拮抗植物病原真菌Streptomyces corchorusii AUH-1的分離與鑒定

章帥文，楊 勇，劉 群，吳志明，李昆太

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院/江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實驗室，江西 南昌 330045）

植物病害是造成農(nóng)作物生長受阻、產(chǎn)量下降和品質(zhì)降低的主要原因之一。據(jù)統(tǒng)計，全球每年因植物病害而造成的農(nóng)業(yè)產(chǎn)量下降比例就高達10%～16%［1］。植物病原菌主要包括細菌、病毒、真菌、線蟲等，而約3/4的植物病害是由植物病原真菌引起的［2］。植物病原真菌常借助侵染墊、附著胞和吸器等侵染結(jié)構(gòu)完成對寄主的侵染，并在寄主組織中大量生長，從而誘發(fā)植物真菌病害的發(fā)生［3-4］。例如，由稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）和水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）引發(fā)的水稻稻瘟病以及紋枯病，已成為全球性的水稻主要病害［5-6］；尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）是一種最為常見的世界性的土傳病原真菌，可引起葫蘆科、香蕉、瓜類、豆科、茄類、棉花等100多種植物發(fā)生枯萎?。?-9］；此外，由炭疽病菌（Colletotrichum）引發(fā)的植物炭疽病，也是造成花果和蔬菜等植物重大損失的一類常見真菌病害［10］。

利用拮抗微生物或其代謝產(chǎn)物進行植物病害生防，具有環(huán)保、安全、無殘留等優(yōu)點，且不易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，而且很多拮抗微生物都具有對作物的促生作用，因此微生物生防顯示出越來越廣闊的應(yīng)用前景，成為目前研究開發(fā)的熱點。

黃麻鏈霉菌（Streptomyces corchorusii）是鏈霉菌屬中的一種，對黃瓜枯萎?。?1］、草莓枯萎?。?2］、草莓炭疽?。?3］等多種植物病害均具有一定的抑制作用。本研究以西瓜枯萎病菌為指示菌，從土壤中分離篩選到1株對植物病原真菌具有良好拮抗作用的黃麻鏈霉菌AUH-1，采用生理生化方法和16S rDNA序列分析對其鑒定，以期為該拮抗菌后期的活性物質(zhì)檢測與生物防治應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試土樣：從江西南昌、贛州、鷹潭、萍鄉(xiāng)、福建武夷山、河北石家莊等地用五點取樣法采集不同類型土樣26個。

供試菌株：意大利青霉（Penicillium italicum）、西瓜枯萎病菌（Fusarrium oxysporum f.sp.niveum）、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）、大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），均由本實驗室保藏。

培養(yǎng)基：高氏一號培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基，硫化氫（H2S）產(chǎn)生培養(yǎng)基（柴斯鈉培養(yǎng)基），纖維素分解培養(yǎng)基，明膠液化培養(yǎng)基，淀粉水解測定培養(yǎng)基，牛奶液化測定培養(yǎng)基，硝酸鹽還原培養(yǎng)基［14-15］。

主要試劑：Ezup柱式細菌基因組DNA提取試劑盒，Taq DNA聚合酶；DNA marker，PCR通用引物等。

主要儀器：2720 Thermal cycler PCR儀，3730-XL測序儀，F(xiàn)R980凝膠成像系統(tǒng)，HC-2518R 冷凍高速離心機，DYY-5電泳儀，光學(xué)顯微鏡，超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱等。

1.2 試驗方法

1.2.1 拮抗放線菌菌株的分離篩選 放線菌菌株的分離：為了獲得豐富的放線菌資源，本研究從江西南昌、贛州、鷹潭、萍鄉(xiāng)、武夷、河北等地采集了26個不同類型的土樣。分別稱取10 g土樣加入裝有90 mL無菌水的三角瓶中制成10-1的土壤懸浮液，以無菌水梯度稀釋至10-3、10-4、10-5；吸取0.2 mL各梯度稀釋液，分別涂布在加有50 mg/L放線菌酮和50 mg/L重鉻酸鉀的高氏一號培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)7 d；挑取呈放線菌菌落特征的單菌落，轉(zhuǎn)接于高氏一號培養(yǎng)基進一步分離純化和保存。

