營養(yǎng)鹽限制對利瑪原甲藻生長和產(chǎn)毒的影響

曾 玲，龍 超，文 菁

（1.嶺南師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，廣東 湛江 524048；2.中國科學(xué)院南海海洋研究所/海洋生物資源可持續(xù)利用重點實驗室，廣東 廣州 510301；3.嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東 湛江 524048）

有害藻華 （Harmful Algal Blooms，HABs）破壞了生態(tài)平衡，對人類健康和漁業(yè)經(jīng)濟(jì)等造成影響，是世界范圍內(nèi)備受關(guān)注的海洋環(huán)境問題［1］。利瑪原甲藻（Prorocentrum lima）是一種世界范圍內(nèi)廣泛分布且能暴發(fā)赤潮［2］的底棲附生甲藻，其產(chǎn)生的腹瀉性貝毒（主要成分為岡田酸，Okadaic acid，OA）被魚、蝦、貝等攝食后在體內(nèi)累積，通過食物鏈傳遞至人類，引起腹瀉性中毒。隨著大規(guī)模赤潮的頻繁暴發(fā)和食用海產(chǎn)品導(dǎo)致中毒事件的發(fā)生，微藻的生長和產(chǎn)毒機(jī)制日益受到重視。研究微藻生長條件及其產(chǎn)毒機(jī)制不但有利于減少赤潮與毒素的環(huán)境公害，而且可使其結(jié)構(gòu)獨特的次生代謝產(chǎn)物為人類所利用，對保障水產(chǎn)品安全和人類生命安全具有重要意義［3］。

影響微藻生長和代謝產(chǎn)物的主要因子有氮、磷等營養(yǎng)元素。研究表明，氮、磷營養(yǎng)鹽濃度對微藻的生長和產(chǎn)毒有顯著影響［4-6］。氮、磷濃度與藻細(xì)胞生長速率往往呈正相關(guān)關(guān)系。然而，氮、磷濃度過高或過低均對藻細(xì)胞生長具有顯著的抑制效應(yīng)［7］，低濃度氮、磷往往有利于毒素的合成和累積［4，8-9］。有關(guān)營養(yǎng)鹽對P.lima生長和產(chǎn)毒影響的研究主要集中在溫帶種［4，9-14］。目前尚未有關(guān)于營養(yǎng)鹽對熱帶P.lima生長和產(chǎn)毒影響的研究。此外，前人在研究氮、磷對 P.lima 生長和產(chǎn)毒的影響中［4，9，14］，用的是f/2配方，該配方氮源只有NaNO3沒有NH4Cl，或者是單獨以NaNO3、NH4Cl作為氮源進(jìn)行研究。本研究采用改良K配方（含NaNO3和 NH4Cl）［15］，通過設(shè)定氮限制（1/2-N，1/4-N，1/8-N，1/16-N，1/32-N）和磷限制（1/2-P，1/4-P，1/8-P，1/16-P，1/32-P），對1株來自三亞海域的熱帶P.lima生長和產(chǎn)毒的影響進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 藻培養(yǎng)

P.lima 分離自海南三亞（18°14′N ，109°31′E），用改良K配方的培養(yǎng)液進(jìn)行分離純化培養(yǎng)，試驗于中國科學(xué)院南海海洋研究所海洋生物資源可持續(xù)利用重點實驗室進(jìn)行。培養(yǎng)溫度28（±1）℃，光暗周期13L∶11D，鹽度30‰，光源為白色日光燈，光照強度約為4 000 lx。

