從改善“脂毒性”看六味地黃丸對(duì)自發(fā)性糖尿病OLETF大鼠肝臟的保護(hù)

李佳， 薛耀明， 朱波， 潘永華， 張燕

（1.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東 廣州510010；2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，廣東 廣州510515）

2型糖尿?。╰ype 2 diabetesmellitus，T2DM）的發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為，胰島素抵抗（insulin resistance，IR）和胰島β細(xì)胞功能減退是其中最主要因素.肝臟作為中樞性胰島素作用的靶器官，通過(guò)參與糖原合成、分解、糖異生等糖代謝重要環(huán)節(jié)在糖尿病發(fā)生中發(fā)揮重要作用.近年來(lái)研究報(bào)道，血清游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）的升高，對(duì)胰島β細(xì)胞功能受損和肝臟胰島素抵抗的發(fā)生、發(fā)展均有明顯影響，即“脂毒性”效應(yīng)[1]，甚至有學(xué)者提出脂代謝紊亂是糖尿病發(fā)生的始動(dòng)因素，糖尿病應(yīng)改稱為“糖脂病”[2].中醫(yī)藥對(duì)于糖尿病的治療源遠(yuǎn)流長(zhǎng)[3]，六味地黃丸是其中的范本[4].糖尿病屬中醫(yī)的“消渴”范疇，以陰虛為本；其臨床常見(jiàn)的癥狀多飲、多食、多尿按照輕重主次對(duì)應(yīng)中醫(yī)的上消、中消、下消，六味地黃丸滋陰為重，主治下消.故臨床上關(guān)于六味地黃丸治療糖尿病的研究多集中在腎臟[5－6]，而對(duì)于糖脂代謝的關(guān)鍵器官肝臟的研究較少.本研究以國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的優(yōu)秀自發(fā)性T2DM動(dòng)物模型OLETF（otuska long-evans tokushima fatty）鼠及其同種系糖耐量正常的對(duì)照鼠 LETO（long-evans tokushima otsuka）鼠為研究對(duì)象[7]，觀察六味地黃丸對(duì)其脂代謝及肝臟局部脂肪浸潤(rùn)的改善，從肝臟保護(hù)的角度為六味地黃丸預(yù)防糖尿病提供證據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組：4周齡雄性O(shè)LETF鼠40只和LETO鼠10只（日本大冢制藥株式會(huì)社德島研究所提供）.OLETF鼠隨機(jī)分為2組，每組20只.分別為六味地黃丸干預(yù)組（簡(jiǎn)稱六味組）和OLETF鼠對(duì)照組（簡(jiǎn)稱對(duì)照組）.LETO鼠10只作為正常對(duì)照組（簡(jiǎn)稱LETO組）.

（2）主要試劑和儀器：六味地黃丸（濃縮丸），北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠；甘油三酯測(cè)定試劑盒，上?？菩郎锕?；膽固醇測(cè)定試劑盒，上?？菩郎锕?；游離脂肪酸測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所；Leica切片機(jī)，RM2135德國(guó)；雙目顯微鏡及照相機(jī)，Olympus BX51＋DP70日本；血糖儀及血糖試紙，One touch ultra美國(guó)強(qiáng)生公司.

1.2 方法

（1）大鼠在SPF條件下單籠飼養(yǎng)：干預(yù)組8周齡始予質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.4 mg/kg的六味地黃丸灌胃，對(duì)照組和LETO組每日予等體積蒸餾水灌胃，每天1次.于 13、18、23、30、34、40周齡行口服葡萄糖耐量（OGTT）試驗(yàn)，剪尾法以強(qiáng)生穩(wěn)豪血糖儀測(cè)定血糖值.血糖濃度＞16.7 mmol/L和負(fù)荷后120 min血糖濃度 ＞11.1 mmol/L診斷為糖尿病，具備上述一條者為糖耐量異常（IGT）[8].

