高效液相色普法測定兔灌胃后血清中百草枯濃度及其變化特征*

黃曉亮，李映新，凌家杰，黨毅，劉金遠，姚佩珊，顏池，雷卓青

（1.廣西醫(yī)科大學藥學院，廣西 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，廣西 南寧530021；3.廣西醫(yī)科大學全科學院，廣西 南寧 530021；4.廣西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院西院 急診科，廣西 南寧 530007）

百草枯（Paraquat PQ）為農(nóng)業(yè)上廣泛使用的除草劑，其有效的化學成分為1，1’-二甲基-4，4’-聯(lián)吡啶二氯物，對人畜具有很強的毒性和腐蝕性，極容易通過皮膚、呼吸道、消化道吸收，由于操作不當造成的急性中毒事件屢有發(fā)生，目前尚無特效解毒劑，死亡率極高，口服中毒死亡率可高達90%左右[1-2]。國外有學者確證了血液、尿液中百草枯濃度與中毒預后的相關(guān)性[3]。賈麗君等[4]通過對88例患者臨床資料回顧性分析也發(fā)現(xiàn)，服毒量、毒物血藥濃度是決定預后的強危險因素，但未對中毒后不同時間所測的血藥濃度進行對比。本文探索高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定新西蘭家兔灌胃百草枯后其血清濃度的可行性，并觀察在不同劑量百草枯灌胃后72 h內(nèi)血藥濃度的經(jīng)時變化情況，為臨床治療百草枯中毒提供實驗參考資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

普通級健康成年白色新西蘭家兔12只，雄性，體重（2.5±0.5）kg，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2 儀器及試劑

島津LC-20AB高效液相色譜儀（日本島津公司），包含：SPD-20A紫外檢測器，SIL-20AC自動進樣器，SUS 20A混合器，CTO-20AC 柱溫箱；超聲清洗器（德國Bandel公司），高速冷凍離心機（德國Heraeus公司），電子分析天平（梅特勒-托利多204型）。百草枯對照品（純度為99.4%，北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司，批號20150629），乙腈（色譜純，美國天地公司）；三氟乙酸（色譜純，美國Sigma公司），庚烷磺酸鈉（Ultra pure上海源葉生物科技有限公司，批號T23M6C1），實驗用水為娃哈哈純凈水。

1.3 HPLC檢測方法的建立

1.3.1 對照品溶液配制 精密稱取百草枯對照品適量于容量瓶中，加純凈水定容后混勻，得濃度為1.0 mg/ml的對照品溶液，儲存于4℃冰箱中，使用前逐級稀釋。

1.3.2 色譜條件 色譜柱：ZORBAX300SB-C18（250.0 mm×4.6 mm，5μm），流動相為0.1 mol/L磷酸緩沖液（含12.5 mmol/L庚烷磺酸鈉）-乙腈（90︰10，TFA調(diào)pH=2.8）；流速為1.0 ml/min；檢測波長為258 nm；柱溫為30℃。

1.3.3 樣品處理 取血清樣品5 000 r/min離心5 min，取上清液0.5 ml置試管中，加入0.5 ml乙腈，漩渦1 min，低溫高速12 000 r/min離心5 min，取上清液于0.22μm濾膜過濾，20μl進樣。

1.3.4 標準曲線 用空白血清分別配制0.195、0.391、0.781、1.563、3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 及100.000 mg/L的百草枯血清標準系列液，分裝后于-20℃保存?zhèn)溆谩悠诽幚砗鬁y定各濃度的曲線下面積（A）。

1.3.5 專屬性考察 分別取兔空白血清、兔空白血清+百草枯對照品溶液、待測兔血清按照上述樣品處理方法進樣，考察是否存在內(nèi)源性物質(zhì)干擾百草枯測定。

1.3.6 回收率考察 取兔空白血清，加入一定量百草枯對照品溶液，配制成濃度為0.50、5.00及50.00 mg/L的樣品，樣品處理后進行測定，按照標準曲線計算濃度與實際配制濃度比較，計算相對回收率。

