低鉀脅迫對煙草幼苗活性氧及抗氧化酶系統(tǒng)的影響

況帥，馮迪，宋科，孟霖，宋文靜

1 中國農業(yè)科學院煙草研究所，山東 青島 266101；2 青島市華測檢測技術有限公司，山東 青島 266101

鉀是植物生長發(fā)育所必須的三大營養(yǎng)元素之一，直接參與作物光合作用、維持離子穩(wěn)態(tài)和物質合成等一系列生理過程，同時鉀離子作為植物代謝過程多種酶合成的輔助因子，對調節(jié)酶活性抵抗外界脅迫起到重要作用，如果植物長期處于鉀饑餓狀態(tài)下，會使其生長受到抑制，嚴重時會導致植物死亡［1-3］。研究表明在正常生理條件下，植物體內代謝產生的活性氧自由基會被植物自身的酶促防御系統(tǒng)及時清除，使整個活性氧系統(tǒng)始終處于動態(tài)平衡之中［4-5］。當處于低鉀脅迫狀態(tài)時，植物會通過增加過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶的活性來清除因脅迫而過量積累的活性氧自由基，但如果活性氧自由基積累量超過清除能力就會產生超量積累，那些未能被清除的活性氧會使細胞原生質膜發(fā)生過氧化反應生成丙二醛（MDA），引起細胞膜上蛋白質、受體和酶的失活，導致細胞膜結構被破壞并喪失功能［6-13］。

近年來隨著針對低鉀脅迫對作物體內活性氧及抗氧化酶系統(tǒng)影響的研究不斷深入，作物對抗逆性的響應機制逐漸成為新的研究熱點，與煙草同科的番茄也是高需鉀量的作物，其在此方面的研究也較多，但在煙草上相關的研究還較少。本試驗在充分學習借鑒同科作物相關研究的基礎上，著重研究耐低鉀煙草品種和鉀敏感型煙草品種在低鉀脅迫條件下，幼苗表型特征、MDA含量、活性氧含量和抗氧化酶活性的變化,為發(fā)掘植物根系對鉀素吸收的潛力從而提高鉀肥利用率提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究對中國農業(yè)科學院煙草研究所種質資源庫所收集提供的226份不同基因型煙草材料，通過水培和大田試驗進行遴選鑒定，篩選出耐低鉀基因型煙草品種NC89和不耐低鉀基因型（低K敏感）煙草品種云煙1號[14-17]。

1.2 材料培養(yǎng)與處理

將消毒后的NC89和云煙1號裸種分別播種于塑料培養(yǎng)盒中，基質為經高壓滅菌鍋120℃滅菌的育苗土。播種后將其置于光照培養(yǎng)箱內，設置晝、夜各12h，溫度分別為28℃、22℃。待幼苗出土25d后，選取長勢一致的煙苗，用清水洗凈根部基質，用海綿包裹煙苗根莖結合處并固定在KT板上，轉移至裝有15 L清水的塑料周轉箱中培養(yǎng)2d，待緩苗后分處理進行試驗。

試驗分為CK（正常供鉀）和LK（低鉀）兩個處理，每個品種的每個處理選取兩個KT板（每板15株煙苗）的煙苗進行試驗，試驗營養(yǎng)液選用改良后的霍格蘭營養(yǎng)液成分為：N 3.75 mmol/L、P 0.25 mmol/L、K 2 mmol/L、Mg 0.25 mmol/L、Ca 3.75 mmol/L、Fe（Fe-EDTA）20.00 μmol/L、Mn 9.00 μmol/L、B 46.00 μmol/L、Zn 0.80 μmol/L、Cu 0.30 μmol/L、Mo 0.5 μmol/L。對照處理營養(yǎng)液K含量為2 mmol/L，低鉀處理營養(yǎng)液K含量為0.1 mmol/L，其他成分均相同。營養(yǎng)液在配置好后用0.1 mol/L的HCl調pH至6.0，每3 d更換一次。自煙苗開始處理后至煙苗生長到第7 d四葉一心時取樣，取樣時每個品種的每個處理分成3個重復送檢測公司分地上部和地下部進行相關指標的檢測。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 MDA含量測定（試劑盒法）

植物組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：10 的比例稱取 0.10 g 樣品， 加入 1 mL 提取液），進行冰浴勻漿。8000 g，4℃離心 10 min，取上清，置冰上待測。測定步驟：1、吸取 0.3 mL 試劑于1.5 mL 離心管中，再加入 0.1 mL 樣本, 混勻。2、95℃水浴中保溫 30 min（蓋緊，防止水分散失），置于冰浴中冷卻，10000 g，25℃，離心 10 min。 3、吸取 200 μL 上清液于微量石英比色皿或 96 孔板中，測定 532 nm 和 600 nm 處的吸光度。

