VEGF基因調控TGF-β1信號轉導通路在鼻咽癌轉移中的機制及臨床意義

黃中 邵汛帆 鄭乃瑩

廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院放療科（廣州510095）

細胞信號轉導的異常是腫瘤發(fā)生的分子基礎。血管內皮生長因子（VEGF）基因調控轉化生長因子-β1（TGF-β1）信號轉導通路在與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移等密切相關，其中TGF-β1是一種具有雙向調節(jié)功能細胞因子，在細胞生長、分化等方面發(fā)揮重要的作用［1］。有實驗結果顯示［2］VEGF是TGF-β1信號通路的直接靶點，TGF-β1能增強脂多糖誘導的VEGF的生成，而TGF-β1單獨卻不能。該通路既往在乳腺癌報道較多，并指出TGF-β可促進乳腺癌血行轉移至肺［3］，但在鼻咽癌（NPC）方面的報道較少。本實驗用免疫組化法檢測局部中晚期鼻咽癌組織中VEGF、TGF-β1的表達情況，結合患者臨床特點及預后，分析其相關性并對其預后進行多因素綜合分析。有助于臨床上對鼻咽癌轉移的預測及預后評價。

1 資料與方法

1.1 臨床資料及標本來源收集2008年6月至2012年8月在本院治療的局部中晚期鼻咽癌患者治療前的鼻咽局部組織蠟塊，共96例。其中男73例，女23例；年齡18～60歲之間，中位年齡45歲；分期依據(jù)我國鼻咽癌2008分期標準，其中Ⅲ期60例和Ⅳa期36例；病理診斷均為鼻咽未分化型非角化性癌；治療方法為誘導化療加同期放化療，且放化療方案相同。隨訪中38例出現(xiàn)遠處轉移，其中單純骨轉移16例，單純肺轉移8例，單純肝轉移2例，多器官轉移12例。

1.2 免疫組化檢測方法組織標本以10%福爾馬林液固定，常規(guī)石臘包埋，制成5 μm厚切片，烤片60℃2 h。采用Dako Link Omnis染色系統(tǒng)，SP免疫組化染色法。用已知陽性組織標本作陽性對照；以PBS代替一抗作陰性對照。具體操作如下：（1）采用三合一修復液Env FLEX TRS，High HP 97℃孵育20 min，清洗；（2）分別滴加VEGF、TGF-β1一抗工作液，37 ℃孵育10 min，清洗；（3）3%H2O2，孵育10 min，清洗；（4）滴加非生物素標記的二抗，Env FLEX/HRP 37℃孵育12 min，清洗；（5）DAB底物色原顯色，清洗；（6）復染蘇木素，清洗；（7）脫水，封片。

1.3 結果判讀染色結果采用以下方案，分別由兩位病理科副主任醫(yī)師獨立地閱片，再進行綜合計分及判斷：VEGF陽性細胞主要為胞漿著色，細胞不著色為陰性（-）；陽性細胞數(shù)＜25%為弱陽性（+）；陽性細胞數(shù)26%～50%為陽性（++）；陽性細胞數(shù)＞50%為強陽性（+++）。TGF-β1陽性細胞主要為胞漿著色（黃色或棕黃色），將顯色細胞數(shù)百分比規(guī)定為，陽性細胞數(shù)＜1/3計為1分，1/3～2/3計為2分，≥2/3計為3分；將細胞質染色的深淺度規(guī)定為無著色細胞為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；百分比×深淺度為最后得分；0分判定為陰性（-），1～2分為弱陽性（+），3～4分為中等度陽性（++），6～9分為強陽性（+++）。

1.4 療效觀察和隨訪放化療以后5年內每3個月進行1次復查。隨訪終點為轉移或者死亡。計算5年無轉移生存率（metastasis-free survival，MFS）及5年生存率（overall survival，OS）。

1.5 統(tǒng)計學方法應用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，VEGF及TGF-β1的表達與性別、年齡、局部侵犯、淋巴轉移等臨床指標的關系用χ2檢驗；以Kaplan-Meier法分析生存率，并通過Log rank檢驗；用Cox模型進行單因素及多因素的預后分析。

2 結果

2.1 VEGF與TGF-β1信號通路各分子在局部中晚期鼻咽癌組織中的表達及其相關性結果顯示VEGF陽性的表達率66.7%，TGF-β1陽性的表達率53.1%。VEGF和TGF-β1在中晚期鼻咽癌的表達成正相關。VEGF和TGF-β1均與淋巴轉移有顯著相關性，而與年齡、性別、局部侵犯等無明顯相關。見圖1、表1～3。

圖1 免疫組織化學染色檢測VEGF和TGF-β1在鼻咽癌組織中的表達Fig.1 Representative immunohistochemistry images of VEGF staining（A）and TGF-β1 staining（B）in nasopharyngeal carcinoma tissue

表1 96名病人中VEGF和TGF-β1的表達情況Tab.1 Expression of VEGF and TGF-β1 in 96 patients with NPC例

表2 VEGF與TGF-β1在鼻咽癌組織中表達的相關性Tab.2 Correlations between VEGF and TGF-β1 expression in NPC 例

2.2 VEGF與TGF-β1表達與患者預后的關系鼻咽癌組織中VEGF與TGF-β1表達與患者5年MFS及OS的關系如表4所示。VEGF陰性患者與陽性患者MFS、OS的差異有顯著性（P＜0.05）；TGF-β1陰性患者與陽性患者MFS、OS的差異有顯著性（P＜0.01）。見圖2、3。

