青海黑果枸杞原花青素對小鼠光老化皮膚的保護作用

陶叢敏，冶 娟，馬文宇，羅文娟

人的皮膚老化主要表現(xiàn)為自然衰老和光老化兩種形式[1]。由內(nèi)源性因素引起的皮膚老化，多表現(xiàn)為正常的皮紋加深，皮膚干燥變薄、失去彈性、松弛和粗糙[2]。光老化主要是由于皮膚在急性或長期反復(fù)由紫外線（UV）照射引起，主要變化包括皺紋深亂粗深、色素沉著、癌前病變等[3,4]。本研究主要通過觀察青海黑果枸杞原花青素對D-半乳糖皮下注射聯(lián)合UV照射引起的小鼠光老化模型皮膚組織中氧化應(yīng)激水平和凋亡蛋白的變化，以及血清中炎性因子的改變，了解黑果枸杞原花青素對光老化皮膚的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康SPF級昆明種雌性小鼠50只，45 d齡，體質(zhì)量18～22 g，購自西安交通大學(xué)實驗動物中心[0001209]。

1.1.2 主要實驗試劑和設(shè)備 青海黑果枸杞原花青素粉末（西安萬方生物）；維生素E粉末（北京索萊寶）；D-半乳糖（北京索萊寶）；UV[長波紫外線（UVA）+中波紫外線（UVB）]光療儀（南京卡知電子科技有限公司）；UVB 和UVA 型UV 輻照度監(jiān)視器（臺灣路昌）；活性氧（ROS）、過氧化氫酶（CAT）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Bax、Bcl-2酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（武漢伊萊瑞特生物公司）；白細胞介素（IL）-1、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α ELISA試劑盒 （武漢基因美生物科技有限公司）；X-Mark型BIO-RAD酶標儀（BIO-RAD公司），TGrinder電動組織研磨器（北京天根生化科技有限公司），SIGMA 3K15離心機（Sigma公司），恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上?，槴\實驗設(shè)備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將50只小鼠隨機分為5組，正常組、模型組、維生素E組、黑果枸杞原花青素低劑量組50 mg/(kg·d)、黑果枸杞原花青素高劑量組（100 mg/(kg·d)，每組 10只,并做好標記。

1.2.2 動物飼養(yǎng) 小鼠每10只放入一籠飼養(yǎng)，在相同的自然環(huán)境下（晝夜交替12 h）飼養(yǎng)1 周，常規(guī)飼食和飲水，無不良因素影響，使其適應(yīng)實驗室環(huán)境后開始進行實驗。

1.2.3 脫毛 所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，用6%的硫化鈉脫毛劑除去表面毛發(fā)，暴露約5×5 cm大小的皮膚，視毛發(fā)生長情況進行脫毛。

1.2.4 照光 第2周開始，除正常組外，每組頸背部皮下注射5%D-半乳糖10 ml/(kg·d)，同時進行UV照射。將小鼠放入自制照射盒中，并置于距離光源( UVA + UVB) 40 cm 處的水平面上，隔日照射1 次，每次40 min。每次照射前燈管預(yù)熱15 min，且照射前均測光強度，初次正式照射前，先測定最小紅斑量及光照射強度，累計照射40 d（UVA 照射劑量累計為98.4 J，UVB 輻照劑量累計為 78.4 J）。

1.2.5 給藥與處理 造模第11天開始，黑果枸杞原花青素低劑量組和黑果枸杞原花青素高劑量組按劑量[50 mg/(kg·d)和100 mg/(kg·d)]灌胃黑果枸杞原花青素，正常組和模型組則每日灌胃等體積的生理鹽水，維生素E組每只給予維生素E滴劑0.5 ml，連續(xù)用藥30 d。

1.2.6 取材 實驗第42天，所有小鼠行眼球取血，置于1.5 ml EP管中室溫靜置1 h，2 500 r/min，離心15 min后取上清，于-80℃保存，進行IL-1、IL-6、TNF-α檢測。取照光處皮膚（刮除皮下脂肪），在冰凍的生理鹽水中漂洗，冷凍于-80℃冰箱制備成10%皮膚組織勻漿，放入離心機以3 500 r /min離心15 min。取組織上清進行保存于-80℃冰箱，進行ROS、CAT 活力及 Bax 、Bcl-2 含量檢測[7]。