1.3.2 活性氧自由基含量的測定（試劑盒法）

植物組織：按照組織質量（g）：提取液體積（mL）為 1：10 的比例稱取0.10 g組織，加入 1 mL 提取液進行冰浴勻漿，然后，10000 g，4℃，離心 20 min，取上清置于冰上待測；超氧陰離子（O2-）產生速率的測定：分光光度計/酶標儀預熱 30 min，波長至530 nm測定；過氧化氫（H2O2）含量的測定：分光光度計/酶標儀預熱 30 min，波長至 415 nm測定。

1.3.3 抗氧化酶活性的測定（試劑盒法）

植物組織：按照組織質量（g） ：提取液體積（mL）為 1：10 的比例稱取0.10 g 組織， 加入 1 mL 提取液，進行冰浴勻漿。8000 g，4℃離心 10 min，取上清，置冰上待測。

SOD的測定：分光光度計/酶標儀預熱 30 min，波長至 560 nm測定。

POD的測定：分光光度計/酶標儀預熱 30 min，波長至 470 nm測定。

CAT的測定：分光光度計/酶標儀預熱 30 min，波長至 240 nm測定。

總抗氧化能力 (T-AOC) 的測定：分光光度計/酶標儀預熱 30 min，波長至 593 nm測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 15.0軟件在P≤0.05下進行。

2 結果與分析

2.1 低鉀脅迫對煙草幼苗根系生長的影響

由圖1可知，與正常供鉀處理相比，處理7 d時，在低鉀脅迫處理條件下耐低鉀型煙草品種NC89和鉀敏感型煙草品種云煙1號根系的生物量均降低且差異顯著，但云煙1號根系生物量的降低幅度要大于NC89， 烤煙品種NC89和云煙1號根系生物量的降幅分別為15.26%和18.78%。

圖1 低鉀脅迫對煙草幼苗根系生物量的影響（7 d）Fig.1 Effect of K+ deficiency on dry weight in different tobacco cultivars at the seedling stage

由圖2可知，與正常供鉀處理相比，處理7 d時，在低鉀脅迫條件下耐低鉀型煙草品種NC89和鉀敏感型煙草品種云煙1號的總根長和總體積均下降，且呈顯著差異。NC89和云煙1號總根長的降幅為22.46%和35.22%；烤煙品種NC89和云煙1號根系總體積的降幅為24.47% 和40.94%。

圖2 低鉀脅迫對煙草幼苗總根長和根系體積的影響（7 d）Fig.2 Effect of K+ deficiency on total length and total volume of the roots in different tobacco cultivars at the seedling stage

2.2 低鉀脅迫對煙草幼苗中MDA含量的影響

由圖3可知，與正常供鉀處理相比，處理7 d時，在低鉀處理條件下兩個品種地上部和根系中MDA含量均有所增加且各自呈顯著差異。地上部，NC89和云煙1號中MDA含量的增幅分別為7.16%和10.91%；根系中，NC89和云煙1號MDA含量的增幅分別為12.93%和30.32%。

圖3 低鉀脅迫對煙草幼苗中MDA含量的影響（7 d）Fig.3 Effect of K+ deficiency on MDA in different tobacco cultivars at the seedling stage

2.3 低鉀脅迫對煙草幼苗中O2-的產生速率和H2O2含量的影響

由圖4可知，與正常供鉀處理相比，處理7 d時，在低鉀處理條件下兩個品種地上部和根系中O2-的產生速率均有所增加，其中只有云煙1號根系的增加量差異顯著，而云煙1號地上部和NC89中O2-產生速率的增加量均無顯著差異。與正常供鉀處理相比，在低鉀處理條件下兩個品種地上部和根系中H2O2的含量都有所下降，其中地上部兩個品種的下降量均差異顯著，而根系中兩個品種均差異不顯著。

圖4 低鉀脅迫對煙草幼苗中O2-的產生速率和H2O2含量的影響（7 d）Fig.4 Effect of K+ deficiency on O2- and H2O2 in different tobacco cultivars at seedling stage

2.4 低鉀脅迫對煙草幼苗中抗氧化酶系活性的影響

由圖5可知，與正常供鉀處理相比，處理7 d時，在低鉀處理條件下烤煙品種NC89地上部SOD、POD、CAT和T-AOC的活性均顯著增加，烤煙品種云煙1號地上部POD和CAT活性顯著增加；烤煙品種NC89根系SOD、POD和CAT活性顯著增加，而云煙1號根系中SOD和CAT顯著。結果表明，低鉀脅迫下，不耐低K基因型（低K敏感）煙草品種云煙1號總抗氧化能力下降，而耐低K基因型煙草品種NC89有更多的抗氧化酶參與調控來適應外界脅迫環(huán)境。

圖5 低鉀脅迫對煙草幼苗SOD、POD、CAT和T-AOC活性的影響（7d）Fig.5 Effect of K+ deficiency on the activities of SOD, POD, CAT and T-AOC in different tobacco cultivars at seedling stage

