(E)也可由方程(9)確定：

E=1-F/F0

(9)

根據(jù)公式(6)～(9)，在299 K下，計(jì)算得R0=1.28 nm，r=1.69 nm，E=15.6%，J=7.1697×10-15cm3·L/mol。0.5R0

2.2.5分子探針確定HSA與LJC-116的結(jié)合位置為確定LJC-116在HSA上的結(jié)合位點(diǎn)，分別以華法林和布洛芬作為SiteⅠ和SiteⅡ的熒光探針試劑，考察對(duì)HSA+LJC-116體系熒光光譜的影響。固定LJC-116與HSA的摩爾比為1∶1，使熒光探針的非特異性結(jié)合達(dá)到最小[19]。逐漸加入探針試劑，LJC-116被熒光探針取代的百分比按F2/F1×100%計(jì)算[20](F1和F2分別為HSA+LJC-116體系加入探針試劑前后的熒光強(qiáng)度)，以F2/F1對(duì)探針試劑和HSA的濃度比作圖。結(jié)果表明，隨著布洛芬的濃度增加，HSA+LJC-116體系的熒光強(qiáng)度變化不大，說(shuō)明HSA與布洛芬的作用位點(diǎn)不同。而加入的華法林使HSA+LJC-116體系的熒光強(qiáng)度明顯降低，華法林可將LJC-116從HSA+LJC-116中置換出來(lái)，說(shuō)明LJC-116在HSA上的作用位點(diǎn)與華法林一致，均為SiteⅠ。

2.3 HSA與LJC-116結(jié)合后構(gòu)象的變化

2.3.1同步熒光光譜的研究本研究中，設(shè)置Δλ分別等于15、60 nm，得到分別顯示Tyr和Trp殘基特性的同步熒光光譜如圖6所示。

由圖6可知，隨著LJC-116濃度的增加，Tyr和Trp殘基的同步熒光強(qiáng)度均逐漸降低。LJC-116的加入使熒光發(fā)生猝滅，說(shuō)明LJC-116與蛋白存在相互作用。未觀察到Tyr最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生藍(lán)移或紅移，但Trp的最大發(fā)射波長(zhǎng)紅移了0.4 nm，說(shuō)明HSA中的Trp殘基對(duì)LJC-116更敏感，HSA與LJC-116的相互作用使Trp殘基所處的疏水環(huán)境極性增加，肽鏈的伸展程度有所增加，進(jìn)而引起HSA構(gòu)象發(fā)生變化[21]。在同步熒光光譜中得到的Trp紅移結(jié)果與靜態(tài)熒光光譜的紅移結(jié)果一致。

2.3.2三維熒光光譜的研究為進(jìn)一步分析LJC-116與HSA結(jié)合后HSA構(gòu)象的變化，分別測(cè)定了HSA和HSA+LJC-116混合溶液的三維熒光光譜(見(jiàn)圖7)。

由表2計(jì)算可知，加入LJC-116 后，Peak 1的峰強(qiáng)下降了51.9%； Peak 2的峰強(qiáng)下降了74.5%，且斯托克斯位移從110 nm增至120 nm，表明氨基酸殘基的微環(huán)境極性增加，疏水性減弱[22]。 此結(jié)果驗(yàn)證了同步熒光光譜以及靜態(tài)熒光光譜的紅移結(jié)果。值得注意的是，加入LJC-116后的HSA瑞利散射峰明顯增強(qiáng)，說(shuō)明生成了新的尺寸更大的復(fù)合物，增大了瑞利散射峰的強(qiáng)度。

表2 單純HSA和HSA+LJC-116體系的三維熒光光譜特征參數(shù)Table 2 Three-dimensional fluorescence spectral characteristic parameters of free HSA and HSA+LJC-116 systems

2.4 分子對(duì)接研究

位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)顯示了LJC-116在HSA的結(jié)合部位為Site Ⅰ，為進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，使用分子對(duì)接技術(shù)在分子水平上模擬兩者之間的結(jié)合作用。通過(guò)研究100個(gè)對(duì)接構(gòu)象的聚類情況(閾值 2.0 ?)，發(fā)現(xiàn)能量最低的聚類包含的構(gòu)象數(shù)目最多，取這一聚類中結(jié)合能最低的構(gòu)象作為HSA+LJC-116的結(jié)合結(jié)構(gòu)，結(jié)合能為-10.44 kcal/mol。對(duì)接結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 HSA和HSA+LJC-116相互作用的分子對(duì)接圖Fig.8 Interaction model of LJC-116 at site Ⅰ of HSA with its hydrogen bodings and hydrophobic interactions

圖8所示的對(duì)接結(jié)果表明：藥物分子與HSA在site Ⅰ的疏水腔內(nèi)結(jié)合，且兩者之間存在較強(qiáng)的疏水作用力以及氫鍵作用。與LJC-116形成氫鍵的氨基酸殘基為L(zhǎng)ys199、Arg257、Ala291，與LJC-116產(chǎn)生疏水相互作用的氨基酸殘基很多(包括Tyr150、Glu153、Phe157、Glu188、Ala191、Ser192、Lys195、Trp214、Arg222、Leu238、Leu260、Ile264、Ser287、His288、Ile290、Glu292、Lys436、Asp451和Val455)。此對(duì)接結(jié)果與熱力學(xué)實(shí)驗(yàn)判斷的作用力結(jié)果相吻合。

3 結(jié) 論

本文采用熒光光譜法、紫外可見(jiàn)吸收光譜法、同步熒光光譜法、三維熒光光譜法以及分子對(duì)接技術(shù)全面研究了新合成的小分子c-Met激酶抑制劑LJC-116與HSA之間的相互作用。首先通過(guò)紫外光譜法和熒光光譜法考察兩者的作用機(jī)制為生成靜態(tài)復(fù)合物的靜態(tài)猝滅，并計(jì)算了結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。進(jìn)而根據(jù)反應(yīng)的熱力學(xué)常數(shù)得出結(jié)合的作用力為氫鍵和疏水作用。同時(shí)采用探針競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)獲得了LJC-116在HSA上的結(jié)合位點(diǎn)為SiteⅠ，且更接近于Tyr殘基。最后利用光譜法聯(lián)合F?rster偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移理論方程計(jì)算了兩者之間的結(jié)合距離。并采用同步熒光光譜法和三維熒光光譜法探討了HSA構(gòu)象的變化。本研究為小分子c-Met激酶抑制劑分子在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和傳輸提供了一定的信息，并進(jìn)一步闡明了人血清白蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。

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