肝腸鈣粘連蛋白在反流性食管炎、Barrett食管和食管腺癌中的表達(dá)及意義

史麗芳 蘇秉忠 李艷梅

Barrett食管（BE）是指食管賁門交界處的齒狀線1 cm以上的食管鱗狀上皮被化生的柱狀上皮所替代，伴或不伴有腸化。BE是胃食管反流?。℅ERD）的一種類型，也是食管腺癌（EA）的主要癌前病變，其腺癌的發(fā)生率較正常人高30～50倍。從GERD、BE、不典型增生到EA的發(fā)病模式已被流行病學(xué)、組織學(xué)和分子生物學(xué)所證實(shí)。目前，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為BE伴有腸化生者屬于EA的癌前病變，而BE不伴有腸化生的是否存在癌變風(fēng)險(xiǎn)尚不明確。

肝腸鈣粘連蛋白（LI-cadherin）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類只表達(dá)在老鼠肝腸系統(tǒng)的鈣粘連蛋白新成員，是腸上皮細(xì)胞中一種Ca2+依賴性的貫穿于細(xì)胞膜、介導(dǎo)細(xì)胞間連接的糖蛋白。LI-cadherin在空間分布、結(jié)構(gòu)和功能上與經(jīng)典的鈣粘蛋白不同，但在胚胎的發(fā)生、發(fā)育及組織器官的形成和結(jié)構(gòu)的維持，以及細(xì)胞間、細(xì)胞與基質(zhì)間的粘附和組織結(jié)構(gòu)的維持方面扮演著重要角色。若其功能發(fā)生紊亂，細(xì)胞間的粘附作用將會(huì)降低，形態(tài)也會(huì)發(fā)生改變，致遷移性增強(qiáng)，接觸性抑制作用減弱，從而促使一些腫瘤發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移[1]。LI-cadherin屬于非經(jīng)典鈣粘蛋白超家族，有其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，與鈣粘連蛋白超家族其他成員沒(méi)有太多的同源性。另外，位于其氨基末端EC1的細(xì)胞粘附識(shí)別區(qū)（CAR）中的HAV序列由AAL序列替代，決定了細(xì)胞的粘附特性[2]。

研究顯示，LI-cadherin在不同類型腫瘤中的表達(dá)存在差異。在EA表達(dá)呈現(xiàn)下降[3]，可能與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究通過(guò)檢測(cè)肝腸鈣粘連蛋白 （LI-cadherin）在反流性食管炎（RE）、Barrett食管（BE）、食管腺癌（EA）、胃黏膜腸化生（GIM）中的表達(dá)，以探討B(tài)E和EA早期診斷的分子學(xué)標(biāo)志物及BE伴腸化生（簡(jiǎn)稱BE2）與GIM的關(guān)系。

資料和方法

一、一般資料

選自2013年8月至2014年12月就診于內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院的患者，主訴為燒心、反酸、胸骨后疼痛、吞咽困難或上腹不適等，進(jìn)行胃鏡檢查以除外消化性潰瘍等疾病。記錄入選患者相關(guān)臨床資料。經(jīng)胃鏡和（或）手術(shù)病理檢查后，將患者分為以下7組：RE 組、BE1組 （BE 不伴腸化生）、BE2組、BE3組（BE伴不典型增生）、EA組（各30例）、GIM組及正常對(duì)照組（各20例），7組研究對(duì)象間性別及年齡比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

二、診斷及納入標(biāo)準(zhǔn)

①RE診斷：采用洛杉磯分級(jí)法。②BE診斷：按2015美國(guó)胃腸病學(xué)會(huì)（ACG）的BE臨床診治指南。③EA診斷：位于GEJ以上的腺癌（取材前未經(jīng)放化療等抗腫瘤治療）。④胃上皮腸化生：內(nèi)鏡下取胃黏膜組織經(jīng)病理學(xué)證實(shí)者。

入組者要求不合并有其他嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病者，經(jīng)常規(guī)檢查未發(fā)現(xiàn)有可疑惡性病灶 （EA組要求無(wú)第二原發(fā)腫瘤），入組者均為單病種或患有不影響本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的其他疾患。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

