利用除草劑Sandoz 9785篩選高EPA微擬球藻的研究?

周雨晴， 朱葆華， 楊官品， 潘克厚,3??， 李 赟， 屠昌超， 曹延群

(1.海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)海洋大學(xué))，山東 青島 266003；2.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島266003；3．青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237)

海洋微擬球藻(Nannochloropsisoceanica)屬于大眼藻綱(Eustigmatophyceae)微擬球藻屬(Nannochloropsis)[1]，一般直徑 2～4 μm，是一種海洋單細(xì)胞真核微藻。由于其具有很高的光合作用速率，且生長(zhǎng)速度快、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid,EPA)含量高，引起了學(xué)者們的廣泛關(guān)注。為提高N.oceanica細(xì)胞得率和胞內(nèi)EPA含量，國(guó)內(nèi)外研究者已對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化[2-5]，包括培養(yǎng)時(shí)間、鹽度、pH、光照強(qiáng)度、氮源種類等。除此之外，某些除草劑能夠抑制EPA等長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸合成途徑中某些酶的活性。利用這種特性，可以在除草劑存在條件下，篩選到酶活性強(qiáng)、生命力旺盛且遺傳性狀穩(wěn)定的優(yōu)良藻株[6-9]。

Sandoz 9785又名baf3.338，化學(xué)名4-氯-5(二甲基氨基)-2-苯基-3(2H)噠嗪酮，是一種噠嗪酮類除草劑，可以抑制高等植物和藻類不飽和脂肪酸合成過(guò)程中△15去飽和酶(18:2ω6→18:3ω3)和△6去飽和酶(18:2ω6→18:3ω6)的活性[10-11]，且破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，抑制電子傳遞[12]。已有研究表明，該除草劑可以篩選出高EPA含量的抗性藻株。鄒立紅等[7]用除草劑Sandoz 9785對(duì)紫外線誘變的后棘藻細(xì)胞進(jìn)行處理，獲得的優(yōu)良藻株EPA含量比出發(fā)藻株顯著提高了212%。魏東等[13]在群體水平研究了Sandoz 9785對(duì)微擬球藻生長(zhǎng)和積累EPA的影響。目前，尚未見利用該除草劑篩選抗性微擬球藻單克隆藻株及其葉綠素?zé)晒鈪?shù)和脂肪酸組成影響等方面的研究。本研究確定了Sandoz 9785篩選抗性微擬球藻的有效性，并成功篩選出了EPA含量較出發(fā)藻株顯著升高的優(yōu)良藻株。

1 材料與方法

1.1 藻種來(lái)源與培養(yǎng)

本研究使用微擬球藻(N.oceanica)來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室保存藻種，通過(guò)2次平板劃線分離出單細(xì)胞，進(jìn)而純培養(yǎng)得到原始藻株用于本實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)條件：溫度(25±1)℃；日光燈光源，光照強(qiáng)度60～80 μmol·m-2·s-1；光照周期12 h∶12 h，每天早晚各搖瓶1次。

1.2 除草劑Sandoz 9785對(duì)微擬球藻敏感性分析

以二甲基亞砜(DMSO)為溶劑配制濃度為100 μmol/mL的Sandoz 9785母液。實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)組，每組3個(gè)重復(fù)，向每組f/2固體培養(yǎng)基加入不同量的Sandoz 9785母液和DMSO，使除草劑的終濃度分別為0、50、52、54、56和58 μmol/L，DMSO的終濃度為0.058%。用f/2液體培養(yǎng)基稀釋指數(shù)生長(zhǎng)期的微擬球藻至107個(gè)/L，取100 μL涂布平板，置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)40 d后記錄平板內(nèi)的藻落數(shù)目。除草劑Sandoz 9785對(duì)微擬球藻生長(zhǎng)的抑制率通過(guò)公式進(jìn)行計(jì)算：W(%)=(對(duì)照組藻落數(shù)目-實(shí)驗(yàn)組平板藻落數(shù)目)/對(duì)照組藻落數(shù)目×100%[9]。

1.3 微藻生長(zhǎng)指標(biāo)檢測(cè)