1.2 試驗方法

1.2.1 N、P濃度設(shè)置 以改良K配方中的N、P營養(yǎng)鹽為基礎(chǔ)，固定N濃度，改變P濃度進(jìn)行試驗；同理，固定P濃度，改變N濃度進(jìn)行試驗。分別設(shè)置6個濃度梯度：1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32（表1）。取處于指數(shù)生長期、生長狀況良好的藻細(xì)胞，離心，去掉原培養(yǎng)液，加入滅菌海水洗滌沉淀藻細(xì)胞，離心，重復(fù)上述步驟，共洗滌藻細(xì)胞3次，以除去原培養(yǎng)液中的營養(yǎng)鹽。將洗滌好的藻細(xì)胞接種于800 mL培養(yǎng)液中，接種密度650 cells/mL。試驗藻種培養(yǎng)所用培養(yǎng)液中除N、P濃度外，其余元素與K培養(yǎng)液相同。

表1 N、P濃度梯度的設(shè)置

1.2.2 藻密度的測定和生長率的計算 每天在同一時間段取樣。藻細(xì)胞用Lugol試液固定后，于Nikon TS100倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。每個樣品計數(shù)3次，取平均值，根據(jù)計數(shù)值繪制生長曲線，并根據(jù)Guillard的單細(xì)胞藻種群生長公式［16］計算藻細(xì)胞生長率：

式中，N0為藻細(xì)胞初始密度，Nt為t天后藻細(xì)胞密度，t為培養(yǎng)天數(shù)。

1.2.3 殘留N、P含量分析 海水的營養(yǎng)鹽濃度用注射式營養(yǎng)鹽自動分析儀（Lachat Inc.，QuichChem 8500，USA）測定，N通過鎘柱將硝氮還原為亞硝氮，再用磺胺和N-1-鹽酸奈乙二胺顯色法進(jìn)行測定；的測定采用靛酚藍(lán)分光光度法；的測定采用以抗壞血酸為還原劑的鉬藍(lán)顯色法。

1.2.4 葉綠素a含量測定 吸取6 mL充分混勻后的藻液至10 mL離心管，5 000 r/min離心5 min，棄上清，加入6 mL 80%丙酮，混勻，置于4℃冰箱黑暗抽提24 h，5 000 r/min離心10 min，取上清進(jìn)行測定。測定波長為663、645 nm，以80%丙酮溶液作參比，根據(jù)公式Ca =12.71A663-2.59A645，計算葉綠素a含量。

1.2.5 毒素含量測定 毒素提取參考Quilliam等［17］的方法進(jìn)行。在收集有藻細(xì)胞的離心管中加入0.5 mL Tris-HCl和1 mL甲醇，超聲波提取1 min，3 500 r/min離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至另一干凈離心管；往原離心管加1 mL甲醇，漩渦振蕩器上震蕩5 min，然后3 500 r/min離心10 min，收集上清；重復(fù)上一步操作，共得離心上清液3.5 mL。適當(dāng)稀釋后用美國的Aabraxis公司的岡田酸（OA）試劑盒進(jìn)行毒素檢測。

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性、相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 N、P在培養(yǎng)液中的殘留濃度

表2 N、P在培養(yǎng)液中的殘留濃度

2.2 N、P限制對P.lima生長的影響

2.2.1 N、P限制對生長曲線和細(xì)胞密度的影響 N限制處理P.lima的生長曲線如圖1a所示。各培養(yǎng)組藻細(xì)胞在接種后即進(jìn)入指數(shù)生長期，隨著N濃度限制程度的增大，細(xì)胞終密度減小，各生長曲線依次走低，呈現(xiàn)梯度。最佳生長是對照組，生長曲線位于最上層，細(xì)胞終密度在6個處理中最大，約3×104cells/mL。細(xì)胞終密度隨著N濃度限制的增強而減小 （3×104～0.65×104cells/mL；P< 0.001），1/32N 限制的培養(yǎng)組增殖程度最小，穩(wěn)定期藻密度停留在較低水平（0.65×104cells/mL），細(xì)胞終密度只有對照的1/5。隨著N濃度的減小，指數(shù)期相應(yīng)變短。

