rhPTH（1-34）對糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥的防治作用

孫平 邢強強 洪郭駒 楊國柱 劉楠 孫偉珊 胡伶平 鄧偉民 馬承紅

廣東藥科大學附屬第一醫(yī)院1骨內(nèi)科，5內(nèi)分泌科（廣州510080）；2山東省青島市即墨區(qū)人民醫(yī)院護理部

（山東青島 266200）；3廣州中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院骨科（廣州510504）；4廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院（廣州510006）；6廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院康復科（廣州510010）

糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥（Glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP）是繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥最常見的原因，其發(fā)病率僅次于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥及老年性骨質(zhì)疏松癥而位居第3位［1］，受到廣泛關(guān)注。GC可抑制骨形成，因此，促合成代謝藥物是GIOP治療領(lǐng)域的研究重點。甲狀旁腺素（Parathyroid hormone，PTH）是目前唯一具有促進骨形成的藥物，可針對性地防治GIOP，但其具體機制尚不明確。甲狀旁腺素相關(guān)肽［parathyroid hormone-related peptide 1-34，rhPTH（1-34）］間斷小劑量注射可增加BMD、改善骨微結(jié)構(gòu)、降低骨折風險［2］。Wnt信號通路中β-catenin、wnt10b蛋白與GIOP的發(fā)生密切相關(guān)。鑒于此，本文建立大鼠GIOP模型，采用qRT-PCR和Western blot等檢驗方法，探討Wnt信號通路相關(guān)蛋白在BMSCs成骨分化過程中的作用，為其防治GIOP提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及飼料3月齡SPF級雌性SD大鼠48只，按照廣東藥科大學實驗中心標準飼養(yǎng)，標準鼠糧適應(yīng)性飼養(yǎng)（含鈣1.19%，磷0.85%，1 045 IU維生素D），室溫（23±2）℃，自由飲水，光照和黑夜時間間隔12 h，定期消毒及通風，各組大鼠均單籠培養(yǎng)。

1.2 主要試劑注射用甲強龍（輝瑞公司）；Lipopolysaccharide（Sigma公司）；Protease Inhibitor Cocktail SetⅢ（美國Calbiochem公司）；一抗Wnt10b鼠抗、β-catenin兔抗（Sigma公司）；GAPDH（CST公司）；HRP山羊抗小鼠IgG二抗、HRP山羊抗兔IgG二抗、ALP檢測試劑盒、DEPC處理水（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；茜素紅染色檢測試劑盒（廣州賽業(yè)生物科技有限公司）；PCR試劑盒（ROCHE公司）；PCR引物（生工生物工程上海有限公司）；

1.3 檢測儀器與軟件TP1020自動脫水機（Leica Biosystems公司）、Autos全自動染色機（Leica公司）；BX53顯微鏡（Olympus公司）；μCT100柜式錐形束微型CT（Scanco公司）；image-pro plus軟件（Media Cybernetics公司）。

1.4 分組及研究方法3月齡SPF級雌性SD大鼠24只，隨機分為4組：正常對照組、甲強龍組（模型組）、參照HULLEY等［3］的方法，皮下注射甲強龍（Methylprednisolone，Met）5 mg/（kg·d），每周5次，甲強龍組（Met）+皮下注射生理鹽水（空白對照組）、甲強龍組（Met）+rhPTH（1-34）灌胃（試驗組）。各組適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進入實驗期12周。

1.4.1 GIOP造模與干預方法腹部肌肉注射Met 5 mg/（kg·d），隔間24 h連續(xù)注射6次。注射Met期間，每天每只大鼠相應(yīng)腹部處注射青霉素10萬U，連續(xù)6次，預防感染。腹部注射rhPTH（1-34）按照人的臨床等量劑量換算。正常組注射與rhPTH（1-34）等體積的生理鹽水。