取兔空白血清，加入一定量百草枯對照品溶液，配制成濃度為0.50、5.00及50.00 mg/L的樣品，樣品處理后進行測定，記錄百草枯峰面積，作為百草枯血清峰面積。另取百草枯對照品溶液，配制0.5、5.0及50.0 mg/L 3個濃度，各取20μl進樣，記錄峰面積。計算百草枯血清峰面積和對照品溶液峰面積比值，作為絕對回收率。

1.3.7 精密度考察 取空白血清，加入一定量百草枯對照品溶液，配制成濃度為0.50、5.00及50.00 mg/L的樣品，樣品處理后進行測定，每個濃度平行測定6次，連續(xù)測定3 d，分別考察日內(nèi)和日間精密度。

1.4 兔百草枯急性中毒模型的復制及血清藥物濃度測定

12只新西蘭家兔按照隨機數(shù)字表法分為兩組，每組6只，分別灌胃給予100 mg/kg（高劑量組）和20 mg/kg（低劑量組）百草枯，于藥后1、2、5、12、24、48及72 h用不加抗凝劑的普通采血管通過中耳動脈采集血液。各管血液在室溫放置3 h后收集血清，進行樣品處理，所得峰面積代入標準曲線計算血清百草枯濃度。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用PSAW Statistics 18.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，不同時間點的比較采用重復測量設(shè)計的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 標準曲線

以百草枯濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得線性方程為Y=41 020X+25 621（r=0.999），表明百草枯在0.20～100.00 mg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低檢測限為0.2 mg/L。見圖1。

2.2 專屬性考察結(jié)果

實驗結(jié)果表明，百草枯保留時間在6.5 min，血清的內(nèi)源性物質(zhì)對百草枯色譜峰無干擾，分離較好。見圖2。

2.3 回收率考察結(jié)果

采用該法測定的相對回收率在97.82%～101.20%之間，絕對回收率在84.37%～88.80%之間。見表1。

2.4 精密度考察結(jié)果

采用該法測定的日內(nèi)和日間精密度（RSD）均在5%以內(nèi)，結(jié)果見表2。

2.5 不同劑量百草枯兔灌胃后其血清濃度的變化情況

無論是高劑量組還是低劑量組，百草枯通過胃腸吸收約2 h后，其血清中的藥物濃度達到峰值，之后逐漸下降，其中，高劑量組于給藥后72 h后檢測不出，低劑量組于藥后24 h檢測不出；高劑量組（100 mg/kg）給藥后5、12、24及48 h血清藥物濃度分別下降至峰值的32.91%、11.06%、5.96%及2.98%，給藥后72 h后檢測不出百草枯；低劑量組（20 mg/kg）給藥后5和12 h血清藥物濃度分別下降至峰值的40.32%和11.83%，給藥后24 h檢測不出百草枯。見圖3。

圖1 血清百草枯標準曲線

圖2 兔血清中百草枯的HPLC圖譜

結(jié)果顯示，①不同時間點間的百草枯濃度差異有統(tǒng)計學意義（F=221.627，P=0.000）；②高劑量組與低劑量組的百草枯濃度差異有統(tǒng)計學意義（F=133.618，P=0.000）；③高劑量組與低劑量組百草枯濃度的變化趨勢差異有統(tǒng)計學意義（F=81.874，P=0.000）。見表 3。

表1 家兔血清中百草枯的回收率 （n =6，%）

表2 家兔血清中百草枯的精密度 （n =6）

圖3 不同劑量百草枯兔灌胃后其血清濃度的變化

表3 不同劑量百草枯兔灌胃后在血清中的濃度-時間變化 （n =6，mg/L，±s）

表3 不同劑量百草枯兔灌胃后在血清中的濃度-時間變化 （n =6，mg/L，±s）

注：-為未檢測出水平

百草枯的濃度1 h 2 h 5 h 12 h 24 h 48 h 72 h高劑量組 4.90±1.08 7.05±0.50 2.32±0.94 0.78±0.20 0.42±0.12 0.21±0.09 -低劑量組 0.85±0.25 1.86±0.53 0.75±0.28 0.22±0.12 - - -組別

