霧化吸入甘草酸減輕博萊霉素所致小鼠肺纖維化的機(jī)制研究*

李俸敏，王火，曹波，王寧

（1.重慶市九龍坡區(qū)中醫(yī)院，重慶 400039；2.中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院附屬醫(yī)院，天津 300162；3.中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院，天津 300309；4.四川大學(xué)華西醫(yī)院再生醫(yī)學(xué)研究中心，四川 成都 610041）

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是由多種因素引起的彌漫性間質(zhì)性肺疾病，其主要病理特征是彌漫性肺泡炎、成纖維細(xì)胞增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積[1-3]，進(jìn)而引起進(jìn)行性肺功能下降，最終可誘發(fā)呼吸衰竭而致死亡[4]。甘草酸（glycyrrhizic acid，GA）是從傳統(tǒng)中藥光果甘草中提取的天然化合物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗菌及抗病毒等廣泛的藥物特性[5]。前期研究發(fā)現(xiàn)，一定劑量的GA具有抗肺纖維化的作用，但是其有效劑量較大（灌胃劑量為250 mg/kg）。結(jié)合GA具有藥物特性及霧化能快速作用于靶器官等優(yōu)點(diǎn)，本研究采用GA霧化吸入并與GA灌胃比較，研究其抗肺纖維化作用及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性昆明小鼠90只，體重18～20 g，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，食物和純凈水可自由攝取。

1.2 藥品、試劑及主要儀器

GA（陜西富捷藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20140605），博萊霉素（日本化藥珠式會(huì)社，生產(chǎn)批號(hào)：650472），吸入用布地奈德懸液（普米克令舒）（澳大利亞Astra Zeneca Pty Ltd公司，產(chǎn)品批號(hào)：LOT 318406），歐姆龍（Omron）超聲霧化器NB-150U[樂道克電子制造（南通）有限公司]，羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒（堿）（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20160701），小鼠IL-6、TGF-β1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司，羊抗兔IgG購(gòu)自中彬金橋生物技術(shù)有限公司，羊抗鼠IgG（H+L）、兔抗IL-6、兔抗IL-17A抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司，鼠抗β-actin、兔抗p-Smad2購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，兔抗TGF-β1購(gòu)自美國(guó)Affbiotech公司。

1.3 方法

1.3.1 分組 SPF級(jí)雄性昆明小鼠90只隨機(jī)分成6組：對(duì)照組、模型組、GA250灌胃（intragastric administration，IA）組、GA12組、GA24組及布地奈德霧化（atomizing inhalation，AI）組，每組15只。

1.3.2 復(fù)制肺纖維化模型及給藥 模型組及各給藥組分別給予5 mg/kg的博萊霉素溶液氣管滴注，復(fù)制小鼠肺纖維化模型。24 h后IA組按250 mg/kg劑量以GA溶液灌胃，GA12和GA24組分別給予12和24 mg/ml劑量的GA溶液4 ml霧化吸入；AI組霧化吸入0.25 mg/ml的布地奈德混懸液4 ml；對(duì)照組和模型組分別霧化等量的生理鹽水。各組每天霧化1次，連續(xù)21 d。第7、14和21天每組隨機(jī)處死5只小鼠。小鼠眼球取血，3 000 r/min離心20 min后取上清，-80℃冷凍保存；頸椎離斷處死后，取右肺上葉，4%中性甲醛固定，包埋、切片，其余組織-80℃冷凍保存。

1.3.3 HE染色和Masson染色 小鼠肺組織切片作HE染色和Masson染色。鏡下（×200）觀察并評(píng)價(jià)肺組織炎癥及纖維化程度。

1.3.4 HYP含量檢測(cè) 小鼠肺組織勻漿后，羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)HYP含量以明確肺組織中膠原水平，具體方法依照說明書進(jìn)行操作。

1.3.5 IL-6含量檢測(cè) ELISA法測(cè)定小鼠血清中IL-6含量，檢測(cè)炎癥因子，具體方法依照說明書進(jìn)行。

1.3.6 Western blot檢測(cè) 小鼠肺組織中IL-6、IL-17A、p-Smad2及TGF-β1蛋白表達(dá)水平均經(jīng)Western blot檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用Graphpad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)方差齊性，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肺組織HE染色及炎癥評(píng)分比較

霧化第7天，模型組小鼠肺組織出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔充血、增厚，肺泡腔變窄。模型組與對(duì)照組炎癥評(píng)分比較，采用t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=16.04，P=0.000），模型組炎癥評(píng)分高于對(duì)照組；GA12組、GA24組及IA組與模型組炎癥評(píng)分比較，采用單因素方差分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；AI組與模型組炎癥評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.477，P=0.009），AI組炎癥評(píng)分低于模型組（見圖1、3）。第14天，模型組炎癥評(píng)分高于對(duì)照組（t=14.23，P=0.000）；各治療組與模型組炎癥評(píng)分比較，可見GA24組炎癥評(píng)分低于IA和AI組（F=3.063，P=0.018）（見圖1、4）。第21天，模型組炎癥評(píng)分高于對(duì)照組（t=11.14，P=0.000）；各給藥組與模型組炎癥評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖1、5）。