圖1 營養(yǎng)限制條件下P.lima的生長曲線

P限制處理P.lima的生長曲線如圖1B所示。隨著P濃度限制程度的增大，細(xì)胞終密度逐級減?。?×104～0.23×104cells/mL，P<0.001），各生長曲線依次走低，呈現(xiàn)梯度。藻細(xì)胞增殖程度最低的是1/32P，生長曲線在第6 d后幾乎與橫坐標(biāo)平行，細(xì)胞終密度停留在0.23×104cells/mL，是1/32N處理（0.65×104cells/mL）的1/3，僅達(dá)到對照（3×104cells/mL）的1/13。P限制對P.lima生長影響顯著，1/2P～1/32P藻密度急劇下降（下降幅度>50%，P<0.001）。

同一限制水平下，N限制處理的細(xì)胞終密度比P限制的高。數(shù)據(jù)分析表明，細(xì)胞密度與N、P濃度密切相關(guān)，皮爾森相關(guān)系數(shù)分別為0.862、0.998，顯然P濃度與細(xì)胞終密度的關(guān)系更密切。

2.2.2 N、P限制對生長速率的影響 不同營養(yǎng)限制條件下P.lima的生長速率見圖2。基于每次藻細(xì)胞計數(shù)值繪制的生長曲線（圖2A、圖2B），所有處理的P.lima生長速率均隨著培養(yǎng)時間的延長波動下降。N限制條件下，不同處理生長速率持續(xù)下降的時間不同，對照出現(xiàn)在培養(yǎng)12 d，1/2N、1/4N和1/8N出現(xiàn)在培養(yǎng)9 d，1/16N出現(xiàn)在培養(yǎng)6 d，據(jù)此推測限制程度越大，生長速率持續(xù)下降的時間越早。1/32N在培養(yǎng)9 d生長速率幾乎為0，說明培養(yǎng)6～9 d細(xì)胞分裂尚未完成，未能出現(xiàn)增長。

P限制條件下，除了對照和1/2P處理，其余各處理的P.lima生長速率均在培養(yǎng)3 d開始急劇下降，1/16P和1/32P在培養(yǎng)12 d接近0，1/4P和1/8P在培養(yǎng)18 d接近0，1/2P在培養(yǎng)21 d接近0，而對照的P.lima生長速率接近0的時間是培養(yǎng)24 d，說明隨著P限制程度的增大，藻細(xì)胞停止生長的時間提前。

整個生長周期的平均生長速率如圖2C、圖2D所示。N限制條件下，隨著限制程度增大各處理的P.lima生長速率逐級降低（0.128～0.082 /d），差異極顯著。P限制條件下，生長速率范圍為0.047～0.133 /d，也隨著營養(yǎng)限制的增大而逐級減小，各處理結(jié)果間差異極顯著。平均生長速率與N、P濃度密切相關(guān)，皮爾森相關(guān)系數(shù)分別為0.857、0.905。

圖2 不同營養(yǎng)限制條件下P.lima的生長速率

圖3 N、P限制下單位體積葉綠素a含量（A）和單位細(xì)胞葉綠素a含量（B）

2.2.3 N、P限制對葉綠素a含量的影響 對各處理穩(wěn)定期培養(yǎng)液中的葉綠素a含量進(jìn)行測定，結(jié)果（圖3A）表明，對照的葉綠素a含量最高（1.217 mg/L），1/32限制處理最低（1/32N：0.209 mg/L；1/32P：0.161 mg/L），隨著N、P濃度的逐級減小，各處理藻液中單位體積葉綠素a含量逐級下降。單位體積葉綠素a含量與N、P濃度密切相關(guān)（P< 0.05，皮爾森相關(guān)系數(shù)：N限制0.975，P限制 0.972），說明培養(yǎng)液中N、P濃度受限制會影響藻細(xì)胞中葉綠素a的含量。單位體積葉綠素a含量與細(xì)胞終密度密切相關(guān)（P< 0.05，皮爾森相關(guān)系數(shù)：N限制0.931，P限制 0.971）。

