黃連素調(diào)節(jié)腸道菌群減輕非酒精性脂肪性肝病肝臟炎癥的實(shí)驗(yàn)研究*

張園園 嚴(yán)君君 張 培 周希喬

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科(210029)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是全球最常見的慢性肝病之一，其疾病譜演變包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌。近年統(tǒng)計(jì)顯示，全球約四分之一的人口罹患NAFLD，每年約有0.044%的NAFLD進(jìn)展為肝細(xì)胞癌［1］。在我國，NAFLD患病率已超過慢性病毒性肝病，成為第一大肝病。目前NAFLD的治療主要為調(diào)整生活方式以及預(yù)防和控制合并疾病，即治療肥胖、高血脂、高血糖、高血壓等［2］，尚缺乏針對(duì)特異性靶點(diǎn)的治療藥物。

黃連素(berberine，C20H18NO4)是一種異喹啉類生物堿，作為中草藥在中國用于治療腸道細(xì)菌感染導(dǎo)致的腹瀉已有數(shù)千年歷史，具有可以信賴的療效和安全性［3-4］。腸道菌群是影響代謝性疾病的主要環(huán)境因素，參與維持并調(diào)節(jié)宿主的能量代謝和免疫功能，腸道菌群失調(diào)可能導(dǎo)致包括NAFLD在內(nèi)的多種代謝性和免疫性疾病并促進(jìn)疾病進(jìn)展［5］。藥理學(xué)研究表明，黃連素可能具有多個(gè)作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制，包括降低膽固醇、調(diào)控肝臟內(nèi)參與糖脂代謝的基因表達(dá)以及調(diào)節(jié)腸道菌群穩(wěn)態(tài)［6］。本研究旨在探討黃連素對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝臟脂毒性的保護(hù)作用及其減輕肝臟炎癥損傷的相關(guān)機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

雄性C57BL/6J小鼠40只，6～8周齡，體質(zhì)量20～25 g，由南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。高脂飼料(脂肪含量60%)、普通飼料(脂肪含量10%)(Research Diets，Inc.);黃連素(上海源葉生物科技有限公司);Percoll分離液、棕櫚酸(PA)(Sigma-Aldrich LLC.);油紅染料(南京因貝生物技術(shù)有限公司);脂多糖(LPS)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)ELISA試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司);real-time PCR相關(guān)試劑盒(上海皓嘉科技發(fā)展有限公司)。

二、方法

1.動(dòng)物分組和模型建立：研究方案經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，自由進(jìn)食、飲水，動(dòng)物房通風(fēng)良好，室溫25℃，相對(duì)濕度55% ～65%，每日光照12 h。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，30只小鼠隨機(jī)分為3組：對(duì)照組、高脂飲食組和治療組，每組10只。治療組在高脂飲食的同時(shí)每天予200 mg/kg黃連素灌胃(黃連素粉末以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制成懸液，灌胃前將懸液顛倒混勻)，持續(xù)12周;對(duì)照組和高脂飲食組予相同體積羧甲基纖維素鈉溶液灌胃。

2.肝巨噬細(xì)胞分離、培養(yǎng)：10只小鼠用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。小鼠饑餓處理16～24 h，麻醉后暴露門靜脈和下腔靜脈，將穿刺套管針插入門靜脈固定。緩慢勻速向肝內(nèi)泵入常溫PBS 30～40 mL，剪開下腔靜脈，繼續(xù)灌注含Ⅰ型膠原酶的Hank’s液20 mL。摘取肝臟移入DMEM培養(yǎng)基中剪碎，37℃水浴搖床中孵育20 min，得到的單細(xì)胞懸液定容至50 mL，以細(xì)胞篩網(wǎng)除去未消化完全的組織塊;50×g離心10 min×3次，去除大部分肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，上清液轉(zhuǎn)入新的離心管;Percoll密度梯度離心分離肝巨噬細(xì)胞，收集中間液體，離心，洗滌2次。6孔板無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.血清生化指標(biāo)檢測(cè)：第 12周末動(dòng)物禁食12 h，1%戊巴比妥鈉麻醉，眼眶取血約 1 mL，3 000 r/min 4℃離心15 min，吸取上層血清，以全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)和空腹血糖。