抗性微擬球藻的篩選 從Sandoz 9785濃度為58 μmol/L的固體平板上篩選出2個(gè)抗性藻株SA1、SA2，在無(wú)添加除草劑的液體f/2培養(yǎng)基中培養(yǎng)至平臺(tái)期，再以相同起始密度接種用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)藻株設(shè)3個(gè)重復(fù)。

生長(zhǎng)曲線(Growth curve)繪制 用Hatachi U-3310型紫外分光光度計(jì)在750 nm波長(zhǎng)下，每48 h測(cè)定藻液的吸光度值。

比生長(zhǎng)速率(Specific growth rate) 通過(guò)公式K=(lnNt-lnN0)/(t2-t1)進(jìn)行計(jì)算[9]，其中N0、Nt分別為實(shí)驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)的吸光度值；t1和t2分別為實(shí)驗(yàn)開始和結(jié)束的時(shí)間(d)。

1.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定

用德國(guó)Walz公司生產(chǎn)的Water-PAM水樣葉綠素?zé)晒鈨x(Walz,Effeltrich,Germany)，分別選取指數(shù)期(第9天)和平臺(tái)期(第17天)的微擬球藻進(jìn)行葉綠素?zé)晒飧鱾€(gè)參數(shù)的測(cè)定。微藻樣品提前暗適應(yīng)15 min。葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm、ΦPSⅡ、ETR、qP和NPQ可在熒光儀上直接讀出，F(xiàn)v/F0用公式(Fm-F0)/F0計(jì)算，其中F0(基礎(chǔ)熒光)用弱測(cè)量光(0.01 μmoL·m-2·s-1) 測(cè)量可得，F(xiàn)m(最大熒光)用飽和脈沖(4 000 μmol·m-2·s-1，持續(xù)時(shí)間為0.8 s) 激發(fā)可得。

1.5 脂肪酸組成測(cè)定

脂肪酸組成采用氣相色譜法[14]。準(zhǔn)確稱取30 mg經(jīng)真空冷凍干燥的藻粉，加入1 mL KOH-CH3OH(2 mol/L)溶液，于75℃水浴30 min，冷卻至室溫。加入1.5 mL HCl-CH3OH(3 mol/L)溶液充分震蕩，75 ℃水浴30 min。冷卻至室溫后加入1 mL色譜純正己烷，充分震蕩，2 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清進(jìn)行色譜分析。

脂肪酸組成分析采用美國(guó)Agilent 6890 series GC system氣相色譜儀、氫火焰離子化檢測(cè)器和HP-5毛細(xì)管柱。進(jìn)樣后程序升溫:150 ℃恒溫1 min，以15 ℃/min升到200 ℃，再以2 ℃/min升溫至250 ℃，保持25 min。進(jìn)樣口溫度為270 ℃。載氣為高純氮，流速40 mL/min，進(jìn)樣量5 μL。

2 結(jié)果

2.1 Sandoz 9785對(duì)微擬球藻的生長(zhǎng)抑制效果

由表1可以看出，不同濃度的除草劑對(duì)微擬球藻具有不同程度的抑制作用，高濃度除草劑對(duì)微擬球藻抑制作用明顯，濃度為58 μmol/L時(shí)，平板中藻細(xì)胞抑制率達(dá)到99.1%。

表1 Sandoz 9785對(duì)微擬球藻生長(zhǎng)的抑制作用Table 1 Inhibition of Sandoz 9785 to the growth of N.oceanica

2.2 抗性藻株及其評(píng)價(jià)

由圖1可以看出，SA1在前期生長(zhǎng)較快，第3天OD值比出發(fā)藻株提高了13.59%(P<0.05)。SA1第6天后生長(zhǎng)放緩，與出發(fā)藻株持平。SA2生長(zhǎng)較快，第9、13天的OD值較出發(fā)藻株分別提高了6.99%和5.53%(P<0.05)比生長(zhǎng)速率較出發(fā)藻株顯著提高了2.31%(見圖2)。

