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    IL-22BP在活動期炎癥性腸病患者腸黏膜中的表達(dá)及其意義*

    2018-05-10 05:52:31陳達(dá)凡宛新建
    胃腸病學(xué) 2018年4期
    關(guān)鍵詞:陽性細(xì)胞活動度結(jié)腸

    馬 靜 陳達(dá)凡 宛新建

    上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院消化科(200080)

    炎癥性腸病(IBD)主要包括克羅恩病(CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(UC),是一種慢性非特異性消化道炎癥性疾病。目前其病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,一般認(rèn)為是宿主基因、腸道微生態(tài)、環(huán)境等因素相互作用,引發(fā)消化道異常免疫反應(yīng)所致。多種細(xì)胞因子表達(dá)和調(diào)節(jié)失衡與機(jī)體異常免疫反應(yīng)密切相關(guān)。

    白細(xì)胞介素-22結(jié)合蛋白(interleukin-22 binding protein,IL-22BP)是IL-22的內(nèi)源性抑制劑,可特異性、高親和性地與IL-22結(jié)合,從而抑制其作用[1-2]。IL-22可通過促進(jìn)腸上皮細(xì)胞(intestinal epithelial cells,IECs)分泌多種抗菌肽以及黏蛋白,促進(jìn)IECs增殖,抑制IECs凋亡,從而在維持腸黏膜屏障功能穩(wěn)態(tài)中扮演重要角色[3-6]。近年國外有研究發(fā)現(xiàn)IL-22BP在IBD患者腸黏膜中高表達(dá),利用多種動物模型證實(shí)其通過抑制IL-22的腸道保護(hù)作用,促進(jìn)腸道炎癥的發(fā)生[7-8]。然而目前IL-22BP與IBD的關(guān)系尚未完全闡明,我國IBD患者腸黏膜中IL-22BP表達(dá)水平及其意義鮮有報(bào)道。本研究通過檢測活動期IBD患者腸黏膜中IL-22BP的表達(dá)情況,旨在探討其在IBD發(fā)病中的臨床意義。

    材料與方法

    一、資料來源

    納入2017年1月—2018年1月上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院收治的活動期IBD患者61例,其中CD患者25例,UC患者36例,非上海籍患者達(dá)到1/3,能在一定程度上代表國內(nèi)情況。IBD的診斷符合《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2012年·廣州)》[9]。采用蒙特利爾分型對CD確診年齡(age,A)、病變部位(location,L)以及疾病行為(behavior,B)進(jìn)行分型,對 UC病變范圍進(jìn)行分類[10]。利用簡化 CD 活動指數(shù)(CDAI)[11]、CD 簡化內(nèi)鏡評分(SES-CD)[12-13]以及 Mayo 評分系統(tǒng)[14]分別對CD和UC的疾病活動度進(jìn)行評估。

    留取IBD患者病變最明顯處的腸黏膜組織,其中CD回腸組織12份、結(jié)腸組織13份,UC結(jié)腸組織36份。另選擇同期結(jié)腸息肉患者30例設(shè)為對照,其結(jié)腸鏡下表現(xiàn)為具有單個且直徑<0.6 cm的息肉,患者既往無結(jié)核、自身免疫性疾病史,留取距息肉5 cm以上的正?;啬c和(或)結(jié)腸組織,其中14例患者留取回腸和結(jié)腸組織,16例僅留取結(jié)腸組織。將14份回腸組織以及16份結(jié)腸組織設(shè)為CD對照組,30份結(jié)腸組織設(shè)為UC對照組。入選者均選取2塊組織,1塊立即置于液氮,-80℃冰箱凍存?zhèn)溆?,?塊置于甲醛溶液固定,石蠟包埋。本研究方案經(jīng)上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過,所有入選者均簽署知情同意書。