4.肝組織病理學(xué)檢查：取小鼠肝臟，稱取濕重。部分肝組織4%甲醛固定24 h，石蠟包埋、切片，行HE染色;部分肝組織立即置于液氮中，冰凍切片，行油紅染色;剩余肝組織-80℃冰箱保存。病理切片由病理學(xué)專家讀片，Image-Pro Plus 6.0軟件分析油紅染色切片中脂滴面積(×400)。

5.16SrRNA基因測(cè)序檢測(cè)腸道菌群：每組隨機(jī)采集5只小鼠的回盲部糞便樣品，共15個(gè)樣品，交由華大基因科技有限公司高通量測(cè)序?qū)嶒?yàn)室行腸道菌群焦磷酸測(cè)序和生物信息學(xué)分析。檢測(cè)前以熒光計(jì)或酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)樣品完整性。比較三組小鼠組內(nèi)和組間腸道細(xì)菌豐度指數(shù);對(duì)門、綱、目、科、屬、種分類進(jìn)行熱圖聚類分析;通過與數(shù)據(jù)庫比對(duì)，對(duì)OTU(operational taxonomic units，運(yùn)算分類單位)進(jìn)行物種分類，并對(duì)各個(gè)樣品作物種profiling面積圖和柱狀圖;根據(jù)群落熱圖顏色梯度的變化分析各組小鼠全部菌屬和菌種的比例變化。

6.ELISA法檢測(cè)血清和肝組織炎癥因子水平：ELISA試劑盒室溫放置至少30 min，凍存血清樣品平衡至室溫。參照相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)小鼠血清LPS和肝組織TNF-α、IL-6水平，每一樣品設(shè)4個(gè)復(fù)孔。讀取酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處吸光度值(A值)，采用相應(yīng)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各樣品檢測(cè)值。

7.透射電子顯微鏡觀察肝巨噬細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)：小鼠原代肝巨噬細(xì)胞以無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，換液分組為對(duì)照組(不予處理)以及1 μmol/L黃連素、0.5 mmol/L PA和兩者聯(lián)合處理組，培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞以4%戊二醛4℃固定，PBS洗滌30 min，1%鋨酸固定1 h，緩沖液漂洗3次，梯度脫水，乙酸鈾染色，透射電子顯微鏡觀察、拍照。

8.Real-time PCR檢測(cè)肝巨噬細(xì)胞促炎細(xì)胞因子表達(dá)：小鼠原代肝巨噬細(xì)胞以無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，換液分組為對(duì)照組(不予處理)以及0.1 μg/mL LPS 和 0.1 μmol/L 黃連素 +0.1 μg/mL LPS處理組，培養(yǎng)24 h后提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以之為模板行real-time PCR擴(kuò)增，操作步驟參照相應(yīng)試劑盒說明書。PCR引物序列見表1，由南京金斯瑞生物科技公司合成。2-△△CT法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以ˉx±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 PCR引物序列

結(jié) 果

一、一般情況和血清生化指標(biāo)變化

三組小鼠體質(zhì)量基數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，飲食量基本一致。高脂飲食組小鼠體質(zhì)量從第6周開始明顯增高，趨于肥胖，第12周末體質(zhì)量為(34.4±3.3)g;治療組小鼠經(jīng)12周黃連素灌胃，體質(zhì)量與對(duì)照組基本齊平［(25.1±3.2)g對(duì)(27.7±1.8)g，P＞0.05］。肉眼觀察高脂飲食組小鼠肝臟明顯增大，色偏黃，表面覆有油脂，切面結(jié)構(gòu)模糊;治療組小鼠肝臟濕重較高脂飲食組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［(0.82±0.08)g對(duì)(1.18±0.09)g，P＜0.05］。高脂飲食組小鼠血清 ALT、AST、TC、TG和空腹血糖較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);治療組ALT、TC、TG和空腹血糖較高脂飲食組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，AST降幅不明顯(P＞0.05)(表2)。