由表2和3可以看出，在指數(shù)生長(zhǎng)期(第9天)，SA1和SA2的ΦPSⅡ、ETR、NPQ、Fv/Fm、Fv/F0值較出發(fā)藻株均有所提高，其中藻株SA1的NPQ、Fv/Fm、Fv/F0分別提高了74.6%、6.83%和21.15%(P<0.05)，藻株SA2的Fv/Fm、Fv/F0分別提高了3.17%、9.28%(P<0.05)。SA1和SA2的qP值均有所下降，但差異不顯著(P>0.05)。平臺(tái)期(第17天)，SA1、SA2的ΦPSⅡ、ETR、qP、Fv/Fm、Fv/F0值較出發(fā)藻都有所提高，其中SA1的NPQ顯著高于出發(fā)藻163.16%(P<0.05)，SA2 NPQ低于出發(fā)藻株但差異不顯著(P>0.05)。

圖1 抗性藻株和出發(fā)藻株的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of resistant strains and the original

(數(shù)據(jù)均表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，圖中標(biāo)有不同的字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。Values are expressed as mean±standard deviation. Different letters indicate significant difference(P< 0.05).)

圖2 抗性藻株和出發(fā)藻株的比生長(zhǎng)速率Fig.2 Specific growth rate of resistant strains and the original

注：a、b、c、d、e分別表示方差分析差異程度，同一行中有相同字母的組之間差異不顯著(P>0.05)。

Note: Values in the same row with the same superscripts are not significantly different(P>0.05).

表3 抗性藻株和出發(fā)藻株在平臺(tái)生長(zhǎng)期的葉綠素?zé)晒鈪?shù)Table 3 The fluorescence parameters of resistant strains and the original at the plateau growth phase

注：a、b、c、d、e分別表示方差分析差異程度，同一行中有相同字母的組之間差異不顯著(P>0.05)。

Note: Values in the same row with the same superscripts are not significantly different(P>0.05).

微擬球藻的脂肪酸主要由C14、C16、C18和C20組成(見表4)，飽和脂肪酸(SFA)和單不飽和脂肪酸(MUFA)占總脂肪酸的60%以上。SA2的EPA (C20：5)含量低于出發(fā)藻株，SA1的EPA含量比出發(fā)藻株顯著提高了5.44%(P<0.05)，占總脂肪酸含量的27.35%。

表4 抗性藻株和出發(fā)藻株的脂肪酸含量Table 4 The fatty acid composition of resistant strains and the original /%

