嗜水氣單胞菌對(duì)黃鱔血清中四種>抗病相關(guān)酶活性的影響

張 釗，涂 嬌，秦 涵，張 偉，黃云南，張小雪

(貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院水產(chǎn)系，貴州 貴陽(yáng) 550025)

黃鱔(Monopterusalbus)俗稱鱔魚(yú)或田鰻，屬合鰓目(Synbranchiformes)，合鰓科(Synbranchidae)，黃鱔屬(Monopterus)，廣泛分布于亞洲地區(qū)。因肉嫩味鮮，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值甚高，且具有藥用價(jià)值，黃鱔養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)模在逐年擴(kuò)大，然而隨之而來(lái)的疾病爆發(fā)也越來(lái)越嚴(yán)重[1]。出血病是黃鱔養(yǎng)殖過(guò)程中最常爆發(fā)，危害最嚴(yán)重的疾病，該病發(fā)病速度快，死亡率高，傳染性強(qiáng)，為黃鱔養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]，對(duì)黃鱔養(yǎng)殖的健康發(fā)展構(gòu)成極大地威脅。嗜水氣單胞菌是黃鱔出血病的主要致病病原菌[3]，溶菌酶作為魚(yú)類非特異性免疫物質(zhì)之一，具有使細(xì)菌裂解的重要作用[4]；酸性磷酸酶是溶酶體的重要組成成分，且和肝功能密切相關(guān)[5]；堿性磷酸酶是機(jī)體代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶[6]，超氧化物歧化酶是機(jī)體內(nèi)重要的氧化自由基清除劑[7]。方晨等[8]對(duì)感染本實(shí)驗(yàn)室分離的嗜水氣單胞菌后黃鱔部分臟器酸性磷酸酶和堿性磷酸酶兩種酶的活性變化進(jìn)行了初步研究。由于不同來(lái)源的菌株對(duì)不同的魚(yú)類毒力有區(qū)別，因此本研究采用標(biāo)準(zhǔn)嗜水氣單胞菌菌株感染黃鱔，考察其對(duì)黃鱔血清中溶菌酶、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)等四種酶活性的影響，以期進(jìn)一步認(rèn)識(shí)嗜水氣單胞菌對(duì)黃鱔抗病功能的影響，進(jìn)而為闡明嗜水氣單胞菌對(duì)黃鱔的致病機(jī)理等提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與菌株

實(shí)驗(yàn)用60尾黃鱔(104.5±13.1)g采集于貴州貴陽(yáng)花溪地區(qū)池塘和田間，實(shí)驗(yàn)用嗜水氣單胞菌ATCC7966。

1.2 主要試劑

酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物公司。

1.3 方法

1.3.1感染菌液制備 制備LB固體培養(yǎng)基，將嗜水氣單胞菌ATCC7966涂抹在培養(yǎng)基上，復(fù)壯后轉(zhuǎn)移到LB液體培養(yǎng)基中，28℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h，用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定菌液濃度。稀釋菌液濃度至4×108cfu/ml備用。

1.3.2實(shí)驗(yàn)分組與處理 清洗消毒養(yǎng)殖水箱。將黃鱔隨機(jī)分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和對(duì)照組，每組15條，放入水箱用不含有嗜水氣單胞菌和氯的水適應(yīng)性飼養(yǎng)2天。對(duì)照組每尾注射0.2 ml生理鹽水。其余3個(gè)處理組，每尾黃鱔注射0.2 ml嗜水氣單胞菌菌液，其濃度分別為：處理組Ⅰ組1×108cfu/ml、處理組Ⅱ組2×108cfu/ml、處理組Ⅲ組4×108cfu/m；注射后用酒精棉球?qū)ψ⑸洳课贿M(jìn)行消毒，然后放入水箱中飼養(yǎng)，并加蓋防逃。

1.3.3取樣與酶活測(cè)定 分別在注射嗜水氣單胞菌后12 h、24 h和48 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)各組取血樣，每組隨機(jī)挑選5條，斷尾取血，收集血清，放入4℃冰箱過(guò)夜，第2天取出2500 r/min離心10 min，取上清液，用試劑盒測(cè)定血清中溶菌酶、AKP、ACP、總超氧化物歧化酶的酶活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用EXCEL和SPSS 15.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，P<0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜水氣單胞菌感染后黃鱔外觀變化

在感染嗜水氣單胞菌初期，黃鱔活動(dòng)正常，體表無(wú)明顯病變特征，解剖未發(fā)現(xiàn)臟器異常。感染24 h后，活動(dòng)緩慢，最高濃度組有死亡2條，黃鱔體表出現(xiàn)細(xì)小血點(diǎn)，解剖可見(jiàn)腹腔有腹水，臟器顏色變淺，個(gè)別有細(xì)小血斑。感染48 h后黃鱔活動(dòng)無(wú)力或死亡，體表粘液增多，并布有血斑，肛門(mén)紅腫，擠壓腹部有大量腹水溢出；解剖可見(jiàn)臟器充血腫脹，且有質(zhì)地變脆腐爛現(xiàn)象。

