上調miR-493靶向E2F1抑制骨肉瘤細胞增殖及遷移

曹平

武漢科技大學天佑醫(yī)院骨科（武漢430064）

骨肉瘤好發(fā)于兒童及青少年，致死率和復發(fā)率很高，常轉移至肺部及胸膜［1］。深入研究骨肉瘤發(fā)病的分子機制對提高骨肉瘤基因治療水平具有重要意義。miRNA是一類小分子非編碼RNA，約18～24個堿基，由發(fā)夾結構的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工合成，miRNA通過mRNA的3′端非編碼區(qū)域結合而調控下游基因［2］。miRNA參與了骨肉瘤細胞增殖、周期、凋亡等多個生理過程。研究報道，miR-493 抑制肺癌［3］、肝癌［4］、胃癌［5］的增殖和侵襲轉移過程。然而，miR-493對骨肉瘤細胞增殖遷移影響的機制不明確，本文通過熒光定量PCR分析方法確定了骨肉瘤組織與瘤旁組織miR-493表達量的差異，發(fā)現(xiàn)miR-493在骨肉瘤組織中表達量顯著低于瘤旁組織，因此miR-493可能為抑癌基因，然后通過MTT及Transwell小室實驗檢測miR-493對骨肉瘤143B細胞增殖及侵襲能力的影響，并深入探討其可能的分子機制，為臨床應用提供可能的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料回顧性分析我科2010年1月至2016年6月收治的38例骨肉瘤患者的人骨肉瘤組織及瘤旁組織標本，所有標本從手術臺上取下后立即轉入液氮罐保存。涉及人體標本實驗通過了我院倫理委員會審查后實施。人骨肉瘤細胞系143B、MG63、U2OS及人成骨細胞系hFOB1.19購自武漢大學細胞典藏中心，DMEM培養(yǎng)基、α-MEM、胎牛血清和胰蛋白酶等均購自武漢谷歌生物有限公司，Trizol購自美國Invitrogen公司，Lipofectamine2000轉染專用試劑購自美國Invitrogen公司，實驗室所用一抗均購自武漢三鷹生物有限公司，miR-493 mimic及其對照物均由廣州銳博生物提供，細胞培養(yǎng)瓶、6孔板、24孔板、MTT試劑、DMSO、Transwell小室、結晶紫等耗材均購自武漢谷歌生物公司。

1.2 細胞培養(yǎng)、轉染和分組人骨肉瘤細胞系采用DMEM培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清和1%抗生素）培養(yǎng)，置于37℃、5%二氧化碳及飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞間和培養(yǎng)箱定期消毒。為研究miR-493過表達對143B細胞系增殖和遷移的作用，本實驗將細胞系分為兩組，miR-493 mimic轉染組（miR-493組）和miR-493陰性對照組轉染組（對照組），將細胞置于6孔板中培養(yǎng)，當細胞融合達到70%左右時進行轉染，轉染操作按照Lipofectamine 2000說明書進行，轉染最終濃度為50 nmol，每孔液體體積為2 mL。

1.3 熒光定量PCR實驗Trizol法提取組織或細胞總RNA，檢測RNA濃度，然后按照TagMan RNA逆轉錄試劑盒（美國ABI公司）說明書進行逆轉錄，獲得cDNA。采用SYBR Green PCR master mix試劑盒（日本TAKARA公司）進行qRT-PCR。miR-493正向引物；反向引物，采用2-ΔΔ方法進行定量分析，以U6作為內參，計算miR-493相對表達量。

1.4 MTT檢測細胞增殖實驗瞬時轉染24 h后，將細胞以每孔3 000個細胞接種于96孔板中，每孔體積為100 μL，每組設置5個復孔，同時設置空白對照孔，培養(yǎng)24、48、72及96 h后采用MTT檢測各組細胞增殖情況。去除培養(yǎng)基后，每孔中加入5 mg/L的MTT溶液，置于37℃下4 h后，棄掉培養(yǎng)基，每孔加入150 μL的DMSO孵育10 min，振蕩器上微震蕩15 min，使得結晶充分溶解于DMSO中，用空白對照孔進行調零操作，采用酶標儀檢測各組的吸光度值（OD值），計算各組細胞增殖速率。本研究繪制的調零后各組吸光度值曲線。