放線菌菌株純化：挑取30℃培養(yǎng)7 d后呈放線菌菌落特征的單菌落，轉(zhuǎn)接到高氏一號培養(yǎng)基中進一步分離純化，于20%甘油溶液中保存，-20℃存放備用。

采用平板對峙培養(yǎng)法進行拮抗菌的初篩［16］：將待測病原真菌菌餅菌（6 mm）面朝下接種至中心位置，用滅菌后的牙簽挑取相同大小的供試放線菌倒置接種于距中心30 mm處，每個處理3次重復(fù)，以只接植物病原真菌作為對照，28℃恒溫培養(yǎng)，待對照組植物病原真菌菌絲鋪滿整個平板時，測定實驗組的抑菌帶寬度（R2）和指示菌菌落直徑（R1），并根據(jù)（R1-R2）/R1的比值大小，篩選出抑菌活性強的放線菌菌株。

拮抗放線菌的復(fù)篩：采用管碟法（牛津杯）進行拮抗放線菌的復(fù)篩。將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的菌懸液與冷卻至50℃的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基混合均勻，每100 mL培養(yǎng)基加入10 mL菌懸液，制成帶菌平板。類似地，釀酒酵母菌、西瓜枯萎病菌、枯草芽孢桿菌等以PDA培養(yǎng)基制成帶菌平板。等平板凝固后，在平板上放經(jīng)過滅菌的牛津杯，各取200 mL經(jīng)復(fù)篩培養(yǎng)基（可溶性淀粉20.0 g/L，KNO31.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，MgSO40.5 g/L，K2HPO40.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，pH 7.2～7.4）發(fā)酵的無菌發(fā)酵液吸入其中。細菌在37℃培養(yǎng)2 d，真菌在30℃培養(yǎng)2～3 d。然后測定抑菌圈直徑，挑選出具廣譜抗菌特性的拮抗放線菌。

1.2.2 拮抗菌株的鑒定 菌絲形態(tài)學(xué)觀察：采用平皿插片法，將拮抗菌株接種于高氏一號固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7～14 d，取插片在光學(xué)顯微鏡下觀察基內(nèi)菌絲和氣生菌絲的形態(tài)。

生理生化特征：參照《鏈霉菌鑒定手冊》［15］中的方法，進行拮抗菌的碳源利用、明膠液化、纖維素分解、淀粉水解、牛奶凝固與胨化、硝酸鹽還原、產(chǎn)H2S測定等試驗。

分子生物學(xué)鑒定：使用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取拮抗菌株的基因組DNA，采用通用引物27F（5′-AGTTTGATCMT GGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTG TTACGACTT-3′）進行PCR擴增拮抗菌株的16SrDNA。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性 45 s、55℃退火 45 s、72℃延伸 1 min，30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。待PCR反應(yīng)完成后，取1μL PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認PCR擴增片段。將測序得到的16SrDNA序列在NCBI網(wǎng)站進行BLAST比對，用MEGA 4.1軟件以Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定拮抗菌株的親緣關(guān)系和分類地位。

采用Excel 2003和DPS 7.5軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，采用Photoshop CS5進行圖像處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗放線菌的分離篩選

2.1.1 拮抗放線菌的初篩 以西瓜枯萎病病原菌為供試菌株，采用對峙法對26個不同類型的土樣中初篩得到15株對西瓜枯萎病菌具有較強拮抗作用的菌株，結(jié)果見表1。其中，由抑菌帶的大小和（R1-R2）/R1的比值大小可知，菌株AUH-1對西瓜枯萎病菌的抑制能力最強，其抑菌帶寬度和（R1-R2）/R1比值分別達到29.46（±0.48）mm和36.15%，如圖1（封三）所示。