注：a、b、c、d、e分別表示方差分析差異程度，同一行中有相同字母的組之間差異不顯著(P>0.05)。

Note: Values in the same row with the same superscripts are not significantly different(P>0.05)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中微擬球藻對(duì)除草劑Sandoz 9785非常敏感，濃度為58 μmol/L時(shí)，平板中的藻細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率達(dá)到99.10%。從中挑取生長(zhǎng)良好的SA1、SA2單克隆藻落接種到新鮮的液體培養(yǎng)基中，SA1和SA2的生長(zhǎng)速率較出發(fā)藻株均有所增加。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)能反映植物光合作用過(guò)程中的光能吸收、電子傳遞、能量耗散和分配等過(guò)程[15]。研究發(fā)現(xiàn)，除草劑Sandoz 9785可以使植物光系統(tǒng)復(fù)合物從光合膜上脫落，影響細(xì)胞的光合作用。本實(shí)驗(yàn)中，抗性藻株P(guān)SⅡ反應(yīng)中心最大光能轉(zhuǎn)換效率(Fv/Fm)和潛在活性(Fv/F0)均不同程度升高(見表2和3)，表明抗性藻株能抵抗除草劑對(duì)葉綠體PSⅡ結(jié)構(gòu)的破壞，恢復(fù)培養(yǎng)后2種藻株P(guān)SⅡ基本沒有受到傷害。ΦPSⅡ反映了PSⅡ反應(yīng)中心部分關(guān)閉情況下實(shí)際原初光化學(xué)效率，ΦPSⅡ升高, 說(shuō)明抗性藻細(xì)胞有較多同化力(NADPH，ATP)形成, 從而促進(jìn)對(duì)碳的固定與同化[16]，這與抗性藻株比生長(zhǎng)速率升高是一致的。非光化學(xué)淬滅(NPQ)是光系統(tǒng)Ⅱ天線色素吸收的過(guò)剩光能以熱能的形式耗散掉的部分。由于除草劑對(duì)葉綠體結(jié)構(gòu)具有破壞作用[18]，植物在脅迫條件下，葉綠素含量降低，電子傳遞受抑制導(dǎo)致活性氧積累，為降低活性氧增多而造成的損傷，酶促防御系統(tǒng)發(fā)揮了重要作用。高溫脅迫能提高花椰菜葉片中抗氧化酶(超氧化物歧化酶、抗壞血酸過(guò)氧化物酶、愈創(chuàng)木酚過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶)的活性，減少活性氧的損傷[19]。在62.5～500 μmol/L Sandoz 9785存在條件下，為防止光氧化傷害，小麥幼苗(Wheat seedlings)NADPH谷胱甘肽還原酶活力提高了6～8倍[17]。本實(shí)驗(yàn)中抗性藻株的非光化學(xué)淬滅(NPQ)顯著高于出發(fā)藻株(見表2和3)，說(shuō)明抗性藻株具有更強(qiáng)的自我保護(hù)能力?？剐栽逯闟A2的NPQ值在平臺(tái)期略低于出發(fā)藻株，說(shuō)明SA2具有較低的能量耗散。光化學(xué)淬滅(qP)表示PSⅡ天線色素吸收的光能用于化學(xué)電子傳遞的比例，與電子傳遞、光合氧化等過(guò)程直接相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，抗性藻株的qP值在指數(shù)期(第9天)略有下降，但差異并不顯著且在平臺(tái)期(第17天)明顯高于出發(fā)藻株，說(shuō)明抗性藻株P(guān)SⅡQA重新氧化的能力較強(qiáng)，電子傳遞、光合氧化等效率較高。Sandoz 9785具有除草劑DCMU(二氯苯基二甲脲)類似的作用，它可以結(jié)合在PSⅡ光反應(yīng)中心蛋白D1蛋白的QB位點(diǎn)上,阻止QB還原,使電子傳遞速率失去平衡[17,23]。因此，在有除草劑存在的條件下，絕大多數(shù)藻細(xì)胞不能正常生長(zhǎng)，但抗性藻株卻表現(xiàn)出更強(qiáng)的生命力和更加優(yōu)良的性狀(本實(shí)驗(yàn)中SA1的EPA含量增加，SA2的比生長(zhǎng)速率升高)。從葉綠素?zé)晒鈪?shù)(ΦPSⅡ、ETR、Fv/Fm、Fv/F0)來(lái)看，SA1提高顯著但比生長(zhǎng)率卻略低于出發(fā)藻株，由于SA1的非光化學(xué)淬滅(NPQ)顯著高于出發(fā)藻株，PSⅡ中心天線色素吸收的光能較大一部分以熱的形式耗散掉了，導(dǎo)致其生長(zhǎng)速率變慢，EPA合成增加。

藻類長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸是在一系列去飽和酶和延伸酶作用下合成的。微擬球藻EPA的合成途徑已有一些報(bào)道。由圖3可以看出，從C18:2開始，主要有 n-6和 n-3兩條途徑合成EPA[20]，Δ15去飽和酶與Δ6去飽和酶在其中發(fā)揮重要作用，Sandoz 9785主要通過(guò)抑制這2個(gè)酶的活性從而對(duì)EPA的合成產(chǎn)生影響。Cohen等[10]從紫球藻中篩選到Sandoz 9785抗性藻株,其EPA的含量從野生型的36.8%提高到40.4%，并可在無(wú)Sandoz 9785存在下穩(wěn)定遺傳50代以上。魏東等[13]在群體水平研究了Sandoz 9785對(duì)微擬球藻的影響,得到抗性藻株EPA含量占細(xì)胞干重的3.51%，比野生株提高了30%。鄒立紅等[7]通過(guò)Sandoz 9785對(duì)紫外誘變的后棘藻細(xì)胞進(jìn)行篩選，獲得5株高產(chǎn)EPA的藻株，其中一株藻的EPA含量達(dá)總脂肪酸的26.22%，較出發(fā)藻株提高了212%。