（2）大鼠血液標(biāo)本及肝臟組織采集：分別于8、32和40周齡隨機(jī)（玻璃珠法）處死大鼠.術(shù)前禁食14 h，以體積分?jǐn)?shù)為3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉.腹主動(dòng)脈穿刺取血.血液分別存于普通生化管和EDTA抗凝管.靜置5 min，4 000 r/min離心2 min，留取血清，－20℃凍存待檢.各組大鼠宰殺后隨機(jī)選取3只，分離肝臟組織，并分別置于液氮中及體積分?jǐn)?shù)為10%多聚甲醛中待檢.

（3）GK-GPO-PAP法：檢測(cè)血清甘油三酯（triglyceride，TG）水平.

（4）銅離子顯色法：檢測(cè)血清FFA水平.

（5）CHOD-PAP法：檢測(cè)血清膽固醇（cholesterol，CHOL）水平.

（6）HE染色：以石蠟切片機(jī)間隔4μm連續(xù)切片.相鄰切片分別用標(biāo)準(zhǔn)HE染色觀察大鼠肝臟組織學(xué)改變.

（7）蘇丹Ⅲ染色：標(biāo)本于體積分?jǐn)?shù)為10%多聚甲醛中固定后，冰凍切片機(jī)切片.蒸餾水洗數(shù)次，去除多聚甲醛.依次將切片置于體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇內(nèi)3min、體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇內(nèi)3min.用吸管吸取蘇丹Ⅲ染液約3～4 mL于稱量瓶?jī)?nèi)，從體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇中把切片撈入盛有染液的稱量瓶?jī)?nèi)并加蓋浸染1～2 min.體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇換洗分化3次，每次1 min左右.蒸餾水稍洗數(shù)次.蘇木素復(fù)染胞核.自來(lái)水洗10 min，將水甩干，甘油明膠封蓋.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)計(jì)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）.采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間資料比較采用單因素方差分析（ANOVA）檢驗(yàn)，糖尿病發(fā)病率組間比較用χ2檢驗(yàn).檢驗(yàn)水準(zhǔn)α定為0.05.

2 結(jié)果

2.1 六味地黃丸對(duì)各組大鼠糖尿病發(fā)病率的影響

對(duì)照組在23周齡開(kāi)始發(fā)生糖尿病，發(fā)病率隨周齡延長(zhǎng)而升高，40周齡發(fā)病率達(dá)92.9%.六味組大鼠在30周齡出現(xiàn)首例糖尿病，40周齡時(shí)發(fā)病率為 28.6%，顯著低于對(duì)照組（p＜0.01）.LETO組無(wú)糖尿病或IGT發(fā)生（表1）.

表1 各組糖尿病發(fā)病情況1）Table 1 The incidence of Diabetes

2.2 六味地黃丸對(duì)各組大鼠脂代謝影響

8周齡時(shí)，對(duì)照組除血清CHOL水平升高外，F(xiàn)FA和TG水平無(wú)明顯變化.32周齡時(shí)，與LETO組相比，對(duì)照組血清FFA、TG、CHOL水平明顯升高，有顯著性差異（P＜0.05），表現(xiàn)為明顯的脂代謝紊亂，六味組血脂升高不明顯，與LETO組相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05）.與對(duì)照組相比，六味組各項(xiàng)血脂水平均有降低趨勢(shì)，其中TG下降有顯著性差異（P＜0.05）.

40周齡時(shí)，對(duì)照組TG、CHOL水平進(jìn)一步升高，顯著高于六味組和LETO組；而40周齡時(shí)六味組和LETO組各項(xiàng)血脂水平與32周齡相比升高不明顯（表2）.

2.3 六味地黃丸對(duì) OLETF鼠肝臟組織學(xué)的影響

8周齡時(shí)，各組大鼠肝臟結(jié)構(gòu)亦無(wú)明顯差別.32周齡，對(duì)照組及六味組大鼠肝細(xì)胞均出現(xiàn)空泡樣改變，對(duì)照組可見(jiàn)大泡、小泡混合變性，六味組以小泡變性為主，而LETO組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)依然整齊，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心排列成索狀.40周齡，對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞空泡變性更加密集，空泡變大，六味組肝細(xì)胞則較對(duì)照組空泡變性明顯改善（圖1）.