    二、研究方法

    1.實(shí)時熒光定量PCR法檢測腸黏膜中IL-22BP mRNA表達(dá):將入選者腸黏膜組織充分研磨,以總RNA提取試劑TRIeasy(上海翊圣生物科技有限公司)提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成,IL-22BP引物序列:F:5’-GGC ACT TAC TGG CAA CAG CA-3’,R:5’-GCA TCC ACT TGG CTT CTG GT-3’。以 β-actin作為內(nèi)參,引物序列:F:5’-AAG GTG ACA GCA GTC GGT-3’,R:5’-TGT GTG GAC TTG GGA GAG G-3’。反應(yīng)體系含cDNA模板2 μL、上下游引物(4 μmol/L)各 1 μL、SYBR Green Master Mix 10 μL,以 DEPC水補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min;95℃ 變性10 s,55 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,共40個循環(huán)。上ABI Q6 real-time PCR儀實(shí)時監(jiān)測。每一樣本均設(shè)3個復(fù)孔。采用2-△△Ct法計(jì)算 IL-22BP mRNA相對表達(dá)量。

    2.免疫組化法檢測腸黏膜中IL-22BP蛋白表達(dá):腸組織標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋,4 μm厚連續(xù)切片。檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù),3%H2O2溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,3%BSA室溫封閉30 min,加入IL-22BP抗體(Abcam公司,工作濃度為1∶500),4℃孵育過夜,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,梯度乙醇脫水,二甲苯透明后封片。

    結(jié)果判定:光學(xué)顯微鏡下,細(xì)胞質(zhì)中觀察到淡黃色至黃褐色顆粒定義為陽性細(xì)胞。采用Formwitz半定量積分法。于200倍視野下隨機(jī)觀察5個視野,計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞并觀察染色強(qiáng)度。陽性細(xì)胞率:≤5%,0分;6% ~25%,1分;26% ~50%,2分;51% ~75%,3分;>75%,4分。染色強(qiáng)度:無色,0分;淡黃色,1分;黃色,2分;黃褐色,3分。兩項(xiàng)評分之積為染色總分:0分為陰性(-),1~4分為弱陽性(+),5~8分為中等陽性(++),9~12分為強(qiáng)陽性(+++)。采用盲法由兩名醫(yī)師獨(dú)立評分,不一致時取均值。

    3.腸黏膜中IL-22BP蛋白表達(dá)與IBD疾病活動度的相關(guān)性:分別采用簡化CDAI以及Mayo評分評估CD和UC患者的疾病活動度,并分析其與IL-22BP蛋白表達(dá)的相關(guān)性。

    三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    結(jié) 果

    一、一般情況

    25例CD患者中,男15例,女10例;年齡16~60歲,平均(37.76±12.43)歲;蒙特利爾A1型(≤16歲)3例,A2型(17~40歲)15例,A3型(>40歲)7例;L1型(累及回腸)9例,L2型(累及結(jié)腸)6例,L3型(累及回結(jié)腸)10例;B1型(非狹窄非穿透型)15例,B2型(狹窄型)6例,B3型(穿透型)4例,P(肛周病變)7例;根據(jù)簡化CDAI評分,疾病活動度為中度(5~8分)18例,重度(>8分)7例;內(nèi)鏡下表現(xiàn)為回腸和(或)結(jié)腸黏膜糜爛、節(jié)段性縱行潰瘍或阿弗他潰瘍。36例UC患者中,男19例,女17例;年齡22~68歲,平均(41.36±12.52)歲;蒙特利爾E1型(直腸)8例,E2型(左半結(jié)腸)10例,E3型(廣泛結(jié)腸)18例;根據(jù)Mayo評分,疾病活動度為輕度(3~5分)18例,中度(6~10分)14例,重度(11~12分)4例;結(jié)腸鏡下表現(xiàn)為結(jié)腸黏膜紅斑、易脆、糜爛或潰瘍形成。30例對照組患者中男17例,女13例,年齡20~67歲,平均(41.06±11.47)歲。各組間性別構(gòu)成和年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P >0.05)。

    二、腸黏膜中IL-22BP mRNA表達(dá)