3 討論

百草枯中毒為急診科常見病例，并有逐年增多的趨勢[5]。百草枯經(jīng)皮膚、消化道和呼吸道吸收，毒性累及全身多個臟器，嚴重時可導致多器官功能障礙綜合征（MODS），早期表現(xiàn)為急性肺損傷（ALI）或急性呼吸窘迫綜合征（ARDS），后期出現(xiàn)肺泡內(nèi)和肺間質(zhì)纖維化，是百草枯中毒致死的主要原因，目前尚無特效解毒劑，死亡率極高[2，6]。研究發(fā)現(xiàn)[3，7]，急性中毒患者的血中百草枯的濃度與預后生存率有關(guān)，建立能夠快速、準確檢測出血液中百草枯濃度的方法，可為臨床醫(yī)生診斷病情，判斷預后以及采取適宜急救措施提供幫助。

目前，對百草枯的檢測方法主要有氣相色譜法[8]、HPLC法[9-12]、分光光度法[13]等，其中HPLC法以其設(shè)備不算昂貴及高效、敏感性高、操作自動化的特點成為臨床常用的檢測百草枯的方法。

雖然已有采用HPLC法測定生物血液百草枯含量的報道，但在具體方法選擇及柱子、流動相、樣品的預處理方法等方面有一定差異[9-12]。

本文采用反相離子對HPLC，選用ZORBAX300SB-C18柱具有耐低pH的優(yōu)點，尤其適用于采用pH偏低的流動相分離在酸性溶液穩(wěn)定的百草枯。流動相采用磷酸鹽緩沖溶液作為水相，加入12.5 mmol/L的庚烷磺酸鈉作離子對試劑，改變百草枯極性。流動相的比例上，減少了有毒的有機相乙腈的使用比例，用TFA調(diào)pH至2.8，進樣檢測時間10 min內(nèi)完成，并獲得較好的峰形。在樣品預處理上，以往有文獻報道采用30%高氯酸、乙腈和二氯甲烷依次處理沉淀蛋白，雖然無雜峰干擾，但處理步驟繁瑣，樣品損失多[8]；或采用35%高氯酸沉淀蛋白，雖然步驟簡單，但所得圖譜雜質(zhì)峰干擾較多[9]。采用乙腈直接沉淀蛋白的方法，同樣簡便快捷，且沉淀完全，在檢測中未見有明顯雜峰干擾。經(jīng)過本法測定百草枯在0.20～100.00 mg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999）。相對回收率在97.82%～101.20%之間，絕對回收率在84.37%～88.80%之間，日內(nèi)和日間RSD＜5%。

本研究還觀察不同劑量百草枯兔灌胃后其血清中的濃度隨時間變化情況，結(jié)果顯示血清中百草枯的濃度隨時間的變化趨勢及高、低劑量組隨時間變化趨勢的不同。無論是高劑量組還是低劑量組，百草枯通過胃腸吸收約2 h后，其血清中的藥物濃度達到峰值，之后逐漸下降，其中，高劑量組于給藥后72 h后檢測不出，低劑量組于藥后24 h檢測不出。重復測量設(shè)計的方差分析結(jié)果顯示，血清中的百草枯濃度有隨時間變化和組別變化的趨勢并且時間因素的作用隨著分組的不同而不同。說明百草枯的血藥濃度和蓄積的時間與劑量有關(guān)。本結(jié)果與以往學者認為，服毒劑量是影響預后強因素的觀點是一致的[7，14-15]。其次，百草枯灌胃后2 h左右即達最大濃度，說明救治時間非常重要，假如能及時就診進行救治，降低百草枯的血藥濃度，則可延長患者的生存率，這與臨床上關(guān)于百草枯越早治療越有效，中毒后2 h為黃金時期，盡可能在中毒后5 h內(nèi)全方位治療的結(jié)論相符[14，16]。

實驗結(jié)果表明，所建立方法的專一性、回收率和精密度均符合規(guī)定，測定結(jié)果準確，可為研究測定血清中百草枯濃度提供一種檢測方法。

參 考 文 獻：

[1] 時純炎, 于秀勤, 李凌. 急性百草枯中毒患者的救治和護理體會[J]. 安徽醫(yī)藥, 2016, 37(7): 896-898.