1.4.2 Micro-CT檢測（1）掃描參數(shù)：由Scanco公司提供μCT100柜式錐形束微型CT。X線5 μm焦點直徑，30～ 90 kVp/20～ 50 keV（160 Μa）；探測器為3 072 × 400；分辨率：1.25 μm，4 μm；圖像矩陣：512×512～8 192×8 192。掃描尺寸為100 mm×140 mm。（2）掃描方法：將納入研究的GIOP大鼠及對照組通過尾靜脈空氣注射處死，延雙側(cè)臀肌外側(cè)切開，暴露雙側(cè)股骨頭，用咬骨嵌取下左側(cè)股骨頭及轉(zhuǎn)子部（不破壞及擠壓股骨頭部骨小梁）。給予4%多聚甲醛固定2周。將股骨縱軸與顯微CT檢查床滑軌的移動軸平行近端進行Micro-CT掃描。對Micro-CT掃描圖像經(jīng)校準后手動選取股骨頭區(qū)域建立三維興趣區(qū)（region of interest，ROI），興趣區(qū)為完整股骨頭區(qū)域。（3）檢測指標：組織體積（tissue volume，TV）、骨體積（bone volume，BV）；在直接測量和三角測量法（triangulation，TRI）模式下，對骨小梁數(shù)量（trabecular number，Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁分離度（trabecular separation/spacing，Tb.Sp）；并 進 行 三 維重建。

1.4.3 HE染色截取股骨全長并剔除周圍肌肉，沿正中冠狀面剖開，用10%甲醛溶液（pH=7.4）固定48 h，再置于10%EDTA-Tris緩沖液中脫鈣，隔天更換脫鈣液，直至完全脫鈣以后，流水沖洗，逐級乙醇脫水，二甲苯透明處理2 h，石蠟包埋、切片，切片厚度為4 μm，常規(guī)HE染色。光鏡下觀察骨髓腔內(nèi)骨髓細胞、骨小梁及骨細胞形態(tài)等。

1.4.4 GIOP大鼠來源BMSCs與rhPTH（1-34）干預：參照曹華等［4］的方法，選取4周齡SPF級雌性SD大鼠24只建立GIOP模型后（方法同上述動物實驗），分離模型大鼠雙側(cè)脛骨BMSCs細胞，先在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至細胞密度2×106個/40 μL（DMEM培養(yǎng)基內(nèi)含100 IU青霉素、100 μg/mL鏈霉素，三維支架經(jīng)PBS緩沖液沖洗后置于DMEM培養(yǎng)基中），分別行成骨誘導分化。

1.4.5 染色法檢測成骨分化能力將模型組大鼠腹部解剖，收集腹主動脈血液，并進行分離提BMSCs。將BMSCs分為3組，包括空白對照組、50 ng/mL BMP-2（對照組）、20 ng/mL rhPTH（1-34）（試驗組）。50 ng/mL BMP-2和20 ng/mL rhPTH（1-34）進行成骨誘導液誘導BMSCs。（1）ALP法檢測細胞分化：BMSCs使用胰酶進行消化，以1×104個/mL接種于96孔板（設(shè)6個復孔），培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)基，加入相應(yīng)的處理培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，根據(jù)ALP試劑盒說明書進行檢測。（2）鈣化結(jié)節(jié)染色：將BMSCs以1×104mL/孔密度接種于6孔培養(yǎng)板上，培養(yǎng)24 h，根據(jù)分組加入相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基（2 mL/孔），每種濃度設(shè)2個復孔，每72小時換液1次，連續(xù)培養(yǎng)21 d，經(jīng)茜素紅染色后，顯微鏡觀察鈣化結(jié)節(jié)形成過程。