表1 拮抗放線菌的初篩結(jié)果

2.1.2 拮抗放線菌的復(fù)篩 采用管碟法測定拮抗菌株AUH-1對不同供試菌株的抑制效果，挖取2 cm×1 cm大小的菌塊接種至裝量為40 mL/250 mL三角瓶的液體發(fā)酵培養(yǎng)基（蔗糖30 g/L，玉米淀粉20 g/L，玉米漿20 g/L，黃豆餅粉 10 g/L，(NH4)SO41 g/L，KH2PO40.25 g/L，MnCl20.05 g/L，MgSO41 g/L，NaCl 0.5 g/L，pH 7.2～7.4）中發(fā)酵，180 r/min、28℃下?lián)u床培養(yǎng)96 h，發(fā)酵液無菌過濾，備用。將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的菌懸液與冷卻至50℃的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基混合均勻，每100 mL培養(yǎng)基加入10 mL菌懸液，制成帶菌平板。類似地，酵母菌、枯草芽孢桿菌、西瓜枯萎病菌、意大利青霉菌和水稻紋枯病菌等以PDA培養(yǎng)基制成帶菌平板。平板凝固后，在平板上放置經(jīng)過滅菌的牛津杯，各取200 μL無菌發(fā)酵液吸入其中。細菌在37℃培養(yǎng)2 d，真菌在30℃培養(yǎng)2～3 d。然后用十字交叉法測抑菌圈直徑。結(jié)果見表2。

2.2 菌株AUH-1的鑒定

2.2.1 菌株AUH-1的菌落特征 從圖2（封三）可以看出，菌株AUH-1的菌落正常、黃色、幾乎不產(chǎn)孢子，長于基內(nèi)，具有明顯的放線菌菌落特征。為了進一步鑒定該菌株的種屬情況，對其開展了菌體形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征以及16S rDNA序列分析。

表2 菌株AUH-1發(fā)酵液對供試菌株的抑制效果

2.2.2 菌株AUH-1的菌絲形態(tài)特征 菌株AUH-1在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，在光學(xué)顯微鏡下觀察到的菌絲體形態(tài)如圖3（封三）所示。菌株AUH-1在PDA培養(yǎng)基上生長發(fā)育良好，基內(nèi)菌絲和氣生菌絲較為豐富，少量氣生菌絲分化形成孢子。

2.2.3 菌株AUH-1的生理生化特征 表3為菌株AUH-1的碳源利用情況和生理生化特征。從表3可以看出，菌株AUH-1可以利用D-葡萄糖、D-甘露醇、蔗糖、麥芽糖、肌醇、D-果糖、和淀粉，不能利用D-木糖、山梨醇、甘油和阿拉伯糖；菌株AUH-1不能水解淀粉和分解纖維素，能使明膠液化以及牛奶凝固與胨化，能產(chǎn)硫化氫和還原硝酸鹽。

表3 菌株AUH-1的生理生化特征

2.2.4 菌株AUH-1的分子生物學(xué)鑒定 菌株AUH-1的基因組DNA經(jīng)PCR擴增后得到1條約為1.4 kb的特征帶，經(jīng)測序其16S rDNA的序列長度為1 491 bp。將該序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)的16S rDNA序列進行Blast比對，采用Neighbor-Joining方法構(gòu)建菌株AUH-1的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），分析結(jié)果顯示菌株AUH-1與Streptomyces corchorusii的系列同源性達到99%。

3 結(jié)論與討論

微生物防治主要是利用有益的微生物，通過生物堿間的競爭、抗生、寄生、溶菌及誘導(dǎo)抗性等作用，抑制病原物的存活［17］。目前，用于植物病害生防的微生物種類繁多，主要有真菌、細菌和放線菌等［18］。例如，作為植物根際促生菌中最大的細菌種群，假單胞桿菌（Pseudomonas spp.），尤其是熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorscens），能有效地定殖在植物根際，控制植物病害、促進植物生長，是植物病害生防研究中的一個重要類群［19］。

圖4 基于16S rDNA序列構(gòu)建的AUH-1菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

放線菌是一類廣泛存在于土壤、植物體、淡水和海洋中的生防菌［20］，種類繁多，具有復(fù)雜的次級代謝系統(tǒng)，能產(chǎn)生諸多結(jié)構(gòu)新穎、生物活性顯著的次級代謝產(chǎn)物，是微生物農(nóng)藥的重要來源［21］，在植物病害防治中具有舉足輕重的作用［22］。目前從自然界中發(fā)現(xiàn)上萬種天然抗生素中，近70%是由放線菌產(chǎn)生的，其中鏈霉菌產(chǎn)生的抗生素占總數(shù)的52%［23-25］。鏈霉菌是放線菌門中種類最多的一個屬，是各種抗生素的主要產(chǎn)生來源［26-27］。鏈霉菌產(chǎn)生的抗生素類物質(zhì)，能夠特異作用于某些病原菌，降低其生長和繁殖速度，從而降低病害發(fā)作的頻率［28］。其中，由鏈霉菌產(chǎn)生的滅瘟素（Blasticidin S）、春日霉素（Kasugamycin）、多氧霉素（Polyoxins）、井岡霉素（Validamycin A）等，更是成功地商業(yè)化運用于水稻、蔬菜和果類等的真菌病害防治中［29］。