    與相應(yīng)對照組相比,CD組患者腸黏膜中IL-22BP mRNA表達(dá)顯著升高(t=13.553,P<0.001),UC組患者腸黏膜中IL-22BP mRNA表達(dá)亦顯著升高(t=10.720,P <0.001)(表1、圖1)。

    三、腸黏膜中IL-22BP蛋白表達(dá)

    免疫組化結(jié)果顯示,CD組和UC組患者腸黏膜均出現(xiàn)IL-22BP陽性細(xì)胞,呈黃色或黃褐色胞質(zhì)染色,腸黏膜中IL-22BP以中等陽性表達(dá)為主。CD組陽性細(xì)胞在腸黏膜全層可見,UC組則主要位于上皮和固有層。對照組患者腸黏膜中IL-22BP以弱陽性表達(dá)為主。CD組和UC組患者腸黏膜中IL-22BP蛋白表達(dá)均顯著高于相應(yīng)對照組(t=7.652,P<0.001;t=6.572,P <0.001)(表1、圖 2)。

    四、腸黏膜中IL-22BP蛋白表達(dá)與IBD疾病活動度的相關(guān)性

    相關(guān)性分析顯示,腸黏膜中IL-22BP蛋白表達(dá)與CD疾病活動度呈顯著正相關(guān)(r=0.649,P<0.001),與UC疾病活動度亦呈顯著正相關(guān)(r=0.732,P <0.001)。

    表1 各組IL-22BP mRNA和蛋白表達(dá)±s)

    表1 各組IL-22BP mRNA和蛋白表達(dá)±s)

    *與相應(yīng)對照組比較,P<0.001

    組別 例數(shù) mRNA 表達(dá) 蛋白表達(dá)CD組 25 3.59±0.83* 6.12±2.30*30 1.05±0.34 2.23±1.77 CD對照組 30 1.08±0.45 1.83±1.86 UC組 36 2.19±0.52* 5.58±2.27*UC對照組

    圖1 各組腸黏膜中IL-22BP mRNA表達(dá)(實(shí)時熒光定量PCR法)

    圖2 各組腸黏膜中IL-22BP蛋白表達(dá)(免疫組化染色,×200)

    討 論

    IL-22BP為可溶性的單鏈IL-22受體,與IL-22親和力極高,其特異性結(jié)合于IL-22,可阻斷后者與靶細(xì)胞跨膜受體復(fù)合物的結(jié)合,進(jìn)而抑制下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo),是調(diào)控 IL-22功能的主要因子[1]。IL-22為IL-10家族成員之一,由T細(xì)胞等免疫細(xì)胞分泌,特異性作用于固有細(xì)胞表面由IL-22R1和IL-10R2構(gòu)成的異二聚體,通過激活JAK/STAT等通路在多種自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[15-16]。

    IL-22可促進(jìn)腸道IECs分泌黏蛋白和抗菌肽,調(diào)節(jié)IECs緊密連接蛋白表達(dá)及其功能,促進(jìn)IECs增殖和抑制IECs凋亡[3-6,17]。多種結(jié)腸炎動物模型發(fā)現(xiàn),外源性給予IL-22或促進(jìn)其內(nèi)源性表達(dá),小鼠結(jié)腸炎癥明顯緩解[4,18];而在 IL-22 基因敲除小鼠中,葡聚糖硫酸鈉(DSS)和T細(xì)胞移植誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥和黏膜損傷明顯加重[6,19]。以上研究結(jié)果均提示,IL-22作為連接黏膜固有免疫與適應(yīng)性免疫應(yīng)答的橋梁,在維持腸黏膜上皮完整性和屏障功能穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用,其功能阻斷后,結(jié)腸炎加重。作為IL-22的內(nèi)源性特異性阻斷劑,IL-22BP在IBD患者腸黏膜中的表達(dá)及其對IL-22功能的精細(xì)調(diào)控在IBD發(fā)病中具有重要作用。