2.2 嗜水氣單胞菌感染對(duì)黃鱔血清中溶菌酶活性的影響

如圖1所示，在感染嗜水氣單胞菌后，各組黃鱔血清中溶菌酶活力在48 h內(nèi)不斷升高；與對(duì)照組比較，處理I組酶活力變化不明顯，處理組Ⅱ在12和24 h顯著上升(P<0.05)，處理組Ⅲ在感染12 h顯著上升(P<0.05)，在24h極顯著上升(P<0.01)，但3組均在48 h與對(duì)照組差異不明顯。

2.3 嗜水氣單胞菌感染對(duì)黃鱔血清中ACP活性的影響

如圖2顯示，感染嗜水氣單胞菌后各組黃鱔血清中ACP活性在48 h內(nèi)不斷升高；與對(duì)照組比較，處理組ⅠACP活性在24 h時(shí)顯著上升(P<0.05)，處理組II在12 h時(shí)顯著上升(P<0.05)，處理組III ACP在12、24 h時(shí)均顯著上升(P<0.05)，但3組均在48 h與對(duì)照組差異不明顯。

圖1 不同濃度嗜水氣單胞菌處理對(duì)黃鱔血清溶菌酶活力影響Fig. 1 Effect of different concentrationsand processing time of Aeromonas hydrophila on serum lysozyme activity in Monopterus albus

圖2 不同濃度嗜水氣單胞菌處理對(duì)黃鱔血清ACP酶活力影響Fig. 2 Effect of different concentrations and processing time of Aeromonas hydrophila on serum ACP enzyme activity in Monopterus albus

2.4 嗜水氣單胞菌感染對(duì)黃鱔血清中AKP活性的影響

圖3 不同濃度嗜水氣單胞菌處理對(duì)黃鱔血清AKP酶活力影響Fig. 3 Effect of different concentrations and processing time of Aeromonas hydrophila on serum AKP enzyme activity in Monopterus albus

從圖3可以看出，感染嗜水氣單胞菌后，處理組Ⅰ和處理組Ⅱ黃鱔血清中AKP活力持續(xù)升高，處理組Ⅰ在感染48 h時(shí)AKP活力升高極顯著(P<0.01)，處理組II在感染48 h時(shí)出現(xiàn)顯著升高(P<0.05)而處理組Ⅲ12 h升高，后出現(xiàn)顯著(24 h)和極顯著(48 h)下降。

2.5 嗜水氣單胞菌感染對(duì)黃鱔血清中T-SOD活性的影響

如圖4所示，在感染嗜水氣單胞菌后，除處理組Ⅲ48 h外，各組黃鱔血清中T-SOD活性不斷升高，與對(duì)照組比較，處理I組個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異不明顯，處理II組48 h明顯升高(P<0.05)，處理III組在24 h時(shí)顯著升高，在48 h時(shí)則顯著下降。

圖4 不同濃度嗜水氣單胞菌處理對(duì)黃鱔血清T-SOD酶活力影響Fig .4 Effect of different concentrations and processing time of Aeromonas hydrophila treatment on serum T-SOD enzyme activity in Monopterus albus

3 結(jié)論與討論

溶菌酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶和超氧化物歧化酶屬于魚(yú)體的體液免疫因子，在魚(yú)體免疫過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。在受到外界抗原侵入時(shí)會(huì)快速合成并分泌到血液中，通過(guò)檢測(cè)其在血液中的活性可反映魚(yú)體免疫過(guò)程的規(guī)律和健康狀態(tài)[9]。

3.1 嗜水氣單胞菌感染后黃鱔組織病理學(xué)變化

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在感染嗜水氣單胞菌24 h后，黃鱔出現(xiàn)明顯染病癥狀，組織病理變化主要表現(xiàn)為體表及組織器官出血變性，細(xì)胞壞死，導(dǎo)致器官功能衰竭直至死亡。有研究表明發(fā)病呈急性過(guò)程，在感染9 h后即出現(xiàn)明顯病變癥狀[10]；而本實(shí)驗(yàn)在感染12 h后，黃鱔并未出現(xiàn)明顯病變癥狀，這可能與本實(shí)驗(yàn)選擇在溫度較低的秋末有關(guān)，延長(zhǎng)了黃鱔的發(fā)病時(shí)間，但是組織病理的變化與其一致，說(shuō)明了低溫對(duì)嗜水氣單胞菌的感染有抑制作用。在感染初期，黃鱔組織病理變化不顯著，而四種酶的活性相比對(duì)照組變化也不顯著，而在感染后期，黃鱔組織器官受損變化顯著，黃鱔血清中四種酶的活力變化顯著。這從側(cè)面說(shuō)明了四種酶的活力變化與黃鱔臟器功能變化密切相關(guān)。