本研究通過分離篩選得到1株拮抗鏈霉菌AUH-1，初步鑒定為黃麻鏈霉菌（Streptomyces corchorusii）。黃麻鏈霉菌作為鏈霉菌屬的一員，然目前國內(nèi)外對該菌的報道極少，特別是對其所產(chǎn)活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)及抑菌機理等方面的研究更是少之甚少。燕照玲等［11］在開展植物病原真菌拮抗菌的分離篩選過程中，也獲得了1株對黃瓜枯萎病菌具有高效拮抗作用的Streptomyces corchorusii，但未有關(guān)于其活性物質(zhì)方面的研究。根據(jù)國外現(xiàn)有研究表明，Streptomyces corchorusii系蒽醌類（anthraquinone）抗腫瘤抗生素的主要產(chǎn)生菌［30］，如拒霉素（resistomycin）和特曲霉素D（tetracenomycin D）［31］。值得注意的是，本研究是以植物病害生物防治為目的，分離篩選到1株植物病原真菌拮抗菌Streptomyces corchorusii AUH-1，該菌是否也會產(chǎn)生拒霉素和特曲霉素D等抗腫瘤抗生素，有待進一步對其活性組分進行結(jié)構(gòu)鑒定。另外，盡管菌株AUH-1具備的廣譜性拮抗植物病原真菌特點為其在不同類型植物病害上的生防應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，但其抑菌機理以及在田間的防病效果，有待進一步研究。

參考文獻：

［1］Chakraborty S，Newton AC.Climate change，palnt diseases and food security：an over review［J］.Plant Pathology，2011，60：2-14.

［2］蔡思琦，韓佳延，金黎明.海洋真菌ZJ353對植物病原菌的抑菌譜研究［J］，山東化工，2016，45（17）：25-26.

［3］Berendsen R L，Pieterse C M，Bakker P A.The rhizosphere microbiome and plant health［J］.Trends in Plant Science，2012，17（8）：478-86.

［4］Doornbos R F，Loon L C V，Bakker P A H M.Impact of root exudates and plant defense signaling on bacterial communities in the rhizosphere.［J］.Agronomy for Sustainable Development，2012，32（1）：227-243.

［5］Xiong Z Q，Tu X R，Wei S J，et al.In vitro antifungal activity of antifungalmycin 702，a new polyene macrolide antibiotic，against the rice blast fungus Magnaporthe grisea［J］.Biotechnology Letters，2013，35（9）：1475.

［6］Harikrishnan H，Shanmugaiah V，Balasubramanian N，et al.Antagonistic potential of native strain Streptomyces aurantiogriseus，VSMGT1014 against sheath blight of rice disease［J］.World Journal of Microbiology & Biotechnology，2014，30（12）：3149-3161.

［7］Summerell B A，Laurence M H，Liew E C Y，et al.Biogeography and phylogeography of Fusarium：a review［J］.Fungal Diversity，2010，44（1）：3-13.

［8］Zhao S，Liu D Y，Ling N，et al.Bio-organic fertilizer application significantly reduces the Fusarium oxysporum population and alters the composition of fungi communities of watermelon Fusarium wilt rhizosphere soil［J］.Biology &Fertility of Soils，2014，50（5）：765-774.

［9］Li C H，Zhao M W，Tang C M，et al.Population dynamics and identification of endophytic bacteria antagonistic toward plant-pathogenic fungi in cotton root［J］.Microbial Ecology，2010，59（2）：344-356.

［10］Araújo L，Gon?alves A E，Stadnik M J.Ulvan effect on conidial germination and appressoria formation of Colletotrichum gloeosporioides［J］.Phytoparasitica，2014，42（5）：631-640.