二、肝組織病理學(xué)改變

肝組織HE染色切片光學(xué)顯微鏡下觀察顯示，對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，在中央靜脈周圍呈放射狀排列，肝細(xì)胞內(nèi)未見脂滴;高脂飲食組小鼠肝細(xì)胞脂肪變，細(xì)胞腫大變圓，小葉中央?yún)^(qū)受累明顯，細(xì)胞排列紊亂，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大小不等的球形脂滴，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤，可見炎癥壞死灶融合成片;治療組小鼠肝小葉脂滴聚集和炎癥病灶明顯減少。冰凍切片油紅染色可更明顯地觀察到高脂飲食組小鼠肝內(nèi)大顆粒脂滴沉積，治療組小鼠脂滴數(shù)量明顯減少(圖1)。高脂飲食組脂滴面積明顯大于對(duì)照組［(170 149.6±29 920.4)像素2對(duì)(75 663.3±25 686.2)像素2，P ＜0.05］，治療組脂滴面積較高脂飲食組明顯減?。?79 450.6±30 787.8)像素2對(duì)(170 149.6±29 920.4)像素2，P ＜0.05］，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 各組小鼠血清生化指標(biāo)比較

表2 各組小鼠血清生化指標(biāo)比較

*與對(duì)照組比較，P＜0.05;#與高脂飲食組比較，P＜0.05

組別 例數(shù) ALT(U/L) AST(U/L) TC(mmol/L) TG(mmol/L) 空腹血糖(mmol/L)對(duì)照組 10 24.57±2.16 157.27±17.25 2.57±0.37 0.58±0.07 4.16±0.35高脂飲食組 10 33.69±6.91* 181.85±27.06* 3.64±0.43* 0.76±0.08* 7.51±1.58*治療組 10 28.25±7.87# 172.15±68.86 2.43±0.66# 0.67±0.22# 4.45±1.80#

三、腸道菌群豐度變化

15個(gè)樣品共得到564 366條序列，每一樣品平均37 624條。α和β多樣性分析顯示，高脂飲食組小鼠腸道菌群組分與對(duì)照組相比有較大差異，治療組小鼠腸道菌群豐度明顯降低。16S rRNA基因測(cè)序物種熱圖分析腸道菌群相對(duì)豐度，并在門分類上進(jìn)行物種分析，結(jié)果顯示對(duì)照組回盲部微生物主要為擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)，高脂飲食組厚壁菌門和變形菌門減少，治療組變形菌門和疣微菌門(Verrucomicrobia)增加(P＜0.05)。對(duì)科的分類熱圖聚類分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，高脂飲食組擬桿菌(Bacteroidaceae)、雙歧桿菌(Bifidobacteriaceae)、脫硫弧菌(Desulfovibrionaceae)減少，帕拉普氏菌(Paraprevotellaceae)增加;治療組擬桿菌、脫硫弧菌增加，帕拉普氏菌減少(圖2)。

四、黃連素減輕小鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)

ELISA檢測(cè)顯示，高脂飲食組小鼠血清LPS和肝組織IL-6水平較對(duì)照組明顯升高，治療組LPS、IL-6水平較高脂飲食組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，三組間肝組織TNF-α水平無明顯變化(P＞0.05)(圖3)。上述結(jié)果表明黃連素能有效減輕小鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)。

五、黃連素體外改善肝巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積和促炎細(xì)胞因子表達(dá)