1.5 Transwell小室遷移實驗實驗前先將小室在超凈臺中取出，加入100 μL培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中孵育10 min，使得聚碳酸酯膜親水。細胞瞬時轉染24 h后，胰蛋白酶消化，無血清的細胞培養(yǎng)及重懸細胞，制備成濃度為5×105/mL細胞懸浮液，每個小室中加入100 μL的細胞懸浮液，在下室中每孔加入500 μL的有血清培養(yǎng)基，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小室。取出小室，用棉簽擦掉小室內部未穿過底膜的細胞，注意不要擦掉小室底部外面的細胞。用多聚甲醛固定15 min，棄掉甲醇溶液，晾干后置于0.1%結晶紫溶液中染色10 min，用雙蒸水沖洗數(shù)次，空氣中風干。顯微鏡下（×200）隨機選取10個視野進行細胞計數(shù)。

1.6 Wentern blotting實驗提取細胞總蛋白。配置SDS-PAGE分離膠和濃縮膠，加樣，電泳，濃縮膠80 V電泳35 min，分離膠100 V電泳90 min，分離蛋白，注意設置marker蛋白。采用濕轉發(fā)進行轉膜，350 mA，轉膜120 min，將蛋白轉至PVDF膜上。然后進行免疫雜交操作。取出PVDF膜，用BSA封閉1 h，兔抗人一抗孵育過夜（4℃條件下），TBST系膜3次，每次5 min，二抗（山羊抗兔）孵育1 h，TBST洗膜，每次5 min，化學發(fā)光法顯影，在暗室中進行曝光操作，掃描膠片上蛋白條帶并用軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0進行軟件統(tǒng)計，計量資料以±s表示，采用兩獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料（transwell小室實驗跨膜細胞數(shù)目）采用卡方檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-493在骨肉瘤組織瘤旁組織表達差異熒光定量PCR檢測結果表明，骨肉瘤組織中miR-493相對表達量顯著低于瘤旁組織（P＜0.05），表明miR-493可能起到抑癌基因的作用，見圖1。

圖1 miR-493在骨肉瘤組織及瘤旁組織的表達Fig.1 miR-493 expression osteosarcoma tissue and para tumor tissue

2.2 miR-493在骨肉瘤細胞系中表達差異本研究進一步采用熒光定量PCR法檢測人骨肉瘤細胞系143B、MG63、U2OS及人成骨細胞系hFOB1.19中miR-493表達差異，結果表明3種骨肉瘤細胞系中miR-493相對表達量均低于人成骨細胞系hFOB1.19（P＜0.05），進一步表明miR-493可能是抑癌基因。并且，骨肉瘤細胞系143B中miR-493的相對表達量最低，見圖2。

2.3 上調miR-493抑制骨肉瘤143B細胞增殖為探討miR-493對骨肉瘤生物學作用，本研究采用瞬時轉染上調骨肉瘤細胞143B的miR-493，RT-PCR法檢測結果表明，轉染組143B的miR-493相對于對照組表達量為1.43±0.55，表明瞬時轉染成功，采用MTT法檢測miR-493組與對照組細胞增殖，結果表明，上調miR-493組細胞的24、48、72及96 h的細胞增殖能力低于對照組細胞（P＜0.05），見圖3。

圖2 miR-493在骨肉瘤細胞系中表達差異Fig.2 miR-493 expression in osteosarcoma cell lines

圖3 miR-493抑制骨肉瘤143B細胞增殖Fig.3 miR-493 inhibits the proliferation of osteosarcoma 143B cells

2.4 上調miR-493抑制骨肉瘤細胞遷移能力本研究采用transwell法檢測細胞遷移能力，與對照組相比，上調miR-493的細胞（miR-493組）跨膜細胞數(shù)目低于對照組（P＜0.05），表明miR-493抑制了骨肉瘤細胞143B的遷移能力，見圖4。

