羧甲司坦對人氣道上皮細胞炎癥的影響及調(diào)控機制研究

郭瑩，康健，柴文戍，潘殿柱，車麗燕，王榮，李靖，閻雪，安曉琴

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 呼吸科，遼寧 錦州 121001；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一院 呼吸疾病研究所，遼寧 沈陽 110001）

氣道上皮細胞是抵御外界環(huán)境刺激物的第一道防線，吸入的香煙煙霧首先與之接觸，引起氣道和肺部的炎癥反應(yīng)，釋放各種炎癥介質(zhì)和細胞因子。其中白細胞介素8（Interleutin-8，IL-8）是最為重要的細胞因子，是迄今發(fā)現(xiàn)的最強的中性粒細胞趨化因子，是中性粒細胞活化的標(biāo)志。此外還有腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-6、IL-10等也與炎癥過程有密切關(guān)系[1]。其能有效地激活細胞內(nèi)途徑（即NF-κB和其他信號），導(dǎo)致疾病的演變和各種相關(guān)癥狀的產(chǎn)生[2]。

羧甲司坦除了作為一種臨床常用的黏液調(diào)節(jié)劑[3]，還具有顯著的抗炎作用。研究發(fā)現(xiàn)，含半胱氨酸的藥物，如羧甲司坦和N-乙酰半胱氨酸等能夠減少促炎細胞因子（TNF-α、IL-6、IL-8）的產(chǎn)生[4]。已有大量的基礎(chǔ)和臨床研究證實，羧甲司坦的抗炎作用比其本身的祛痰作用更為顯著。近年的臨床研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用羧甲司坦可明顯減少慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmoriary disease，COPD）患者的急性加重，延長發(fā)作間歇[5]。但國外同等規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查顯示應(yīng)用祛痰類藥物效果不明顯，分析2者之間的差異，發(fā)現(xiàn)國外COPD患者基礎(chǔ)常規(guī)應(yīng)用吸入性糖皮質(zhì)激素，而我國PEACE研究中入選的COPD患者中僅有16.7%不規(guī)律應(yīng)用吸入性糖皮質(zhì)激素。由此推測合用吸入性糖皮質(zhì)激素可能是差異產(chǎn)生的重要原因。眾所周知，糖皮質(zhì)激素具有全身抗炎作用，尤其是吸入糖皮質(zhì)激素已被廣泛應(yīng)用于臨床治療哮喘及COPD患者。那么，糖皮質(zhì)激素充分抗炎的“天花板效應(yīng)”是否就是羧甲司坦未能發(fā)揮作用的原因呢？糖皮質(zhì)激素影響羧甲司坦發(fā)揮作用的機制又是什么呢？因此，本研究旨在通過體外細胞實驗證明：羧甲司坦的抗炎機制可能與糖皮質(zhì)激素存在重疊，基礎(chǔ)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素者由于占用了相同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路使某些炎癥靶點受抑制，故再聯(lián)合應(yīng)用羧甲司坦時效果不佳。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

羧甲司坦、布地奈德（杭州寶侖生物公司），標(biāo)準研究用煙（1R3F，美國肯塔基大學(xué)），RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Hyclone公司），胎牛血清、青鏈霉素混合液（北京Solarbio公司），EGF（美國Pepro Tech公司），PD98059（美國 Selleck公司），MTT、DMSO（美國Sigma公司），ELISA試劑盒（美國R&D公司），ERK、p-ERK、IκBα、p-IκBα抗體（英國Abcam公司），二抗（羊抗小鼠、羊抗兔）（北京中杉金橋公司），β-actin、ERK、NF-κB引物（上海生工公司），無水RNA酶（美國Thermo公司），RNAiso Plus（日本TaKaRa公司），實時聚合酶鏈反應(yīng)（real-time PCR）試劑盒（日本TaKaRa公司），CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific HERA cell 150i），酶標(biāo)儀（美國Bioteck公司），電泳儀（美國Bio-Rad公司），PCR儀（英國Techne公司），實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）儀（TP800，日本TaKaRa公司）。

1.2 人氣道上皮細胞培養(yǎng)、煙霧提取液制備及分組

1.2.1 人氣道上皮細胞株（16HBE細胞） 購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細胞庫。

1.2.2 煙霧提取物的制備 參照文獻[6]方法，點燃一支香煙用50 ml注射器連續(xù)抽吸，香煙燃燒速度約為5 min/支，吸入的煙霧經(jīng)三通管緩慢注入盛有10 ml RPMI 1640培養(yǎng)液的密封瓶中制成懸液，搖晃使其充分溶解，調(diào)定至pH 7.4。經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾除菌，存于冰中。制備的（cigarette smoke extract，CSE）濃度設(shè)定為100.00%，稀釋不同濃度的CSE 30 min內(nèi)用于實驗。