三、實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

1.實(shí)驗(yàn)儀器

Olympus CX21光學(xué)顯微鏡、80-1臺(tái)式電動(dòng)離心機(jī)、-80℃超低溫冰箱、酶標(biāo)儀、全自動(dòng)洗板機(jī)、液體快速混合器、微型混合器、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、微波爐、各型加樣器。

2.實(shí)驗(yàn)試劑

兔抗人LI-cadherin一抗、羊抗兔共同二抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）、PBS緩沖液、檸檬酸緩沖液、3%H2O2等。人LI-cadherin ELISA檢測(cè)試劑盒（美國(guó)RD公司）等。

四、研究方法

1.標(biāo)本留取

免疫組織化學(xué)法所需組織取自胃鏡下和（或）外科手術(shù)，胃鏡所取黏膜標(biāo)本大小約2 mm×2 mm×1 mm，外科手術(shù)所取組織標(biāo)本大小約1.5 cm×1.5 cm×1.0 cm，標(biāo)本均用10%甲醛溶液固定，低溫包埋。

ELISA法所需血清取自入選者在門診或入院次日晨采空腹肘靜脈血2 mL，EDTA抗凝，標(biāo)本在采集后30 min內(nèi)置于4 000 rpm離心15 min，分離上清液（溶血者、脂血者棄去），置于-70℃保存，標(biāo)本反復(fù)凍融不超過(guò)3次。

2.免疫組織化學(xué)SP法

EnVisionTM二步法免疫組織化學(xué)染色。

五、統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以x±s或 M（Q1,Q3）表示，采用 F檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以%表示，采用χ2檢驗(yàn)；等級(jí)分類資料采用秩和檢驗(yàn)。相關(guān)性分析選用Spearman相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、LI-cadherin 在 RE、BE1、BE2、BE3、EA、GIM組織中表達(dá)

BE2、BE3組中的表達(dá)高于正常組、RE 組、BE1組和EA組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。BE2組與GIM組中的表達(dá)相似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-0.355，P=0.723）， 而GIM 組明顯高于 BE1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-2.711，P=0.007），見圖 1、表 1。

圖1 病理切片LI-cadherin免疫組化

表1 LI-cadherin在組織中的表達(dá) [n（%）]

二、LI-cadherin 在 RE、BE1、BE2、BE3、EA、GIM血清中表達(dá)

BE1、BE2、BE3組中的表達(dá)高于正常組、RE 組、EA組，在BE2、BE3組中的表達(dá)高于BE1組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。BE2組與GIM組中的表達(dá)相似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-0.704，P=0.481），而GIM組明顯高于BE1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-3.378，P=0.001），見表 2。

三、LI-cadherin在組織和血清中的表達(dá)相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析顯示，LI-cadherin血清中含量與組織中表達(dá)存在正相關(guān)關(guān)系 （rs=0.746，P=0.000），見圖 6。

四、EA組織中LI-cadherin表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

EA組織中LI-cadherin在TNM分期Ⅲ+Ⅳ期的表達(dá)低于 Ⅰ+Ⅱ期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.014），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的表達(dá)低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，低分化者的表達(dá)低于高、中分化者，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

表2 LI-cadherin在血清中的表達(dá) M（Q1,Q3）

圖2 ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)定LI-cadherin濃度時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=3.9023x2+4.5503x-0.2579,R2=0.9955）

表3 EA組織中LI-cadherin表達(dá)與臨床病理關(guān)系

五、EA血清中LI-cadherin表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

EA血清中LI-cadherin在TNM分期Ⅲ+Ⅳ期的表達(dá)低于Ⅰ+Ⅱ期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.001），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的表達(dá)低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，低分化者的表達(dá)高于高、中分化者，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表4。