圖3 微擬球藻多不飽和脂肪酸(EPA)生物合成途徑[20,22]Fig. 3 Proposed PUFA biosynthesis pathway in N.oceanica[20,22]

到目前為止，有關(guān)微藻抗除草劑以及抗性藻株積累EPA的機(jī)理研究得還不夠深入。已有的研究結(jié)果表明，抗性細(xì)胞中相關(guān)酶類經(jīng)過(guò)修飾后，可能降低對(duì)抑制劑的親和性，或者提高了相關(guān)酶基因的表達(dá)水平，酶活性升高[10]。本研究中，在含有除草劑Sandoz 9785的平板上正常生長(zhǎng)的抗性藻株SA1和SA2，在無(wú)除草劑條件下培養(yǎng)，SA1EPA含量比出發(fā)藻株顯著提高了5.44%，占總脂肪酸含量的27.35%, SA2 EPA含量略低于出發(fā)藻?？剐栽逯闑PA含量發(fā)生變化，有以下幾種可能：(1)因?yàn)棣?5去飽和酶或Δ6去飽和酶的活性增強(qiáng)，促進(jìn)C18:2轉(zhuǎn)化為C18:3用于后續(xù)合成EPA，后面的研究將對(duì)相關(guān)酶基因的表達(dá)水平及酶活性進(jìn)行測(cè)定；(2)抗性藻株SA1在Sandoz 9785脅迫條件下，激活了一個(gè)在正常情況下不會(huì)發(fā)生作用的途徑，即C18:2通過(guò)C20:2(n-6) 轉(zhuǎn)化為C20:4(n-6)[13,22]，進(jìn)而合成EPA；(3)Sandoz 9785能抑制葉綠體上Δ15去飽和酶的活性，對(duì)細(xì)胞質(zhì)中EPA合成過(guò)程沒有影響[21]，而微擬球藻EPA只在細(xì)胞質(zhì)中合成[20]，同時(shí)，Sandoz 9785能抑制微擬球藻的光合作用，使光合作用顯著增強(qiáng)的藻株得以存活，因此，通過(guò)該除草劑可篩選到EPA含量不同的抗性藻株。

目前，已有研究表明Sandoz 9785對(duì)藻細(xì)胞的作用機(jī)理主要有三方面，(1)破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，使光系統(tǒng)Ⅱ脫落[18]；(2)作用PSⅡ光反應(yīng)中心蛋白D1蛋白的QB位點(diǎn)上 ,阻止QB的還原[17,23]；(3)抑制EPA合成通路中Δ15去飽和酶與Δ6去飽和酶的活性[10-11]。由于Sandoz 9785對(duì)藻細(xì)胞具有多種抑制作用，因此，可能獲得生長(zhǎng)速率提高或者EPA合成增加的優(yōu)良藻株。本實(shí)驗(yàn)中，相對(duì)于出發(fā)藻株,SA1 EPA含量顯著提高、比生長(zhǎng)速率略低，SA2 EPA含量沒有提高，比生長(zhǎng)速率顯著提高。由于SA1的EPA含量顯著提高且比生長(zhǎng)速率與出發(fā)藻株差異不顯著，因此，達(dá)到了利用該除草劑篩選高EPA微擬球藻的目的。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們會(huì)對(duì)SA1多次傳代，觀察其性狀的穩(wěn)定性。

4 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)中篩選到抗性藻株SA1、SA2，將其接入液體f/2培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測(cè)得其葉綠素?zé)晒鈪?shù)(ΦPSⅡ、ETR、Fv/Fm、Fv/F0)均高于出發(fā)藻株(見表2、3)，表明抗性藻株的PSⅡ基本沒有受到除草劑的損害，其PSⅡ的實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率和光合電子傳遞效率均有提高，其中SA2的比生長(zhǎng)速率高于出發(fā)藻株，SA1的EPA含量顯著高于出發(fā)藻株。本研究通過(guò)Sandoz 9785篩選到了EPA含量較高的優(yōu)良微擬球藻，研究結(jié)果為篩選其他EPA含量較高的藻株提供參考。

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