1.2.3 分組 分別給予不同干預(yù)因素，24 h后收集細胞用于實驗。①對照組（N組）：正常培養(yǎng)細胞。②模型組（CN組）：細胞培養(yǎng)液中加入CSE。③羧甲司坦組（CC組）：細胞培養(yǎng)液中加入CSE和10～4 M羧甲司坦。④布地奈德組（CB組）：細胞培養(yǎng)液中加入CSE和10～8 mol/L布地奈德。⑤聯(lián)合組（CCB組）：先加布地奈德處理細胞1 d后再加羧甲司坦干預(yù)。⑥抑制劑組（CNP組）：細胞培養(yǎng)液中加入CSE和100 μmol/L ERK1/2抑制劑PD98059。⑦激動劑組（CCE組）：在羧甲司坦組基礎(chǔ)上加入10 ng/ml ERK1/2激動劑EGF。

1.3 MTT法檢測不同濃度CSE對細胞生存率的影響

收集對數(shù)期細胞，鋪板，孵育至細胞單層鋪滿孔底，加入不同濃度CSE（分別為80.00%、40.00%、20.00%、10.00%、5.00%、2.50%、1.25%、0.63% 和0.00%），分別于干預(yù)后1、3、6、12、24和48 h處理細胞。每孔加入20 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h終止培養(yǎng)，每孔加入150 μl二甲基亞砜，搖床振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測吸光度。終吸光度A值=A570 nm-A630 nm，細胞生存率（%）=A加藥孔/A對照孔×100%。

1.4 ELISA檢測炎癥因子IL-8、IL-6水平的變化

準備試劑、樣本，按比例稀釋標(biāo)準品；加樣（標(biāo)準品及樣本）各100 μl，室溫孵育2 h；吸棄，洗板4次；加酶標(biāo)檢測抗體200 μl，室溫孵育2 h；吸棄，洗板4次；加顯色底物200 μl，室溫孵育30 min；加終止液50μl，450 nm波長酶標(biāo)儀測量OD值，540 nm作為校正波長。

1.5 Western blot檢測ERK、p-ERK、IκBα、p-IκBα蛋白水平的變化

RIPA裂解液（RIPA 75%、PMSF 10%、cocktail 15%）裂解細胞，離心取上清液采用BCA法測定蛋白濃度。與上樣緩沖液混合后上樣，SDS-PAGE（10%分離膠，5%濃縮膠）電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。與一抗多克隆抗體ERK、p-ERK、IκBα、p-IκBα孵育，4℃過夜。加入1︰2 500稀釋的二抗室溫下孵育，洗膜后顯色，于凝膠自動成像分析系統(tǒng)下成像，采用Image J圖像分析軟件對條帶進行灰度值測定。

1.6 qRT-PCR檢測ERK、NF-κB mRNA水平的變化

Trizol法提取細胞總RNA，按cDNA合成試劑盒說明配置反應(yīng)體系，在PCR儀中37℃ 15 min，85℃ 5 s逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以此為模板分別加入NF-κB、ERK1/2、β-actin的引物（β-actin-F：5'-ATAGCACA GCCTGGATAGCAACGTAC-3'；β-actin-R：5'-CACC TTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3'；ERK1/2-F：5'-CAACGTGCTCCACCGAGAT-3'；ERK1/2-R：5'-TCA TGCTCAGGATCGGCAAT-3'；NF-κB-F：5'-CAATCGT GCCCCCAACACT-3'；NF-κB-R ：5'-GTCCTCTTTC TGCACCTTGTCAC-3'）和熒光染料在qRT-PCR儀上進行擴增，95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火/延伸30 s，40個循環(huán)?；蛳鄬Ρ磉_量以2-ΔΔCt法分析。即ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）實驗組-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）對照組。各組之間的表達差異用 2-ΔΔCt表示。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準差（±s）表示，多組樣本間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同時間不同濃度CSE對HBE細胞生存率的影響

CSE濃度在0.63%～5.00%時，對HBE細胞的抑制作用輕微，不同時間點差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。隨著CSE濃度的升高，HBE細胞的生存率呈下降趨勢。CSE濃度在10.00%～80.00%，隨著作用時間的延長，細胞生存率降低，細胞大量死亡，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。故本實驗選擇5.00% CSE進行以下實驗。見圖1和表1。