2.5 上調miR-493通過靶基因E2F1抑制143B細胞遷移為進一步探討miR-493抑制骨肉瘤細胞增殖和遷移能力機制，本研究采用Targetscan在線miRNA靶基因預測軟件分析，獲得miR-493靶基因為轉錄因子E2F1，E2F1 mRAN 3′UTR與miR-493結合位點見圖5A。采用Western blotting實驗檢測兩組細胞基因表達，結果表明，miR-493上調組細胞E2F1基因及侵襲轉移關鍵基因MMP-2、MMP-9蛋白表達量顯著降低，見圖5B。該實驗結果表明，miR-493可能通過靶基因E2F1抑制143B細胞遷移能力。

圖4 miR-493抑制骨肉瘤細胞遷移能力Fig.4 miR-493 inhibition of osteosarcoma cell migration

圖5 上調miR-493通過靶基因E2F1抑制143B細胞遷移Fig.5 miR-493 inhibited migration of 143B cells through target gene E2F1

3 討論

miRNA作為轉錄后調控系統(tǒng)中的重要調節(jié)基因，其重要性備受關注［6-8］。miRNA常定位于與惡性腫瘤相關的基因組區(qū)域和脆性位點，參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉移［9］。本研究表明，miR-493在骨肉瘤組織和骨肉瘤細胞系中表達分別低于其相對照的瘤旁組織和人成骨細胞系，提示miR-493可能是抑癌的候選基因。實驗進一步上調骨肉瘤細胞系143B的miR-493，結果顯示miR-493抑制了骨肉瘤細胞增殖和遷移。

細胞遷移是骨肉瘤細胞發(fā)生局部侵襲擴增和遠處轉移的重要環(huán)節(jié)。本研究通過生物信息學在線軟件分析得出，miR-493的可能靶基因為轉錄因子E2F1，且上調miR-493后，骨肉瘤細胞E2F1蛋白水平表達被抑制。轉錄因子E2F1是細胞周期相關轉錄因子E2F家族成員之一，同時在調控腫瘤侵襲轉移中起著關鍵作用。WANG等［10］研究表明，下調E2F1可抑制骨肉瘤細胞侵襲轉移及上皮間質轉化，同時侵襲轉移標志基因MMP-2和MMP-9被抑制，E2F1/DDR1/STAT3信號軸在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著關鍵作用。因此，下調E2F1基因能通過基質金屬蛋白酶通路抑制骨肉瘤生物學活性，這與本實驗結果一致。miRNA與E2F1調控關系密不可分，例如，李成等［11］發(fā)現(xiàn)微小RNA-329通過調控靶基因E2F1抑制人骨肉瘤U-2OS細胞增殖及分化，microR-29通過E2F1和E2F3抑制骨肉瘤U2OS 和 SAOS-2 細胞侵襲轉移［12］，miR-320［13］抑制骨肉瘤U2OS細胞增殖和周期進展，生物信息學分析結果顯示其靶基因為E2F1。這些結果均支持本研究，miR-493下調了骨肉瘤細胞E2F1表達水平，從而達到抑制骨肉瘤增殖和侵襲轉移。

此外，本研究顯示miR-493還抑制了基質金屬蛋白MMP-2和MMP-9表達。MMP-2和MMP-9是基質金屬蛋白酶家族成員之一，參與腫瘤侵襲轉移［14-17］。MMP-2和MMP-9與其他家族成員具有相似的蛋白空間結構，一般由5個功能不同的結構域組成，以保持酶原穩(wěn)定性、催化活性等［14］。MMP-2和MMP-9可降解骨肉瘤細胞外基質成分，骨肉瘤細胞更加容易脫離原位腫瘤部位，進入血液循環(huán)系統(tǒng)從而向遠處轉移［18］。所以，miR-493抑制骨肉瘤侵襲轉移的機制可能與下調MMP-2、MMP-9表達有關，但生物信息學分析并未預測到MMP-2、MMP-9作為miR-493的靶基因。筆者推測，miR-493可能通過下調E2F1基因表達，從而間接調節(jié)MMP-2和MMP-9，從而抑制骨肉瘤侵襲。

然而，本實驗還存在不足之處。盡管生物信息學分析和蛋白實驗均表明miR-493的靶基因可能是E2F1，但本研究缺乏雙熒光素酶報告實驗，因此不能明確驗證miR-493是否直接作用于靶基因E2F1。因此，本課題下一步將深入研究miR-493的直接作用靶點，并在動物水平完成相關驗證實驗。

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