透射電子顯微鏡觀察顯示，經(jīng)黃連素處理的原代肝巨噬細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和形態(tài)上與未予處理的巨噬細(xì)胞無明顯差異;經(jīng)PA處理的巨噬細(xì)胞可見明顯脂質(zhì)沉積，胞質(zhì)中出現(xiàn)大量不規(guī)則脂滴;如同時(shí)予黃連素和PA處理，巨噬細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯減小，數(shù)量減少(圖4)。經(jīng)LPS處理的巨噬細(xì)胞，TNF-α、IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量較未予處理的巨噬細(xì)胞明顯增高，如同時(shí)予黃連素和LPS處理，兩者表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖5)。上述結(jié)果表明黃連素在體外能改善肝巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積和促炎細(xì)胞因子表達(dá)。

圖1 各組小鼠肝組織病理學(xué)改變

圖2 各組小鼠回盲部菌群豐度變化

圖3 黃連素減輕小鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)

圖4 黃連素改善PA誘導(dǎo)的原代肝巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積

圖5 黃連素改善LPS誘導(dǎo)的原代肝巨噬細(xì)胞促炎細(xì)胞因子表達(dá)增加

討 論

NAFLD是一種以肝臟表現(xiàn)為主的代謝綜合征，病理特點(diǎn)為肝內(nèi)脂肪顆粒沉積、肝細(xì)胞氣球樣變和炎性細(xì)胞浸潤。該病影響發(fā)達(dá)國家約30%的成年人，在糖尿病和肥胖患者中的檢出率高達(dá)60% ～70%［7-8］。盡管NAFLD為良性疾病，但可進(jìn)展為肝纖維化、肝硬化甚至肝細(xì)胞癌，因此探索、研發(fā)靶向治療NAFLD的藥物迫在眉睫。

過去20年中，大量研究報(bào)道了黃連素對(duì)2型糖尿病和高脂血癥的治療作用，近年研究發(fā)現(xiàn)黃連素還可用于治療NAFLD［9-10］。黃連素口服后，在肝臟中的分布濃度是血漿濃度的50～70倍，可調(diào)節(jié)肝臟內(nèi)代謝相關(guān)基因表達(dá)，改善肝臟脂質(zhì)代謝、增加胰島素敏感性、促進(jìn)肝糖原合成，從而減輕NAFLD以及相關(guān)代謝性疾病［6，10］。本研究采用高脂飲食誘導(dǎo)雄性C57BL/6J小鼠NAFLD模型，模型小鼠體質(zhì)量和肝臟濕重明顯增加，肝臟呈現(xiàn)明顯脂肪變性和炎癥損傷，血清ALT、AST病理性升高，提示肝細(xì)胞受損，并出現(xiàn)糖、脂代謝失調(diào)。予黃連素灌胃治療12周的模型小鼠，體質(zhì)量、肝臟濕重、血清ALT、TC、TG和空腹血糖均明顯降低，與既往研究［10］結(jié)果相一致。黃連素降低血清AST的作用不明顯，可能與藥物劑量低、給藥時(shí)間短，不足以完全修復(fù)線粒體損傷，使反映肝細(xì)胞線粒體損傷的AST恢復(fù)正常。

NAFLD的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前主流觀點(diǎn)為“二次打擊”學(xué)說，第一次打擊為肝內(nèi)脂質(zhì)聚集，引起胰島素抵抗;第二次打擊為體內(nèi)炎癥因子釋放，引發(fā)線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激，導(dǎo)致肝臟損傷［11］。本研究中小鼠高脂飲食12周后，HE染色和油紅染色觀察到肝細(xì)胞內(nèi)有大量脂滴沉積和炎癥壞死灶，而經(jīng)黃連素治療的小鼠肝內(nèi)脂質(zhì)聚集明顯減少，炎性細(xì)胞浸潤改善。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，以透射電子顯微鏡觀察小鼠原代肝巨噬細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，同樣發(fā)現(xiàn)PA可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積，而黃連素可明顯減少細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量。黃連素改善肝臟脂質(zhì)沉積和炎癥反應(yīng)的作用，可能歸因于其對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。與他汀類降脂藥不同，黃連素系通過穩(wěn)定低密度脂蛋白受體(LDL-R)表達(dá)降低膽固醇。血液中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的清除主要依賴LDL-R，而9型前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin(PCSK9)可與肝細(xì)胞表面的LDLR結(jié)合，使之分解而不再能清除LDL-C。因此抑制PCSK9可使肝細(xì)胞表面有更多LDL-R以清除血液中的LDL-C。研究［12］發(fā)現(xiàn)予高脂飲食大鼠黃連素灌胃治療后，其肝組織PCSK9表達(dá)顯著下調(diào)，因此PCSK9可能是黃連素抗高脂血癥作用的靶點(diǎn)之一。目前深入研究該信號(hào)通路的課題正在開展中。