表4 EA血清中LI-cadherin蛋白表達(dá)與臨床病理關(guān)系

討 論

近年來(lái)GERD的發(fā)病率逐年上升，其并發(fā)癥BE也隨著上升。我國(guó)EA（約占食管癌的22%）的發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)。早期診療是提高EA治療效果最為有效的方法。準(zhǔn)確診斷BE，是降低EA發(fā)生的前提。目前內(nèi)鏡檢查加病理活檢仍是BE診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，免疫組化染色已成為重要的輔助方法。需在加強(qiáng)內(nèi)鏡檢查技術(shù)發(fā)展的同時(shí)，將標(biāo)志物的研究提上日程。

LI-cadherin是Jaccobs實(shí)驗(yàn)室于1997年發(fā)現(xiàn)的鈣粘蛋白家族中一員，正常情況下，其限制性的表達(dá)在極化的腸上皮細(xì)胞中（肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞和杯狀細(xì)胞），而在食管和胃黏膜上皮中不表達(dá)[4]。研究示：在正常食管黏膜及食管炎中無(wú)表達(dá)，在BE中表達(dá)增高，LI-cadherin可作為BE診斷的早期標(biāo)志[5-6]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)患者組織中的LI-cadherin表達(dá)情況，可以區(qū)別BE伴腸化生、BE伴不典型增生與正常食管黏膜、RE、BE不伴腸化生、EA。檢測(cè)血清中的含量，尚可區(qū)別EA與BE不伴腸化生；提示運(yùn)用ELISA法檢測(cè)尚可區(qū)分BE不伴有腸化生與BE伴有腸化生。Weimann A等研究表明LI-cadherin在BE、不典型增生中表達(dá)逐漸上調(diào)，在輕度不典型增生及重度不典型增生中無(wú)明顯差別，而在EA表達(dá)又趨下降[3]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與其一致，其具體機(jī)制有待后續(xù)研究。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)顯示血清中的LI-cadherin含量與組織中表達(dá)存在正相關(guān)關(guān)系。故認(rèn)為血清中的含量可以反映其組織中的水平，其有望作為檢測(cè)BE、EA的生物學(xué)標(biāo)志物。

已經(jīng)證實(shí)GIM是胃癌的癌前病變。對(duì)于BE不伴有腸化生組與BE伴有腸化生組發(fā)展為EA的風(fēng)險(xiǎn)有無(wú)區(qū)別一直存在爭(zhēng)議[7]。本實(shí)驗(yàn)顯示通過(guò)檢測(cè)LI-cadherin在組織中及血清中的表達(dá)及含量，可以區(qū)別BE伴有腸化生與BE不伴有腸化生，認(rèn)為BE伴有腸化生可能與GIM的癌變一樣，為癌前病變，而不支持BE不伴有腸化生是EA的癌前病變。

LI-cadherin在不同類型腫瘤中的表達(dá)存在差異。在EA中低表達(dá)或不表達(dá)[6]。本實(shí)驗(yàn)研究提示，檢測(cè)EA患者LI-cadherin的表達(dá)情況及含量，可以區(qū)別其TNM的分期。但對(duì)于其有無(wú)淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移及其分化程度與LI-cadherin的關(guān)系，尚需進(jìn)一步研究；其表達(dá)情況及含量與患者的年齡、性別無(wú)關(guān)。

LI-cadherin在正常食管黏膜、RE表達(dá)較低，在BE不伴有腸化生、BE伴有腸化生、BE伴有不典型增生中逐漸增強(qiáng)，EA呈低表達(dá)或不表達(dá)，表明其功能發(fā)生紊亂，促使食管黏膜從正常逐漸進(jìn)展為EA。

在EA的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，促使、抑制腫瘤發(fā)生的因素是多重的，涉及眾多分子之間的相互作用及與機(jī)體、環(huán)境之間的作用。本研究結(jié)果在一定程度上為EA的早期診斷提供組織學(xué)、血清學(xué)依據(jù)。

但本實(shí)驗(yàn)中納入的EA例數(shù)較少，有待于后期大樣本、雙盲、多中心的研究，應(yīng)用PCR法檢測(cè)新鮮組織中LI-cadherin含量，從基因水平研究其變化與EA發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，尋找可能的分子生物學(xué)機(jī)制。進(jìn)一步闡明BE伴有腸化生為EA的癌前病變，從而指導(dǎo)BE臨床的診治及隨訪。

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