1.2.7 指標檢測 酶生化法測定皮膚組織ROS及CAT 活力，按上述方法處理皮膚組織后嚴格按照說明書檢測ROS及CAT 活力。采用ELISA檢測各組小鼠皮膚組織中Bax 、Bcl-2及血清中IL-1、IL-6、TNF-α的含量。按試劑盒說明書步驟操作，以450 nm 測A值，以A值為縱坐標，以標準品濃度為橫坐標，繪制標準曲線，采用Curve Expert 1.4軟件對標準曲線進行擬合。根據(jù)樣品A值在標準曲線上計算樣本的濃度 。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用 Excel 2003錄入實驗數(shù)據(jù)，采用 SPSS 20.0軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù) ±標準差（±s）表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜ 0.05 為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肉眼觀察小鼠皮膚變化

正常組小鼠皮膚光滑、細嫩、無皺紋，而隨著UV的照射，模型組小鼠皮膚粗糙增厚，并有皺紋及脫屑、瘀點和瘀斑，經(jīng)黑果枸杞原花青素治療后的小鼠皮膚出現(xiàn)一定改善，其皮膚脫屑較模型組減少，皮膚接近正常，而經(jīng)過維生素E治療的小鼠，雖然皮膚有所改善，但沒有使用黑果枸杞原花青素明顯（圖1）。

2.2 肉眼觀察皮下血管變化

正常組小鼠皮下血管正常，淡紅色，無充血及瘀點；模型組小鼠皮下血管擴張，呈暗紅色，出現(xiàn)結(jié)節(jié)和瘀點；原花青素組的小鼠皮下血管有輕度充血，少量結(jié)節(jié)，但隨著劑量的增大，皮下血管的變化接近正常；維生素E組小鼠皮下血管充血較模型組減輕，但沒有原花青素組改變的明顯（圖2）。

2.3 小鼠皮膚組織抗氧化指標活力和凋亡蛋白含量測定及小鼠血清炎性因子含量測定

圖1 5組小鼠皮膚外觀

圖2 5組小鼠皮膚血管鏡下所見

2.3.1 小鼠皮膚組織抗氧化指標活力測定 與正常組相比，模型組ROS活力顯著升高，CAT 活力顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，原花青素低、高劑量組ROS下降，CAT 活力升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與維生素E組比較，原花青素低、高劑量組ROS活力下降及CAT活力升高更加明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表 1）。

表1 各組小鼠皮膚組織ROS、CAT活力比較 （ ±s）

表1 各組小鼠皮膚組織ROS、CAT活力比較 （ ±s）

注：與正常對照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，$P＜0.05；與維生素E組比較，&P＜0.05

組 別 n ROS活力(IU/ml)CAT活力(U/mgprot)正常組 10 93.18±9.57 25.31±4.61模型組 10 139.95±9.79# 11.51±2.70#維生素E組 10 126.94±7.02#$ 16.35±2.16#$原花青素低劑量組 10 108.34±10.80#$ 19.84±1.75#$&原花青素高劑量組 10 96.21±5.83$ & 24.31±2.67$&F值 52.15 37.68 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.3.2 皮膚組織凋亡因子含量表達情況 空白對照組Bax表達水平較低，Bcl-2表達升高；與正常組比較，模型組Bax的表達水平顯著上調(diào)，Bcl-2表達降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）；與模型組比較，原花青素低、高劑量組Bax表達水平較低，Bcl-2表達水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與維生素E組比較，原花青素低、高劑量組的Bax表達水平降低，Bcl-2表達水平上調(diào)更加明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）（表2）。

表2 各組小鼠皮膚組織Bax、Bcl-2含量比較 （ ±s）

表2 各組小鼠皮膚組織Bax、Bcl-2含量比較 （ ±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與維生素E組比較，&P＜0.05

組 別 n Bax（ng/ml） Bcl-2 （pg/ ml）正常組 10 10.80±1.43 2521.81±696.07模型組 10 20.12±1.68* 959.96±123.18*維生素E組 10 17.30±1.58 *# 1228.36±85.65*#原花青素低劑量組 10 15.45±1.78*#& 1442.98±98.40*#&原花青素高劑量組 10 11.29±1.28#& 1959.84±309.17#&F值 64.77 40.08 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.3.3 小鼠血清炎性因子含量檢測結(jié)果 與正常組比較，模型組IL-1、IL-6、TNF-α的含量顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，原花青素低、高劑量組IL-1、IL-6、TNF-α含量降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與維生素E組比較，原花青素低、高劑量組IL-1、IL-6、TNF-α含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。