3 討論

不同鉀基因型品種篩選研究表明[14-18]，耐低鉀基因型品種對提高土壤鉀營養(yǎng)以及充分利用土壤中鉀素有很大潛力。牛佩蘭等[14]研究了26個不同基因型烤煙鉀積累效率的差異及遺傳表現(xiàn)，證實耐低鉀基因型烤煙的鉀積累效率是鉀敏感基因型的3倍以上，這種基因型烤煙對提高煙葉鉀含量、降低生產成本、節(jié)約資源有著重要意義。楊鐵釗等[15]在2006年對烤煙根系鉀積累和干物質積累動態(tài)研究表明，耐低鉀煙草基因型品種根系吸鉀量大、鉀積累量高、活性強。本文對中國農業(yè)科學院煙草研究所種質資源庫所收集提供的226份不同基因型煙草材料中初步遴選出K326、NC71、NC89、中煙103、云煙一號、翠碧一號、G23和RG11共8個不同鉀基因型烤煙品種，通過水培和大田試驗進行遴選鑒定，獲得不耐低鉀煙草品種(云煙1號) 和耐低鉀煙草品種 (NC89)，研究表明，在低鉀脅迫處理條件下， NC89和云煙1號根系的生物量、總根長和總體積都顯著下降，但云煙1號下降的幅度均大于NC89，因此在低鉀脅迫條件下NC89比云煙1號受到的生長抑制更小。

Epstein[19]研究認為植物鉀吸收受鉀離子吸收轉運體和鉀離子通道兩種機制支配，轉運體在低濃度下起作用，而鉀離子通道主要在高濃度下起作用。當外界鉀離子濃度在0.1～0.2 mmol/L區(qū)間時，鉀吸收主要依靠轉運體（低鉀濃度）來完成的。已有的研究報道[20-21]，在不同植物中，數(shù)個KUP/HAK/KT 轉運體作為高親和的鉀離子轉運體參與了低鉀條件下鉀的吸收。Song等[22]研究表明，低鉀脅迫條件下，煙草高親和鉀轉運體基因NtHAK1和NtHKT1在烤煙品種云煙一號的下調水平相對于烤煙品種NC89來說更加顯著；這揭示烤煙品種云煙一號對低鉀脅迫信號更為敏感，耐低鉀能力弱的原因。

當植物處于低鉀脅迫生長環(huán)境，會產生大量的ROS，超量的ROS會引起細胞質膜的脫脂化和過氧化，導致細胞膜結構和功能的破壞，嚴重時會抑制作物生長[4-5,23]。MDA是植物細胞質膜過氧化的最終產物，其含量的高低可以直接反映出細胞膜的損傷程度和植物抗逆性的強弱[24]。本試驗的結果顯示，在低鉀脅迫處理條件下，鉀敏感型煙草品種云煙1號地上部和地下部中MDA含量和O2-產生速率的增加量均大于耐低鉀型煙草品種NC89，這表明低鉀脅迫條件對耐低鉀品種NC89造成的影響更小，也反映出NC89的抗逆性更高，這一結果與兩品種在低鉀脅迫條件下表型特征和抗氧化酶活性的變化相符，同時試驗結果也與李凱龍等[3]所做的研究結果相一致。

植物體內的抗氧化酶系統(tǒng)則是抵御ROS的最主要途徑[3]。針對因ROS過量積累造成的氧化逆境，植物細胞可以誘導抗氧化酶系統(tǒng)生成SOD、POD和CAT等多種抗氧化酶，抗氧化酶可以將O2-和H2O2分解成活性較低的物質，以此來抵御ROS引起的氧化損傷[25]。SOD活性的高低也是反映植物抗逆性的重要指標[26]。有相關研究認為，植物葉綠體內SOD對O2-的清除作用占到了90%[27]。在清除O2-過程中產生的H2O2在過量積累時同樣也會對細胞膜造成過氧化損傷，抗氧化酶CAT和POD的主要作用就是清除植物組織中多余的H2O2，將其進一步分解為O2和H2O，以達到保護細胞免受氧化損傷[28]。本試驗結果表明，在低鉀脅迫時耐低鉀品種NC89對過量產生的O2-有更好的清除能力，而鉀敏感型煙草云煙1號對過量產生的O2-的分解能力較弱，導致植物組織內O2-的積累量增加進而引起植物細胞的過氧化損傷。與正常供鉀處理相比，在低鉀處理條件下兩個品種地上部和根系中POD和CAT的含量均有所增加，其中除云煙1號根系中POD的增長量未達顯著差異外，其余各項的增長量均呈顯著差異。與正常處理相比，在低鉀脅迫下NC89地上部和根系中T-AOC的含量均有所增加，其中地上部的增加量差異顯著；云煙1號地上部和根系中T-AOC的含量都有所降低，但均差異不顯著，這一結果與韓宇等[29]的研究結果一致。

4 結論

在低鉀脅迫下，耐低鉀型煙草品種比鉀敏感型煙草品種體內的抗氧化酶活性更強，因此其可以更有效的清除因脅迫產生的活性氧，從而防止由低鉀脅迫引起的過氧化導致的損傷，使其在低鉀脅迫下能夠維持正常的生長發(fā)育。

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