圖1 不同濃度CSE對HBE細胞生存率的影響

表1 不同濃度CSE作用下不同時間HBE細胞的生存率 （%，±s）

表1 不同濃度CSE作用下不同時間HBE細胞的生存率 （%，±s）

濃度 1 h 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h F值 P值0.63% 99.54±0.44 99.27±1.08 99.22±0.95 99.30±0.36 98.90±1.23 99.30±0.78 0.128 0.968 1.25% 92.21±1.75 92.94±2.02 94.88±2.91 94.97±1.55 95.57±1.87 92.97±1.50 1.443 0.278 2.50% 93.52±14.93 91.39±47.32 100.00±37.29 95.44±2.82 95.02±3.06 95.73±2.49 0.053 0.998 5.00% 88.41±14.46 90.14±15.42 95.23±24.60 90.32±4.46 85.61±3.72 87.80±2.53 0.198 0.960 10.00% 89.00±13.56 94.62±13.94 90.14±15.42 95.23±24.60 28.68±10.81 9.18±3.00 24.822 0.000 20.00% 77.73±19.47 91.24±26.46 78.81±18.00 4.25±8.30 6.29±3.79 8.67±5.41 15.826 0.000 40.00% 66.21±4.84 80.33±27.84 51.76±12.60 40.38±14.47 5.50±1.74 7.83±3.00 14.993 0.000 80.00% 53.21±8.44 54.46±7.16 25.49±5.91 18.40±4.13 5.95±1.77 8.47±2.61 50.898 0.000

2.2 細胞上清中IL-8、IL-6水平

通過ELISA法檢測細胞上清中炎癥因子水平結(jié)果顯示，CN組IL-8、IL-6水平均較N組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），CC組、CB組及CCB組上述指標(biāo)均較模型組有所降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但3組IL-8、IL-6水平作兩兩比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2和圖2、3。

表 2 細胞上清中 IL-8、IL-6 水平 （pg/ml，±s）

表 2 細胞上清中 IL-8、IL-6 水平 （pg/ml，±s）

組別 IL-8 IL-6 N組 254.67±29.32 241.73±30.88 CN組 608.76±71.55 602.12±11.57 CC 組 361.60±42.70 466.21±39.60 CB 組 373.05± 30.13 481.73±7.80 CCB 組 400.40±14.66 464.72±49.18 F值 28.110 49.650 P值 0.000 0.000

圖2 細胞上清中IL-8水平

圖3 細胞上清中IL-6水平

2.3 不同藥物干預(yù)對HBE細胞ERK、IκBα磷酸化的影響

與N組比較，CN組HBE細胞p-ERK、p-IκBα蛋白表達均增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.041，P=0.000）；CC組、CB組及CCB組上述指標(biāo)較CN組均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p-ERK：3組t=3.355、2.306和 2.896，P=0.004、0.023和 0.012；p-IκBα：3組t=2.896、2.764和2.228；P=0.012、0.015和0.020）；CC組與CB組P-ERK比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.013，P=0.034），CCB組與CB組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；p-IκBα蛋白表達給藥的3組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖 4、5。

2.4 PD98059、EGF對HBE細胞ERK磷酸化的影響

與N組比較，CN組HBE細胞p-ERK表達增強（t=2.718，P=0.016），分別給予羧甲司坦、PD98059干預(yù)后p-ERK均降低（t=1.999和2.201，P=0.038和0.022），而給予EGF干預(yù)后，p-ERK的表達CN組與CC組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.812，P=0.041），CN組有所回升。見圖6。

圖4 p-ERK蛋白表達

與N組比較，CN組細胞ERK、NF-κB mRNA表達均增高（t=2.262和1.940，P=0.025和0.031）；分

2.5 各組細胞ERK、NF-κB mRNA水平的變化

別給予羧甲司坦、布地奈德、兩藥聯(lián)合及PD98059干預(yù)后 ERK mRNA（t=1.999、1.940、1.895和 2.896，P=0.038、0.030、0.045和0.011）及NF-κB mRNA（t=1.812、2.005、1.857 和 2.998，P=0.042、0.036、0.043和0.009）表達水平降低，而給予EGF干預(yù)后ERK和NF-κB mRNA CN組與CC組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.764和2.228，P=0.015和0.021），CN組有所回升。見圖7、8。

圖5 p-IκBα蛋白表達

圖6 PD98059、EGF對ERK磷酸化的影響

圖7 ERK mRNA水平

圖8 NF-κB mRNA水平

3 討論

CSE是從香煙煙霧中提取的溶于細胞培養(yǎng)基的物質(zhì)，其中含有丙烯醛、尼古丁、煙堿、焦油和活性氧（ROS）等成分，目前廣泛用于體外實驗中以研究香煙在細胞水平的作用[7-9]。本研究采用MTT法檢測不同濃度CSE對HBE細胞生存率的影響，發(fā)現(xiàn)隨著CSE濃度的升高，HBE細胞的生存率呈下降趨勢。CSE濃度在0.63%～5.00%時，對HBE細胞的抑制作用輕微，不同時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。而CSE濃度在10.00%～80.00%時，隨著作用時間的延長，細胞生存率降低，細胞大量死亡。