［11］燕照玲，孫虎，施艷，等.黃瓜枯萎病拮抗放線菌S24的分離、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，43（9）：88-92.

［12］陳宏州，莊義慶，楊敬輝.黃麻鏈霉菌 NF0919菌株對草莓枯萎病的生防活性初探［J］.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2014（11）：54-57.

［13］楊敬輝，吉沐祥，陳宏州，等.黃麻鏈霉菌NF0919菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化［J］.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2012，24（10）：136-139.

［14］Shirling EB，Gottlieb D.Methods for characterization of Streptom-yces species［J］.Int Journal of Syst Bacteriol，1966，16（3）：313-340.

［15］中國科學(xué)院微生物研究所放線菌分類組.鏈霉菌鑒定手冊［M］.北京：科學(xué)出版社，1975.

［16］傅本重，朱潔倩，郭新梅，等.核桃內(nèi)生菌XHE7對病原真菌的拮抗作用及種子發(fā)芽的影響［J］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2017，39（2）：272-277.

［17］張麗，孫書娥.利用微生物防治植物病害研究進展［J］.農(nóng)藥研究與應(yīng)用，2010（6）：10-13.

［18］Weller D M，Raaijmakers J M，Gardener B B M，et al.Microbial populations responsible for specific soil suppressiveness to plant pathogens 1［J］.Annual Review of Phytopathology，2002，40（1）：309.

［19］Sivasakthi S，Usharani G，Saranraj P.Biocontrol potentiality of plant growth promoting bacteria（PGPR）-Pseudomonas fluorescens and Bacillus subtilis：A review［J］.African Journal of Agricultural Research，2014，9（16）：1265-1277.

［20］安德榮.生物制藥的原理及方法 Ⅰ.抗生素的制備［J］.中國生物工程雜志，2002（6）：17.

［21］孔望君，蔣會芳，冉火苗，等.兩株土壤放線菌ZSM-1和ZSM-2的分離與鑒定［J］.食品科學(xué)，2016，37（11）：114-119.

［22］彭衛(wèi)福，吳志明，陳未，等.拮抗多種植物病原真菌Streptomyces triostinicus C2的分離與鑒定［J］.生物技術(shù)通報，2016，32（7）：106-111.

［23］Ayari A，Morakchi H，Djamila K G.Identification and antifungal activity of Streptomyces sp.S72 isolated from Lake Oubeira sediments in North- East of Algeria［J］.African Journal of Biotechnology，2012，11（11）：305-311.

［24］Liu X，Bolla K，Ashforth E J，et al.Systematicsguided bioprospecting for bioactive microbial natural products［J］.Antonie Van Leeuwenhoek，2012，101（1）：55-66.

［25］Couillerot O，Loqman S，Toribio A，et al.Purification of antibiotics from the biocontrol agent Streptomyces anulatus S37 by centrifugal partition chromatography［J］.Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical & Life Sciences，2014，944：30-34.

［26］Kumari K S，Siddaiah V.Taxonomy，Identification and Biological Activities of a Novel Isolate of Streptomyces albus［J］.Journal of Pharmacy Research，2011（12）：4678-4680.

［27］Atta H M.Biochemical studies on antibiotic production from Streptomyces，sp.：Taxonomy，fermentation，isolation and biological properties［J］.Journal of Saudi Chemical Society，2015，19（1）：12-22.

［28］Song Y M，Dong X M，Cai Q M，et al.Isolation，Identification and Optimization of Fermentation Conditions of Streptomyces termitum Strain with Antimicrobial Activity against Xanthomonas oryzae pv.oryzae［J］.Journal of Microbiology，2011，31（4）：52-57.

［29］Kim B S，Hwang B K.Microbial fungicides in the control of plant diseases［J］.Journal of Phytopathology，2007，155（12）：641-653.

［30］Solanki R，Khanna M，Lal R.Bioactive compounds from marine actinomycetes［J］.Indian Journal of Microbiology，2008，48（4）：410-431.

［31］Adinarayana G，Venkateshan M R，Bapiraju V V S N K，et al.Cytotoxic compounds from the marine actinobacterium Streptomyces corchorusii，AUBN 1 /7 1［J］.Russian Journal of Bioorganic Chemistry，2006，32（3）：295-300.