3.2 嗜水氣單胞菌對(duì)黃鱔血清溶菌酶活力的影響

溶菌酶是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶，并使之裂解而被釋放，從而消除侵入體內(nèi)的異物。該酶不僅能殺滅革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌還可使病毒失活[11]，因此，該酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。本研究結(jié)果證實(shí)感染嗜水氣單胞菌后，黃鱔血清中溶菌酶活性顯著升高，說(shuō)明在感染嗜水氣單胞菌后，黃鱔非特異性免疫功能得到增強(qiáng)。處理組Ⅱ和Ⅲ在感染24 h后溶菌酶活性都比對(duì)照組高，但有隨時(shí)間下降的趨勢(shì)，這可能是嗜水氣單胞菌在體內(nèi)24 h后的繁殖程指數(shù)生長(zhǎng)模式[12]，超出了黃鱔自身的防御能力，使酶活性降低。當(dāng)然，影響溶菌酶活力的因素還有很多，比如季節(jié)、溫度、PH值、水質(zhì)等都會(huì)對(duì)其有所影響[13]，這可能就是對(duì)照組在48 h內(nèi)也有升高趨勢(shì)的原因，但對(duì)本實(shí)驗(yàn)研究分析其活性變化趨勢(shì)無(wú)太大影響。

3.3 嗜水氣單胞菌感染對(duì)黃鱔ACP活力的影響

ACP是溶酶體的重要組成成分，與溶酶體參與細(xì)胞凋亡功能密切相關(guān)[14]。感染嗜水氣單胞菌后，日本鰻鱺血清中的ACP的活性明顯升高[15]。噴灑蛭弧菌后，草魚(yú)血清和肝臟中的ACP活性都有所升高[16]。對(duì)于黃鱔感染嗜水氣單胞菌，有關(guān)研究表明，黃鱔肝臟中ACP活力有隨著菌液濃度呈先升高后降低變化規(guī)律，隨著時(shí)間同樣呈現(xiàn)了先升高后降低的趨勢(shì)[8]。本研究結(jié)果也顯示了在感染嗜水氣單胞菌后初期，黃鱔血清中ACP活力也有升高的趨勢(shì)，但總體上隨時(shí)間延長(zhǎng)并沒(méi)有降低的趨勢(shì)，而是在后期趨于不變；且隨濃度的升高，ACP活力在后期也趨于不變，或有少許升高，可能是由于實(shí)驗(yàn)季節(jié)和溫度的原因，使嗜水氣單胞菌毒性有所下降。處理組Ⅱ組在24 h的活力相比12 h有所下降，但降低不顯著，總體趨勢(shì)并未下降，而是在后期升高，說(shuō)明感染后期，黃鱔機(jī)體細(xì)胞凋亡加快，需合成分泌更多ACP參與細(xì)胞的凋亡。

3.4 嗜水氣單胞菌感染對(duì)黃鱔血清AKP活性的影響

AKP和ACP一樣是溶酶體的重要組成成分，并且和鈣磷的代謝有直接聯(lián)系，正常情況下，血清中的AKP含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于肝臟，但是如果肝臟功能受到損傷時(shí)，肝臟內(nèi)的AKP就會(huì)釋放到血液中，從而導(dǎo)致血液中AKP含量或者活性升高[17]。有研究表明，在感染嗜水氣單胞菌后，黃鱔臟器中的AKP活力都有顯著升高，但在48 h后沒(méi)有差異性變化[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的菌液處理后，黃鱔血清中AKP活力程持續(xù)升高趨勢(shì)，這與之前的研究并無(wú)矛盾，這可能是由于季節(jié)和溫度造成的黃鱔免疫能力不同，使黃鱔應(yīng)急反應(yīng)的時(shí)間有延長(zhǎng)。處理III組高濃度的菌液處理在感染初期也有升高趨勢(shì)，但是在24 h后有不斷下降的趨勢(shì)，這說(shuō)明在處理初期，黃鱔肝臟即受到損傷，AKP大量釋放到血液中，使得血清中AKP活力增加，但高濃度菌液處理24 h后，黃鱔肝臟功能下降，AKP含量降低，釋放到血清中的AKP隨之降低，這與解剖發(fā)現(xiàn)的肝臟腫脹充血的現(xiàn)象相吻合，導(dǎo)致AKP活力增加后呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢(shì)。

3.5 嗜水氣單胞菌感染對(duì)黃鱔血清T-SOD的影響

超氧化物歧化酶是一種重要的抗氧化酶，其活性與生物的免疫水平密切相關(guān)，是機(jī)體對(duì)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的第一道屏障，對(duì)于及時(shí)消除機(jī)體內(nèi)氧自由基，增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的防御能力和整個(gè)機(jī)體的免疫功能有重要作用[18]。本研究結(jié)果中，各組在感染嗜水氣單胞菌后超氧化物歧化酶活性都有明顯的上升，這與張偉妮所研究的感染嗜水氣單胞菌后日本鰻鱺血清中超氧化物歧化酶的活力的變化相似[15]。但在感染嗜水氣單胞菌48 h后，處理組Ⅲ黃鱔血清T-SOD活性顯著下降，而趙靜在以嗜水氣單胞菌感染齊口裂腹魚(yú)后也得到了相同的結(jié)果，其原因推測(cè)是過(guò)高濃度的菌液和感染時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致黃鱔組織器官嚴(yán)重受損，引起代謝紊亂，從而使機(jī)體抗氧化能力下降[19]。

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