1.4.6 Western blot檢測從液氮中取出股骨頭稱重后放入研磨缽中，研磨至粉末狀，按50 mg骨組織/200 μL RIPA裂解液制備樣品。BMSCs用裂解液裂解細胞，刮凈培養(yǎng)板，SDS-PAGE：分別制備10%分離膠、5%濃縮膠，待凝膠聚合后，注入電泳緩沖液。樣品裂解液與上樣緩沖液按5∶1充分混勻，置沸水浴中加熱5 min，冷卻后用微量移液器吸取樣品與預染蛋白marker點樣并電泳。轉(zhuǎn)膜緩沖液中制作濾紙、凝膠、PVDF膜，350 mA轉(zhuǎn)膜3 h。取出PVDF膜置于盛有5%脫脂奶粉的封閉液的平皿中，搖床室溫封閉1 h。傾倒封閉液，加入一抗（Wnt10b、β-catenin按1∶1 000稀釋，β-catenin、GAPDH按1∶2 000稀釋），搖床上室溫振蕩孵育2 h，孵育過夜?；厥找豢?，用TBST洗滌3～ 5次，每次10 min。加入相應(yīng)二抗（1∶1 000）。TBST洗滌3次，每次5 min，TBS洗滌1次，1 min。將發(fā)光顯色試劑盒中的顯色劑A和B等體積混合后，加在PVDF膜上充分接觸反應(yīng)2 min后，將PVDF膜移至另一保鮮袋中，放入凝膠成像系統(tǒng)中進行成像分析。先曝光約3～5 min，根據(jù)信號的強弱適當調(diào)整曝光時間，分析結(jié)果，使用image-pro plus軟件進行半定量分析。

1.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料結(jié)果以均數(shù)±標準差表示，采用組間兩獨立樣本t檢驗及方差分析（one-way ANOVA）進行統(tǒng)計分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 GIOP模型造模與干預評價建立GIOP模型，模型組：骨小梁稀疏變細，出現(xiàn)骨髓細胞碎片，細胞數(shù)目及網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)較正常稀疏。正常組：骨小梁完整，骨小梁中的骨細胞清晰可見?？梢姵晒腔顒虞^為活躍，骨小梁形態(tài)較好（圖1）。各組骨小梁與組織體積比比較，試驗組與模型組之間差異有顯著性（P＜0.05，表1）。

圖1 各組大鼠鏡下組織病理切片F(xiàn)ig.1 The results of pathological section in difference groups

表1 各組BT/TV比值Tab.1 The radio of bone trabecular and tissue volume of groups ±s

表1 各組BT/TV比值Tab.1 The radio of bone trabecular and tissue volume of groups ±s

注：與正常對照組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05

2.2 Micro-CT檢測GIOP模型骨微結(jié)構(gòu)模型組與正常對照組相比，前者BV/TV、Tb.N、Tb.Th值降低，Tb.Sp值升高（P＜0.05）。試驗組與模型組相比，前者BV/TV、Tb.N、Tb.Th值升高，Tb.Sp值降低（P＜0.05），空白對照組相應(yīng)指標與模型組比較差異無顯著性（表2）。ROI三維重建可見模型組骨小梁紊亂，可見普遍斷裂，骨質(zhì)較少；試驗組相對而言骨質(zhì)改善，骨小梁有局部性修復，說明rhPTH（1-34）增加GIOP大鼠模型的骨小梁修復和促進微觀骨性結(jié)構(gòu)改善（圖2）。

表2 各組BV/TV、Tb.Th、Tb.Sp、Tb.N等參數(shù)比較Tab.2 The parameters of BV/TV、Tb.Th、Tb.Sp、Tb.N of groups ±s

表2 各組BV/TV、Tb.Th、Tb.Sp、Tb.N等參數(shù)比較Tab.2 The parameters of BV/TV、Tb.Th、Tb.Sp、Tb.N of groups ±s

注：與正常對照組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05

2.3 rhPTH（1-34）調(diào)控大鼠骨組織Wnt10b、βcatenin蛋白表達試驗組的Wnt10b和β-catenin蛋白表達水平較模型組顯著增高（P＜0.05），模型組與空白對照組各指標相比，差異均無顯著性（P＜0.05，表3）。

2.4 rhPTH（1-34）促進ALP染色和茜素紅染色各組經(jīng)茜素紅染色檢測礦化結(jié)節(jié)。BMP-2和rhPTH（1-34）干預后形成的礦化密度均顯著高于空白對照組，rhPTH（1-34）處理組礦化密度較BMP-2處理組少，提示rhPTH（1-34）能顯著增強BMP-2的礦化能力。與空白對照組相比，rhPTH（1-34）對正常大鼠BMSCs具有成骨誘導作用，可顯著提高細胞ALP活性（圖3）。

圖2 正常對照組、模型組、試驗組、空白對照組Micro-CT三維重建影像Fig.2 The results of Micro-CT in difference groups.