    Pelczar等[7]的研究首次發(fā)現(xiàn)IBD患者病變腸黏膜處IL-22BP的表達(dá)上調(diào),對腸道多種細(xì)胞進(jìn)行分選發(fā)現(xiàn),CD4+T細(xì)胞為IL-22BP的主要細(xì)胞來源;利用多種動物模型證實(shí),T細(xì)胞來源的IL-22BP通過抑制IL-22的腸道保護(hù)作用,促進(jìn)小鼠腸道炎癥的發(fā)生,具有致病作用;分選抗TNF-α治療有效的IBD患者腸道CD4+T細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)其仍分泌IL-22,但I(xiàn)L-22BP分泌下降,提示IL-22BP對IL-22腸道保護(hù)作用的抑制減弱,促進(jìn)了IBD病情緩解。Martin等[8]的研究則首次提出嗜酸性粒細(xì)胞為IL-22BP的主要分泌細(xì)胞,IBD患者病變腸黏膜處嗜酸性粒細(xì)胞浸潤增多,IL-22BP表達(dá)上調(diào);與野生型大鼠相比,IL-22BP基因敲除大鼠以DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎后,IL-22調(diào)節(jié)的腸上皮屏障功能明顯改善,DSS結(jié)腸炎癥狀輕微且迅速恢復(fù),再次印證了IL-22BP在IBD中的致病作用。

    目前IL-22BP在IBD患者,特別是我國IBD患者腸黏膜中的表達(dá)及其與疾病活動度的關(guān)系尚未明確。本研究通過檢測活動期IBD患者腸黏膜中IL-22BP mRNA和蛋白表達(dá)情況及其與疾病活動度的關(guān)系,旨在探討其在IBD發(fā)病中的作用。結(jié)果顯示活動期IBD患者腸黏膜中IL-22BP mRNA和蛋白表達(dá)均顯著高于對照組。IL-22BP與IL-22的親和力極高,為膜受體IL-22R1與IL-22親和力的20~1 000倍[15],因此IL-22BP表達(dá)升高可顯著抑制IL-22的腸道保護(hù)功能,可能在IBD發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮作用。進(jìn)一步行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),CD組、UC組患者腸黏膜中IL-22BP蛋白表達(dá)與CD、UC疾病活動度均呈顯著正相關(guān),進(jìn)一步說明IL-22BP在IBD疾病發(fā)展中可能發(fā)揮作用。但I(xiàn)L-22BP能否用于IBD患者病情的評估尚有待多中心、大樣本量研究的進(jìn)一步探討。

    IL-22可上調(diào)抗菌肽LCN2、HBD2、黏蛋白等的表達(dá),促進(jìn)IECs增殖[8],鑒于其在腸道免疫以及黏膜修復(fù)中的重要作用,IL-22分泌及其功能的調(diào)控已成為目前研究的熱點(diǎn)。Kawai等[20]的研究顯示青黛通過作用于芳香烴受體,激活I(lǐng)L-22通路,可顯著緩解DSS和三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎。在未來的研究中,應(yīng)探討IL-22BP對IL-22的精細(xì)化調(diào)節(jié)作用,有望為IBD的治療研究提供一個新的方向。

    綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)IL-22BP在我國活動期IBD患者腸黏膜中高表達(dá),且與疾病活動度呈正相關(guān),提示其可能參與IBD的發(fā)病過程,并且在評估疾病活動度和治療研究方面具有潛在價值。然而,本研究為單中心觀察性研究,樣本量相對較小,未來需多中心以及更深入的基礎(chǔ)研究進(jìn)一步闡明IL-22BP表達(dá)情況以及相關(guān)的作用機(jī)制。

    1 Dudakov JA,Hanash AM,van den Brink MR.Interleukin-22: immunobiology and pathology[J]. Annu Rev Immunol,2015,33:747-785.