3 討論

黑果枸杞為茄科枸杞屬，在我國主要分布于寧夏、青海、新疆、內(nèi)蒙古、陜西、甘肅和西藏等地，而青海地區(qū)特殊的地理及氣候條件使黑果枸杞種植較多，并且其原花青素的含量要高于其他地區(qū)[5]。樓舒婷等[6]對黑果枸杞活性成分和揮發(fā)性組分進行了研究，詳細闡述了黑果枸杞在飲食、保健方面的應(yīng)用價值，而對于其抗氧化成分的研究主要集中在黃酮、多糖、多芬類，對原花青素抗氧化、延緩衰老方面的研究尚少[7]。本文通過對黑果枸杞原花青素對光老化皮膚的抗氧化作用，進一步探討了黑果枸杞在延緩衰老方面的機制。

表3 各組小鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α含量比較（ ±s）（pg/ml）

表3 各組小鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α含量比較（ ±s）（pg/ml）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與維生素E組比較，△P＜0.05

組 別 n IL-1 IL-6 TNF-α正常組 10 27.49±9.15 10.09±4.67 230.21±53.76模型組 10 131.96±29.84* 47.59±10.18* 552.09±105.98*維生素E組 10 97.34±6.21*# 32.53±3.11*# 387.16±58.37*#原花青素低劑量組 10 60.02±15.83*#△ 22.05±4.79*#△ 314.30±22.60*#△原花青素高劑量組 10 34.61±4.66 #△ 11.94±3.05#△ 238.11±46.49#△F值 75.36 72.42 43.44 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

由于人體的皮膚老化受多種因素的影響，外源性因素是UV長期照射皮膚造成光老化，日光中UV主要由UVB（波長290～320 nm）和UVA（波長320～400 nm）組成，其中UVB是造成皮膚損傷的主要原因[8]。然而，日光中UVA與UVB是不可能分隔的，許多研究還表明UVA有加強UVB的作用，誘導(dǎo)多種細胞發(fā)生凋亡與皮膚衰老密切相關(guān)。D-半乳糖可引起氧化應(yīng)激，使細胞清除自由基的能力下降，細胞發(fā)生一系列退行性變化，呈現(xiàn)衰老狀態(tài)[9]。

以往的研究大多集中在細胞水平，本實驗采用復(fù)合光源（UVB＋UVA）模擬日光，聯(lián)合D-半乳糖皮下注射建立光老化動物模型，更符合人體皮膚老化的生理過程。UV照射后，皮膚組織中會產(chǎn)生大量ROS，正常情況下皮膚角質(zhì)形成細胞內(nèi)產(chǎn)生超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和CAT等，均可對活性氧簇的釋放起到一定的抵御作用。大量UV照射后，體內(nèi)各種抗氧化酶的活性降低，從而致使細胞內(nèi)線粒體損傷以及核內(nèi)DNA鏈斷裂等，促使一些炎性因子的釋放[10]。再次，UV照射后，線粒體產(chǎn)生ROS水平升高，也可通過自噬途徑增加ROS水平， 進一步致細胞凋亡甚至變性壞死。Bax、Bcl-2是細胞凋亡的主要凋亡蛋白，UV照射后，線粒體通透性改變，細胞色素C釋放，凋亡蛋白增加[11-13]；另一方面，二者比例也對細胞凋亡起著調(diào)節(jié)作用。UV照射后，NF-K B信號通路被激活，真皮（基質(zhì)金屬蛋白酶）MMPs表達增加，炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α表達水平增高，最終增強光老化作用[14-17]。

本實驗中，與正常組的結(jié)果比較顯示，經(jīng)紫外線照射后，小鼠皮膚表面干燥、粗糙、脫屑，出現(xiàn)皺紋，皮下血管擴張、充血，并伴有結(jié)節(jié)和瘀點。模型組皮膚組織中ROS活力顯著升高，CAT 活力顯著下降；Bax的表達水平顯著上調(diào)，Bcl-2水平降低；血清炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α表達水平增高；說明光老化模型造模成功；經(jīng)黑果枸杞原花青素灌胃后，與維生素E組相比，原花青素低、高劑量組小鼠皮膚組織中ROS活力顯著下降，CAT 活力顯著升高；Bax的表達水平顯著下調(diào)，Bcl-2水平上調(diào)；血清IL-1、IL-6、TNF-α表達水平降低，說明黑果枸杞原花青素對其表達有抑制作用，且隨著給藥濃度的增加，作用逐漸加強，表明其抗光老化可能存在濃度依賴。

本實驗結(jié)果顯示，黑果枸杞原花青素對皮膚光老化有一定的改善作用，其機制可能與黑果枸杞原花青素抑制細胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生，降低線粒體通透性，抑制細胞色素C釋放，抑制細胞凋亡，減輕炎癥反應(yīng)相關(guān)。通過此實驗，為黑果枸杞抗衰老、美容養(yǎng)顏功效產(chǎn)品的研制提供理論依據(jù)。

【參 考 文 獻】

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