在臨床上，在排除其他原因的前提下，糖尿病患者出現(xiàn)與周圍神經(jīng)功能障礙有關(guān)的癥狀或體征，且以四肢遠端感覺障礙為主要表現(xiàn)的病癥，即為糖尿病周圍神經(jīng)病變[1]。該病癥是糖尿病患者的嚴重并發(fā)癥，其可誘發(fā)壞疽、潰瘍、患肢感染等，嚴重時還可造成患者截肢，因此及早診斷和治療意義重大[2]。本文選取我院收治的糖尿病患者50例，按照其有無周圍神經(jīng)病變分為觀察組1和觀察組2，同期選擇健康體檢者25例為對照組，即對高頻超聲在診斷糖尿病周圍神經(jīng)病變中的應用價值進行了探討，現(xiàn)報道如下。

[2] 唐文杰, 孫海晨, 許寶華, 等. 急性百草枯中毒的急救體會[J].醫(yī)學研究生報, 2008, 21(4): 394.

[3] SENARATHNA L, EDDLESTON M, WILKS M F, et al. Prediction of outcome after paraquat poisoning by measurement of the plasma paraquat coneentration[J]. QJM, 2009(102): 251-259.

[4] 賈麗君, 徐凌哲, 郭燕. 影響百草枯中毒預后的因素分析[J]. 河北醫(yī)藥, 2016, 38(7): 1010-1012.

[5] 陳桂喜. 百草枯中毒的治療進展[J]. 醫(yī)學綜述, 2013, 19(11):2023-2025.

[6] 陳國杰, 宋彩霞, 趙新義, 等. 大黃治療急性百草枯中毒的臨床研究[J]. 臨床急診雜志, 2015, 16(6): 469-471.

[7] 王婷立, 石運瑩, 張麗, 等. 117例百草枯中毒患者預后與相關(guān)影響因素的分析[J]. 現(xiàn)代預防醫(yī)學, 2012, 39(20): 5442-5444.

[8] 陳姿如, 劉軍生, 陳禮明, 等. 血液中百草枯衍生物的氣相色譜法測定[J]. 中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志, 2008, 26(2): 112-113.

[9] 王朝虹, 王志萍, 何毅, 等. 高效液相色譜法測定生物體液中百草枯[J]. 中國法醫(yī)學雜志, 2007, 22(6): 388-390.

[10] 劉菲, 勉麗娜, 張婧, 等. 高效液相色譜法測定植物中的百草枯[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2009, 19(6): 1248-1249.

[11] 陳璐, 鄒靜, 肖洪濤, 等. 高效液相色譜法測定人血清中百草枯濃度[J]. 中國醫(yī)院藥學雜志, 2010, 3(24): 2091-2094.

[12] 王雷, 王本杰, 孔祥麟, 等. 高效液相色譜法測定大鼠血漿中百草枯的含量[J]. 藥物分析雜志, 2009, 29(4): 623-626.

[13] 趙燕燕, 劉會芳, 郝麗娜, 等. 血中百草枯的紫外分光光度測定法[J]. 環(huán)境與健康雜志, 2007, 24(5): 346-347.

[14] 趙燕燕, 劉會芳, 許鳴華, 等. 百草枯中毒的急救與影響預后的因素分析[J]. 中國急救醫(yī)學, 2007, 27(8): 733-735.

[15] 宋斌, 李海燕, 曾燕, 等. 百草枯中毒的相關(guān)預后因素分析[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學, 2013, 4(8): 1571-1573.

[16] 趙群遠. 百草枯中毒機制及治療研究進展[J]. 中華危重癥醫(yī)學雜志, 2008, 1(2): 127-130.