表2 大鼠血清游離脂肪酸、甘油三酯、膽固醇的變化Table 2 Changes of serum FFA，TG and CHOL（±s）

表2 大鼠血清游離脂肪酸、甘油三酯、膽固醇的變化Table 2 Changes of serum FFA，TG and CHOL（±s）

與相同周齡 LETO照組比較：1）P＜0.05，2）P＜0.01；與相同周齡對(duì)照組比較：3）P＜0.05，4）P＜0.001.

周齡/周 組別 n c（FFA）/（mmol·L－1） c（TG）/（mmol·L－1） c（CHOL）/（mmol·L－1）0.61±0.37 0.41±0.13 1.22±0.13對(duì)照組 3 0.63±0.48 0.50±0.22 2.25±0.22）32 LETO組 3 0.56±0.08 0.49±0.07 1.66±0.23對(duì)照組 3 0.83±0.191） 0.71±0.081） 1.86±0.412）六味組 5 0.70±0.12 0.58±0.193） 1.79±1.0 40 LETO組 4 0.54±0.07 0.44±0.06 1.46±0.13對(duì)照組 4 0.83±0.112） 1.86±0.092） 2.19±0.152）六味組 7 0.63±0.163） 0.80±0.182），4） 1.63±0.354）8 LETO組3

圖1 六味地黃丸對(duì)OLETF大鼠肝臟組織學(xué)的影響（HE染色，×200）Fig.1 Hematoxylin and erosin staining of livers（×200）

2.4 六味地黃丸對(duì)OLETF大鼠肝臟脂肪浸潤(rùn)的影響

通過(guò)蘇丹Ⅲ對(duì)脂肪的特異性染色進(jìn)一步證實(shí)，32周齡，六味組及對(duì)照組肝細(xì)胞均出現(xiàn)明顯的脂肪變性，其中對(duì)照組肝細(xì)胞以大小泡混合性脂肪變性為主，而六味組可見(jiàn)部分脂滴沉積于膽小管中，細(xì)胞偶有小泡性脂肪變性；40周齡時(shí)，對(duì)照組進(jìn)一步發(fā)展為大小泡混合性脂肪變性，大泡性脂肪變性更多，而六味組脂肪變性較對(duì)照組明顯減少，膽小管中脂滴沉積亦減少（圖2）.

圖2 肝臟蘇丹Ⅲ染色Fig.2 SudanⅢ staining of livers

3 討論

關(guān)于六味地黃丸的記載最早可以追溯到東漢醫(yī)圣張仲景《金匱要略》中的腎氣丸，其前六味藥即六味地黃丸的完整配方；中醫(yī)以“陰虛為本，燥熱為標(biāo)”作為糖尿病的病機(jī)，故到宋代醫(yī)家錢乙所著《小兒藥證直訣》記載地黃圓即六味地黃丸，由腎氣丸衍生而出，是滋陰補(bǔ)腎的著名方劑；金元四大家中的李東垣提出依照上、中、下消的理論，六味地黃丸滋陰養(yǎng)血主治下消.隨著時(shí)間延續(xù)，人們對(duì)六味地黃丸防治糖尿病的認(rèn)識(shí)也在不斷推進(jìn).近年來(lái)研究表明，六味地黃丸能夠增加肝糖原含量，減低肝葡萄糖-6-磷酸酶活性[9]，降低糖尿病動(dòng)物的血糖、血脂[10]并通過(guò)降低血漿脂聯(lián)素水平[11]、繼而改善IR等作用都提示，六味地黃丸可能具有預(yù)防糖尿病的作用.此外，由于其價(jià)格低廉、毒副作用小，很有可能成為中藥預(yù)防糖尿病的藥物選擇之一.