研究發(fā)現(xiàn)，脂肪肝和代謝綜合征小鼠體內(nèi)存在腸道菌群改變，腸道菌群紊亂可誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)，促進(jìn)胰島素抵抗，參與 NAFLD的發(fā)生、發(fā)展［13］。具體而言，腸-肝軸對(duì)機(jī)體健康起重要雙向調(diào)節(jié)作用，腸道菌群參與宿主肥胖、肝臟脂肪性炎癥和纖維化的發(fā)生，增加肝細(xì)胞癌易感性;而宿主的膳食結(jié)構(gòu)、肥胖、進(jìn)食頻率、睡眠-覺醒周期等亦可影響腸道菌群的豐度和組分［14］。NAFLD患者腸道菌群紊亂，表現(xiàn)為艱難梭菌增加，擬桿菌大量死亡，數(shù)量減少［15］。擬桿菌為革蘭陰性菌，其死亡過程中溶解產(chǎn)生大量LPS，后者通過門靜脈進(jìn)入肝臟，被肝巨噬細(xì)胞上的Toll樣受體4(TLR4)識(shí)別，LPS/TLR4信號(hào)通路活化引發(fā)炎癥和胰島素抵抗，參與NAFLD發(fā)?。?6］。此外，NAFLD患者的腸道細(xì)菌能將膽堿代謝為三甲胺氧化物(TMAO)，導(dǎo)致肝臟損傷，誘發(fā)炎癥反應(yīng)［17］。本研究以16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)分析小鼠回盲部腸道菌群，α和β生物多樣性在各組間均存在差異，正常小鼠回盲部微生物主要為擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門，高脂飲食可致擬桿菌、雙歧桿菌、脫硫弧菌減少，帕拉普氏菌增加;而黃連素灌胃治療可恢復(fù)腸道菌群豐度和組分，小鼠回盲部擬桿菌、脫硫弧菌增加，帕拉普氏菌減少。

本研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食組小鼠血清LPS和肝組織IL-6水平顯著增高，而黃連素灌胃能明顯降低LPS和IL-6水平。肝巨噬細(xì)胞能吞噬凋亡、壞死的肝細(xì)胞，參與肝纖維化形成，并釋放促炎細(xì)胞因子導(dǎo)致慢性炎癥反應(yīng)［18］。為進(jìn)一步研究黃連素減輕炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制，本研究分離、培養(yǎng)小鼠肝巨噬細(xì)胞，并予LPS刺激促炎細(xì)胞因子表達(dá)，發(fā)現(xiàn)黃連素處理能顯著降低巨噬細(xì)胞的TNF-α、IL-6表達(dá)水平。根據(jù)上述研究結(jié)果，推測(cè)黃連素可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群、減少LPS生成而抑制肝巨噬細(xì)胞炎癥因子釋放，進(jìn)而減輕肝臟炎癥反應(yīng)。

綜上所述，NAFLD是由遺傳、環(huán)境等多因素共同作用導(dǎo)致的代謝性肝病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，炎癥反應(yīng)和腸-肝軸在其發(fā)生、發(fā)展中扮演至關(guān)重要的角色。本研究結(jié)果顯示，黃連素在NAFLD中發(fā)揮調(diào)節(jié)腸道菌群、減輕肝臟脂質(zhì)沉積和炎癥損傷的作用，為黃連素在臨床實(shí)踐中的推廣應(yīng)用提供了新的科學(xué)依據(jù)。

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