    2 Jones BC,Logsdon NJ,Walter MR.Structure of IL-22 bound to its high-affinity IL-22R1 chain[J].Structure,2008,16(9):1333-1344.

    3 Sonnenberg GF,Monticelli LA,Alenghat T,et al.Innate lymphoid cells promote anatomical containment of lymphoid-resident commensal bacteria[J].Science,2012,336(6086):1321-1325.

    4 Sugimoto K, Ogawa A, Mizoguchi E, et al.IL-22 ameliorates intestinal inflammation in a mouse model of ulcerative colitis[J].J Clin Invest,2008,118(2):534-544.

    5 NagalakshmiML, Rascle A, ZurawskiS, etal.Interleukin-22 activates STAT3 and induces IL-10 by colon epithelial cells[J].Int Immunopharmacol,2004,4(5):679-691.

    6 Pickert G,Neufert C,Leppkes M,et al.STAT3 links IL-22 signaling in intestinal epithelial cells to mucosal wound healing[J].J Exp Med,2009,206(7):1465-1472.

    7 Pelczar P,Witkowski M,Perez LG,et al.A pathogenic role for T cell-derived IL-22BP in inflammatory bowel disease[J].Science,2016,354(6310):358-362.

    8 Martin JC,Bériou G,Heslan M,et al.IL-22BP is produced by eosinophils in human gut and blocks IL-22 protective actions during colitis[J].Mucosal Immunol,2016,9(2):539-549.

    9 中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會炎癥性腸病學(xué)組.炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2012年·廣州)[J].胃腸病學(xué),2012,17(12):763-781.

    10 Satsangi J, Silverberg MS, Vermeire S, et al. The Montreal classification ofinflammatoryboweldisease:controversies,consensus, and implications[J].Gut,2006,55(6):749-753.

    11 Harvey RF,Bradshaw JM.A simple index of Crohn’sdisease activity[J].Lancet,1980,1(8167):514.

    12 Daperno M,D’HaensG,VanAsscheG,etal.Development and validation of a new,simplified endoscopic activity score for Crohn’s disease:the SES-CD[J].Gastrointest Endosc,2004,60(4):505-512.

    13 Schoepfer AM,Beglinger C,Straumann A,et al.Fecal calprotectin correlates more closely with the Simple Endoscopic Score for Crohn’s disease(SES-CD)than CRP,blood leukocytes, and the CDAI[J].Am J Gastroenterol,2010,105(1):162-169.

    14 D’Haens G,Sandborn WJ,F(xiàn)eagan BG,et al.A review of activity indices and efficacy end points for clinical trials of medical therapy in adults with ulcerative colitis[J].Gastroenterology,2007,132(2):763-786.

    15 Sabat R,Ouyang W,Wolk K.Therapeutic opportunities of the IL-22-IL-22R1 system[J].Nat Rev Drug Discov,2014,13(1):21-3g/mL8.

    16 Perusina Lanfranca M,Lin Y,F(xiàn)ang J,et al.Biological and pathological activities of interleukin-22[J].J Mol Med(Berl),2016,94(5):523-534.

    17 Kim CJ,Nazli A,Rojas OL,et al.A role for mucosal IL-22 production and Th22 cells in HIV-associated mucosal immunopathogenesis[J].Mucosal Immunol,2012,5(6):670-680.

    18 Monteleone I,Rizzo A,Sarra M,et al.Aryl hydrocarbon receptor-induced signals up-regulate IL-22 production and inhibit inflammation in the gastrointestinal tract[J].Gastroenterology,2011,141(1):237-248.e1.

    19 Zenewicz LA,Yancopoulos GD,Valenzuela DM,et al.Innate and adaptive interleukin-22 protects mice from inflammatory bowel disease[J].Immunity,2008,29(6):947-957.

    20 Kawai S,Iijima H,Shinzaki S,et al.Indigo Naturalis ameliorates murine dextran sodium sulfate-induced colitis via aryl hydrocarbon receptor activation[J].J Gastroenterol,2017,52(8):904-919.

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