圖1 霧化第7、14和21天炎癥評(píng)分

圖2 霧化第7、14和21天纖維化評(píng)分

2.2 小鼠肺組織Masson染色及纖維化評(píng)分比較

圖3 霧化第7天肺組織切片 （HE染色）

霧化第7和14天，模型組逐漸出現(xiàn)藍(lán)染的膠原纖維。模型組與對(duì)照組纖維化評(píng)分比較，采用t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（7 d：t=2.828，P=0.047；14 d：t=4.243，P=0.013），模型組纖維化評(píng)分均高于對(duì)照組；各給藥組與模型組纖維化評(píng)分比較，經(jīng)單因素方差分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖2、6、7）。第21天，模型組可見大量增生的膠原纖維，纖維化評(píng)分高于對(duì)照組（t=7.000，P=0.020）；各給藥組與模型組比較，可見GA24組膠原纖維減少，纖維化評(píng)分降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖2、8）。

2.3 小鼠肺組織HYP含量比較

霧化第7天，模型組與對(duì)照組HYP含量比較，采用t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.270，P=0.006），模型組HYP含量高于對(duì)照組；各給藥組與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。第14和21天，模型組HYP含量均高于對(duì)照組（14 d：t=13.040，P=0.006；21 d：t=7.005，P=0.020）；各給藥組與模型組比較，GA12和GA24組可見MDA含量降低，且第21天時(shí)GA12及GA24組HYP含量低于IA組和AI組（14 d：F=12.030，P=0.009；21 d：F=24.750，P=0.002）。見圖 9。

圖4 霧化第14天肺組織切片 （HE染色）

圖5 霧化第21天肺組織切片 （HE染色）

2.4 小鼠血清IL-6含量比較

霧化第7天，模型組與對(duì)照組IL-6含量比較，采用t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.642，P=0.043），模型組小鼠血清IL-6含量高于對(duì)照組；各給藥組與模型組比較，GA24組IL-6含量降低，且低于IA組和AI組（F=6.839，P=0.018）。第14和21天，模型組IL-6含量高于對(duì)照組；各給藥組與模型組比較IL-6含量也有降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖10。

2.5 小鼠肺組織中IL-6、IL-17A、p-Smad2及TGF-β1蛋白表達(dá)水平

Western blot結(jié)果顯示（見圖11～15）：霧化第7天，模型組與對(duì)照組IL-6的表達(dá)水平比較，采用t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.290，P=0.034），模型組IL-6的表達(dá)水平高于對(duì)照組；各給藥組與模型組IL-6的表達(dá)水平比較，采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.52，P=0.006），GA24組IL-6的表達(dá)水平降低，且低于其余各組。第14天，模型組IL-6的表達(dá)水平高于對(duì)照組（t=4.972，P=0.008）；各給藥組與模型組比較，可見GA24組IL-6的表達(dá)水平降低，且低于IA組和AI組（F=12.95，P=0.000）。第21天，模型組IL-6的表達(dá)水平高于對(duì)照組（t=5.107，P=0.007），而各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖13。

圖6 霧化第7天肺組織切片（Masson染色）

圖7 霧化第14天肺組織切片 （Masson染色）

第7天時(shí)，模型組與對(duì)照組IL-17A的表達(dá)水平比較，采用t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.294，P=0.006），模型組IL-17A表達(dá)水平高于對(duì)照組；各給藥組與模型組IL-17A的表達(dá)水平比較，采用單因素方差分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。第14天，模型組IL-17A表達(dá)水平高于對(duì)照組（t=8.549，P=0.001）；各給藥組與模型組比較，采用單因素方差分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。第21天，模型組IL-17A表達(dá)水平高于對(duì)照組（t=5.377，P=0.006）；各給藥組與模型組比較，可見GA24組IL-17A表達(dá)水平降低，且低于其余各組（F=5.492，P=0.007）。見圖14。

霧化第7天，模型組與對(duì)照組p-Smad2的表達(dá)水平比較，采用t檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。第14天，模型組p-Smad2的表達(dá)高于對(duì)照組（t=6.427，P=0.003）；各給藥組與模型組p-Smad2的表達(dá)水平比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=25.160，P=0.000），GA24組p-Smad2的表達(dá)水平低于其余各組。第21天，模型組p-Smad2的表達(dá)高于對(duì)照組（t=3.855，P=0.018）；各給藥組與模型組比較，GA12和GA24兩組p-Smad2的表達(dá)均有降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖 14。