表3 骨組織中Wnt10b和β-catenin相對蛋白量Tab.3 The relative protein of Wnt10b and β-cateninin bone tissue ±s

表3 骨組織中Wnt10b和β-catenin相對蛋白量Tab.3 The relative protein of Wnt10b and β-cateninin bone tissue ±s

注：與正常對照組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05

圖3 各組茜素紅染色檢測及礦化密度比較（A）；各組ALP染色檢測及ALP密度比較（B）（100×）Fig.3 Alizarin red staining and mineralization density results indifference groups；ALP staining and ALP density results indifference groups（100 ×）

3 討論

正常的骨骼中骨形成和骨吸收之間處于動態(tài)平衡，GIOP由于失去了這種動態(tài)平衡，以骨形成缺陷為主，成骨減少，骨量降低，機體對骨微損傷的修復能力下降，導致骨的脆性增加，易于骨折。研究表明，每日接受7.5 mg或者更高劑量的GC治療3個月以上，最終有30%～50%發(fā)展為骨質(zhì)疏松，有超過1/3的絕經(jīng)后婦女椎體至少發(fā)生過1次椎體骨折［5］，由于GC在臨床上廣泛而長期運用，使得該病的發(fā)病率居高不下。因此，如何拮抗GC副作用以有效防治GIOP中骨代謝紊亂具有關(guān)鍵性意義。

目前臨床治療骨質(zhì)疏松癥主要基于促進骨形成、抑制骨吸收和改善骨組織3方面［6］。rhPTH（1-34）是第一個用于臨床的具有促進骨形成的治療骨質(zhì)疏松癥的藥物，可增加骨形成，改善骨微結(jié)構(gòu)和強度，并減少骨折的發(fā)生［7］，其促骨形成的作用機制，主要認為是rhPTH（1-34）與靶細胞膜上的G蛋白偶聯(lián)，從而激活一系列信號傳導途徑，引發(fā)細胞內(nèi)生物學活動，進而影響骨代謝。Wnt信號通路在促進骨形成中發(fā)揮著重要作用，Wnt/β-catenin信號通路通過影響成骨細胞的增殖、分化、骨基質(zhì)的形成和礦化在骨形成過程中扮演重要角色。Wnt信號通路中β-catenin、wnt10b蛋白與OP的發(fā)生密切相關(guān)。Wnt10b可抑制脂肪細胞生成、促進BMSCs向成骨細胞分化增多，進而促進骨形成，增加全身骨量。GC可通過阻止β-catenin的累積及向核內(nèi)的轉(zhuǎn)移，增加β-catenin降解，抑制Wnt10b表達，降低骨形成［8］。同時成骨細胞可通過旁分泌方式分泌Wnt10b進一步促進BMSCs向成骨細胞分化，Wnt10b在BMSCs的過表達在體內(nèi)會使BMD增加，骨小梁的厚度、數(shù)量均增加，在體外還可以促進成骨細胞的發(fā)生過程［9］。本研究結(jié)果顯示，給予GC干預后，β-catenin、wnt10b水平模型組較正常對照組顯著降低，給予rhPTH（1-34）后，能夠顯著提高大鼠骨量及Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導通路中Wnt10b和β-catenin的表達，使BMSCs向脂肪細胞分化減少而向成骨細胞分化增多，提高成骨分化，促進骨形成，提示rhPTH（1-34）可拮抗GC導致的Wnt10b和β-catenin的降低，進而使骨量增加。本課題另一部分rhPTH（1-34）對GIOP大鼠脂代謝作用的研究正在進行中。

綜上，隨著GC和經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導通路研究的深入，rhPTH（1-34）在成骨細胞分化及骨形成過程中的作用機制將進一步被闡明。

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