2.3 Cox比例風險模型進行生存的單因素和多因素分析用Cox單因素相關分析VEGF、TGF-β1對MFS的影響。結果顯示，VEGF陽性為不良預后因素（P＜0.05）。而TGF-β1陽性不是獨立預后因素（P＞0.05）。用Cox多因素相關分析年齡、性別、淋巴轉移、局部侵犯、VEGF和TGF-β1對MFS的影響。結果顯示：VEGF陽性為不良預后因素（P＜0.01）。

表3 VEGF與TGF-β1的表達與鼻咽癌主要臨床特點之間的關系Tab.3 Relationship between expression of VEGF and TGF-β1 and various clinicopathological features of NPC 例（%）

表4 VEGF與TGF-β1陰性與陽性的鼻咽癌患者的5年生存情況Tab.4 5-year survival rate of NPC patients with negative and positive expression of VEGF and TGF-β1 %

圖2 Kaplan-Meier法分析VEGF與TGF-β1表達情況與鼻咽癌患者的5年總生存的關系Fig.2 5-year OS of NPC patients with negative and positive expression of VEGF and TGF-β1

3 討論

我省是鼻咽癌發(fā)病率最高的地區(qū)，據(jù)不同文獻報道Ⅲ、Ⅳ期的鼻咽癌患者約占70%，目前的三維適形調強放療技術讓鼻咽癌原發(fā)灶的控制率有了明顯的提高，但是晚期鼻咽癌的5年OS仍僅約20%～30%，主要致死原因是遠處轉移的發(fā)生［4-.5］。

圖3 Kaplan-Meier法分析VEGF與TGF-β1表達情況與鼻咽癌患者的5年無遠處轉移生存的關系Fig.3 5-year MFS of NPC patients with negative and positive expression of VEGF and TGF-β1

細胞信號轉導的異常在腫瘤發(fā)生、進展、轉移的分子機制和靶向治療是目前研究的熱點。VEGF基因調控TGF-β1信號轉導通路與乳腺癌、肺癌、前列腺癌、惡性黑色素瘤等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展轉移密切相關［6］。血管的形成在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉歸過程中起著重要作用，而VEGF的主要作用是形成新的血管［7］，VEGF誘導的MMPs不僅參與新血管的形成，還同時參與腫瘤侵蝕和轉移的調控［8-9］。作為TGF-β1信號通路的直接靶點［1-2］，VEGF特別是VEGF-a可以結合2個酪氨酸激酶受體，促進內皮細胞分化、增殖、遷移和誘導MMP［10］。TGF-β1在細胞生長、分化及凋亡等方面的功能具有雙向性，一方面它是潛在生理抑制因子，能夠能抑制內皮細胞及腫瘤細胞的增殖［11］；另一方面它也通過促進內皮細胞的遷移和增殖來刺激血管的生成［12］，調節(jié)MMP的活性，從而促進腫瘤轉移的發(fā)生［6］。同時，TGF-β1還可增強癌細胞的浸潤能力，促進腫瘤的進展［13］。

本實驗用免疫組化法檢測局部中晚期鼻咽癌組織中VEGF、TGF-β1的表達情況，結合患者臨床特點及預后，分析其意義。結果顯示，VEGF與TGF-β1在局部中晚期鼻咽癌組織中高表達，并且表達成正相關。VEGF和TGF-β1均與淋巴轉移有顯著相關性，說明它們能較好地反映鼻咽癌細胞的轉移能力，與血管形成促進腫瘤轉移的理論相符。當然，VEGF基因調控TGF-β1信號轉導通路還可能存在更為復雜的調控機制或者與其它信號轉導通路之間的相互作用機制，需要進一步的動物實驗，繼續(xù)探討該信號轉導通路在鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展、轉移中的作用。

用Cox單因素相關分析VEGF、TGF-β1對MFS的影響。結果顯示，VEGF高表達的患者與TGF-β1高表達的患者的OS均顯著縮短，這與既往文獻［14-15］報道基本一致。VEGF陽性為不良預后因素（P＜0.05），但TGF-β1陽性卻不是獨立預后因素（P＞0.05），可能與其在細胞生長、分化及凋亡等方面的功能具有雙向性有關。用Cox多因素相關分析年齡、性別、淋巴轉移、局部侵犯、VEGF和TGF-β1對MFS的影響。結果顯示：VEGF陽性為不良預后因素（P＜0.01）。而淋巴轉移及局部侵犯并不是不良預后因素，可能與入組的病例都為局部中晚期，以及入組病例數(shù)較少有關。

以上研究表明，VEGF和TGF-β1陽性與鼻咽癌細胞的轉移能力相關。在臨床上，對VEGF和TGF-β1陽性甚至高表達的患者應當制定更為積極的個體化治療。如果能抑制它們的表達，則有可能在一定程度上抑制轉移的發(fā)生。目前比較成熟的個體化治療主要是抗血管生成療法，全身熱療作為防止腫瘤遠處轉移的發(fā)生也已經(jīng)在乳腺癌方面開始基礎研究［16］。綜上所述，通過對鼻咽癌組織當中VEGF和TGF-β1蛋白的表達情況的檢測，可能有助于對鼻咽癌轉移的預測及預后評價。對于高表達者應加強個體化綜合治療以提高生存率，延長生存期。

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