圖8 霧化第21天肺組織切片 （Masson染色）

圖9 肺組織HYP含量比較

圖10 血清IL-6含量比較

第7和14天時(shí)，模型組與對(duì)照組TGF-β1的表達(dá)水平比較，采用t檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。第21天，模型組與對(duì)照組TGF-β1的表達(dá)水平比較，采用t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.080，P=0.000），模型組TGF-β1的表達(dá)水平高于對(duì)照組；各給藥組與模型組TGF-β1的表達(dá)水平比較，采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=86.250，P=0.000），GA24組TGF-β1表達(dá)水平降低，且低于IA組和AI組。見圖15。

圖11 小鼠肺組織中IL-6、IL-17A、p-Smad2及TGF-β1蛋白表達(dá)水平

圖12 肺組織IL-6表達(dá)水平

圖13 肺組織IL-17A表達(dá)水平

圖14 肺組織p-Smad2表達(dá)水平

圖15 肺組織TGF-β1表達(dá)水平

3 討論

目前，臨床治療肺纖維化仍以激素和免疫抑制劑聯(lián)合應(yīng)用為主，臨床療效欠佳且伴不同程度的不良反應(yīng)[6-7]。近年來，從中草藥中尋找有效的治療藥物成為肺纖維化研究的熱點(diǎn)。GA具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗菌及抗病毒等廣泛的藥物特性，在實(shí)驗(yàn)研究中已發(fā)現(xiàn)其具有抗肺纖維化作用。根據(jù)最新《霧化吸入療法在呼吸疾病中的應(yīng)用專家共識(shí)》[8]，霧化吸入治療呼吸系統(tǒng)疾病具有起效迅速、療效佳、全身不良反應(yīng)少等多種優(yōu)勢(shì)，是治療呼吸系統(tǒng)相關(guān)疾病較理想的給藥方法。因此，結(jié)合GA具有的藥物特性及霧化能快速作用于靶器官等優(yōu)點(diǎn)，本研究采用GA霧化吸入并與GA灌胃相比較，研究其抗肺纖維化作用及可能的機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正常肺組織肺泡上皮完整，肺泡腔內(nèi)少有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，未見肺間質(zhì)增寬，少有藍(lán)染的膠原纖維。霧化第7天，模型組肺組織HE染色可見肺組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；Masson染色可見肺間質(zhì)逐漸增寬，開始出現(xiàn)藍(lán)染膠原纖維。第14天，模型組肺泡腔內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)有所減輕，肺間質(zhì)增寬，藍(lán)染的膠原纖維增多。而與模型組比較，GA12和GA24兩組抑制肺間質(zhì)的增寬，藍(lán)染的膠原纖維也有減少，而膠原表達(dá)的標(biāo)志物HYP含量也逐漸增加。第21天，模型組病理切片可見肺間質(zhì)較寬，膠原纖維大量增多，HYP表達(dá)量達(dá)到頂峰。霧化GA12和GA24兩組與模型組相比膠原面積減少，且GA24組的抗纖維化效果優(yōu)于IA組和AI組。

IL-17是由Th17細(xì)胞產(chǎn)生的一種重要的促炎癥細(xì)胞因子，參與并介導(dǎo)多種炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展[9-10]。IL-6作為常見的炎癥因子，在纖維結(jié)締組織和平滑肌增生過程中發(fā)揮重要作用[11]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-17和IL-6都是引起肺纖維化的關(guān)鍵促炎介質(zhì)，與TGF-β1/Smads通路密切相關(guān)。IL-6和IL-17表達(dá)上調(diào)，尤其是IL-17表達(dá)上調(diào)時(shí)，可整體上調(diào)TGF-β1/Smads通路的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-6在復(fù)制模型后第7天升高后逐漸降低，而IL-17的表達(dá)逐步升高，與其相對(duì)應(yīng)TGF-β1、p-Smad2表達(dá)也逐步升高。GA12和GA24組降低IL-17、TGF-β1及p-Smad2水平，優(yōu)于IA組及AI組。IA初期不能減輕炎癥反應(yīng)，后期可逐漸減輕纖維化。而AI組第7天時(shí)能抑制IL-6的表達(dá)且效果優(yōu)于GA組，說明其可抑制早期的炎癥反應(yīng)，而對(duì)纖維化長(zhǎng)期變化無(wú)顯著改善。因此可推測(cè)，霧化吸入GA初期可降低IL-6水平以減輕小鼠的炎癥反應(yīng)，然后通過抑制IL-17、p-Smad2及TGF-β1表達(dá)減輕纖維化程度，從而改善博萊霉素所致小鼠肺纖維化，其效果優(yōu)于GA250灌胃；而布地奈德也可降低IL-6和IL-17水平，其減輕炎癥療效與GA24相當(dāng)，但后期并未抑制p-Smad2和TGF-β1表達(dá)，可能并不通過TGF-β1/Smads通路發(fā)揮作用。

綜上所訴，GA霧化吸入可通過抑制肺纖維化中TGF-β/Smads通路的表達(dá)來抑制博萊霉素所致小鼠的肺纖維化。霧化吸入GA具有應(yīng)用于肺纖維化臨床治療的價(jià)值。

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