本研究選擇OLETF鼠作為動(dòng)物模型.該鼠屬于遺傳性自發(fā)2型糖尿病模型，是目前國(guó)外推薦用于IR研究的首選動(dòng)物模型[7].在前期研究中經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)40周的觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組在23周齡開(kāi)始出現(xiàn)糖尿病發(fā)病，發(fā)病率隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，40周齡時(shí)，發(fā)病率為92.9%，與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道一致，表明對(duì)OLETF鼠的飼養(yǎng)是成功的.六味組在23周齡僅有1例IGT出現(xiàn)，沒(méi)有糖尿病發(fā)生，在40周齡發(fā)病率為28.6%，顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），LETO組則無(wú)IGT或糖尿病發(fā)生.

脂毒性在糖尿病發(fā)病機(jī)制中的作用得到日益廣泛的認(rèn)可，F(xiàn)FA本身就是重要的致IR物質(zhì)[12].血漿FFA濃度增高可抑制葡萄糖刺激的胰島素分泌，并抑制胰島素在外周靶組織中的生物效應(yīng).在肌肉，F(xiàn)FA抑制胰島素對(duì)碳水化合物的氧化和葡萄糖的攝取，抑制糖原生成.在肝臟，F(xiàn)FA可促進(jìn)葡萄糖的輸出.本研究也發(fā)現(xiàn)，32周齡對(duì)照組血清FFA、TG、CHOL水平均高于LETO組（P＜0.05），隨著病程的進(jìn)展，對(duì)照組大鼠上述指標(biāo)呈進(jìn)一步上升趨勢(shì)，表現(xiàn)為明顯的IR和脂代謝紊亂，與文獻(xiàn)[13]報(bào)道一致.六味地黃丸干預(yù)組的血清FFA、TG和CHOL水平在32周齡時(shí)低于對(duì)照組.由此推測(cè)六味地黃丸減少OLETF鼠糖尿病發(fā)生可能與改善其脂代謝紊亂有關(guān).

以往的研究顯示，糖尿病引起的肝臟組織學(xué)變化主要包括以下幾方面：（1）肝臟的脂肪變性，可以表現(xiàn)為小泡性脂肪變、大泡性脂肪變及大小泡混合性脂肪變；（2）糖原沉積，表現(xiàn)為胞漿糖原明顯增多，胞核則出現(xiàn)糖原空洞；（3）膠原纖維增生；（4）肝細(xì)胞水腫、嗜酸性變性等非特異性細(xì)胞變性；（5）微血管病變、Mallory小體及炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)等非特異性改變[14－15].通過(guò)對(duì)各組大鼠肝臟的HE染色觀察到32周齡的對(duì)照組及六味組均出現(xiàn)了肝細(xì)胞空泡化，隨著病程的進(jìn)展，40周齡時(shí)，對(duì)照組空泡樣變性進(jìn)一步加重，而六味組較對(duì)照組明顯改善.為明確空泡變性的性質(zhì)，進(jìn)一步完善脂肪的特異性染色，明確了空泡變性為脂肪滴，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組隨著周齡的延長(zhǎng)脂肪變性逐漸加重，而經(jīng)過(guò)六味地黃丸干預(yù)的自發(fā)性糖尿病大鼠較未經(jīng)干預(yù)的糖尿病大鼠肝臟脂肪變性明顯減輕.文獻(xiàn)[1]顯示，T2DM患者血FFA升高，F(xiàn)FA進(jìn)入肝細(xì)胞可轉(zhuǎn)變?yōu)橹敬x產(chǎn)物甘油二酯、神經(jīng)酰胺等，這些代謝產(chǎn)物可激活絲氨酸/蘇氨酸激酶、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）/NF-κB抑制物激酶 β（IKKβ）等炎癥通路[16－20]，引起級(jí)聯(lián)炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步加重IR，加重糖代謝紊亂.研究證實(shí)六味地黃丸能夠顯著降低自發(fā)性糖尿病OLETF大鼠血清FFA的水平，同時(shí)改善肝臟局部脂肪浸潤(rùn)程度，提示六味地黃丸通過(guò)降低血清FFA減少脂肪在肝臟局部堆積，改善OLTEF大鼠肝臟的脂肪變性程度，而減輕肝臟的“脂毒性”，可能是其降低血糖、減少糖尿病發(fā)生的機(jī)制之一.

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