香煙煙霧中含有的大量有害物質(zhì)，能夠?qū)獾篮头谓M織造成直接損傷，促進氣道炎癥，活化氣道上皮細胞，產(chǎn)生并釋放炎癥介質(zhì)。TNF-α、IL-8及IL-6是COPD重要的炎癥介質(zhì)，其來源廣泛，以支氣管上皮細胞和肺泡巨噬細胞產(chǎn)生為主，在COPD的發(fā)病機制中起重要作用。本研究結(jié)果表明，HBE細胞給予CSE干預(yù)后，其炎癥因子IL-8、IL-6水平升高，而羧甲司坦、布地奈德及聯(lián)合組均能不同程度降低上述炎癥因子的水平，3個藥物干預(yù)組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，證明CSE能夠誘導(dǎo)炎癥因子水平的升高，羧甲司坦抑制氣道炎癥的作用與布地奈德相近，兩藥聯(lián)合應(yīng)用未能進一步提高控制炎癥的作用。

已有體外實驗證明，香煙煙霧提取物（CSE）引起IL-8等炎癥因子的釋放與ERK和NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活有關(guān)[10-12]。細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）作為MAPK通路的一部分，是將信號從表面受體傳導(dǎo)至細胞核的關(guān)鍵。其包括ERK1和ERK2 2個亞型，統(tǒng)稱為ERK1/2。磷酸化激活的ERKl/2由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，進而介導(dǎo)ELK-1、NF-κB、AP-1等轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活化，參與細胞增殖與分化、細胞凋亡和惡變過程，并參與應(yīng)激刺激、細菌產(chǎn)物和炎癥介質(zhì)等引起的生物學(xué)反應(yīng)，這表明ERK通路的激活與炎癥反應(yīng)有著密切關(guān)系[13-15]。作為ERK通路的特異性抑制劑，PD98059通過特異性地抑制其上游激酶MEK1/2，進而抑制ERK1/2的激活與磷酸化。而EGF是研究常用的ERK通路的激動劑。本研究應(yīng)用ERK通路的激動劑和抑制劑研究羧甲司坦的作用機制，結(jié)果顯示CSE刺激下的HBE細胞p-ERK蛋白及ERK mRNA表達增高，分別給予羧甲司坦、布地奈德、兩藥聯(lián)合及PD98059干預(yù)后上述指標(biāo)均降低，而給予EGF干預(yù)后p-ERK及ERK mRNA較羧甲司坦組有所回升，證明羧甲司坦能夠通過調(diào)控ERK的磷酸化發(fā)揮其抗炎作用。同時，本實驗也觀察到，糖皮質(zhì)激素同樣參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)ERK-MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而抑制炎癥介質(zhì)，這與CLARK等[15]報道一致。

NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是炎癥反應(yīng)的另1個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是體內(nèi)多條信號途徑的共同交匯點。它在肺組織炎癥反應(yīng)進展中起著核心地位，其活化及過度表達可造成機體細胞因子失衡，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的級聯(lián)放大效應(yīng)[16-17]。NF-κB是由2個亞基組成的同源二聚體或異源二聚體，其最常見的活性形式是由P65和P50組成的異源二聚體[18]。通常狀態(tài)下，NF-κB與其抑制因子IkBα螯合在細胞漿內(nèi)。當(dāng)機體受到內(nèi)毒素、TNF-α、細菌、病毒等刺激時，IkBα迅速發(fā)生磷酸化，NF-κB被激活進入細胞核，與目標(biāo)基因啟動子結(jié)合并調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄[19]。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB的最初激活發(fā)生在肺泡巨噬細胞中，隨后有活化的炎癥因子進一步激化氣道上皮細胞等周圍細胞[21]。目前研究普遍認為NF-κB與COPD病情嚴重程度相關(guān)[20-23]。已有研究證實，糖皮質(zhì)激素在調(diào)節(jié)NF-κB的活性中發(fā)揮了重要作用[24-25]。本研究中發(fā)現(xiàn)，羧甲司坦亦能降低CSE誘導(dǎo)的p-IκBα蛋白及NF-κB mRNA表達水平，且與布地奈德及聯(lián)合組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明羧甲司坦的調(diào)控作用至少部分是通過NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進行的，這可能與糖皮質(zhì)激素的作用機制存在重疊。

綜上所述，羧甲司坦能夠抑制香煙煙霧提取物誘導(dǎo)的氣道炎癥。羧甲司坦和布地奈德均能通過抑制ERK和NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路減輕香煙所致的氣道炎癥，這說明2者的作用機制存在重疊部分，因此基礎(chǔ)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素后，由于其抑制相同的炎癥靶點，再聯(lián)合羧甲司坦時未能體現(xiàn)其應(yīng)有的作用，或者由于2者之間對于作用位點的競爭拮抗甚至削弱了其原本的療效。這些尚有待于進一步的深入研究。

參 考 文 獻：

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