單位細(xì)胞葉綠素a含量如圖3B所示。N限制處理（1/2N～1/32N）單位細(xì)胞葉綠素a含量低于對照，差異不顯著。P限制條件下，單位細(xì)胞葉綠素a含量高于對照，差異極顯著，其中1/32P的濃度最高 （70.02 pg/cell）。N限制處理單位細(xì)胞葉綠素a 含量顯著低于P限制處理，可能是因為N是葉綠素合成的重要元素，N缺乏阻止了葉綠素a的合成。

2.3 N、P限制對P.lima產(chǎn)毒的影響

圖4 N、P處理下P.lima單位細(xì)胞毒素含量

由圖4可知，N限制條件下，各處理（1/2N～1/32N）的OA含量均比對照高，其中含量最高的是1/32N（41.30 pg/cell），比對照（13.18 pg/cell）高2倍多；前3個處理（1/2N、1/4N和1/8N）毒素升高幅度不明顯，1/16N和1/32N的OA含量大幅度升高，導(dǎo)致N限制條件下各處理結(jié)果差異極顯著。P限制條件下，1/2P處理的OA含量（13.02 pg/cell）與對照（13.18 pg/cell）幾乎相等，其余處理均比對照高，其中1/16P（41.93 pg/cell）和 1/32P（42.16 pg/cell）極顯著高于對照，其OA含量是對照的3倍多。前3個處理（1/2P、1/4P和1/8P）和對照之間OA含量差異不顯著；后2個處理（1/16P和1/32P）之間差異不顯著；但前4個處理和后2個處理之間差異極顯著。OA濃度與生長速率呈負(fù)相關(guān)，N限制、P限制下的斯皮爾曼等級相關(guān)系數(shù)分別為-0.943、-0.886，即當(dāng)生長速率下降時OA濃度升高。N限制處理的OA含量和P限制處理有兩個共同點：（1）1/16和1/32處理OA含量大幅度上升；（2）OA最高含量均出現(xiàn)在1/32處理。

3 結(jié)論與討論

3.1 N、P殘留的濃度

N、P殘留的濃度揭示了藻細(xì)胞對其吸收的狀況，殘留越多，吸收越少，反之，殘留越少，吸收越多。本研究結(jié)果表明，隨著P限制的增強，的殘留量升高，這與 Vanucci等［8］的研究結(jié)果一致，即當(dāng)N面臨強烈的P限制時，培養(yǎng)液中殘留的N會增多。P限制條件下，殘留的含量（< 4.7 μmol/L）遠(yuǎn)低于含量（>17.05 μmol/L），這可能是吸收的比快的原因［4］，的吸收發(fā)生在被消耗之后［18］。與其他N源相比，P.lima和其他原甲藻更傾向于吸收一般來說，對的偏好在底棲鞭毛藻中是常見的，因為是在底棲生境中隨時可用的還原性氮源［18，21］，但濃度過高會對 P.lima 有毒害作用，降低其生長速率和產(chǎn)毒量［4］。

3.2 N、P限制對葉綠素a含量的影響

N是葉綠素的主要成分，直接或間接影響光合作用；P 是構(gòu)成ATP、GTP、核酸、磷脂、輔酶的最基本元素。適宜的N、P濃度有利于藻細(xì)胞生長和葉綠素a含量的增加［22］；濃度過低會對藻細(xì)胞生長和葉綠素a的含量造成影響［7，22］。本研究表明，隨著 N、P 濃度的降低，藻生長受限，單位體積葉綠素a含量減少。除了N、P濃度會對葉綠素a含量造成影響外，光照強度、CO2和pH值、銨氮等也是影響葉綠素a含量的因素。低光照強度會誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生更多的葉綠素 a［4］；Aikman 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，在低CO2和高pH值的條件下，P.hoffmannianum的葉綠素a含量降低，CO2的缺乏抑制了光合作用的合成；過高的銨氮濃度對藻細(xì)胞有毒害作用，抑制藻的光合活性和氧化反應(yīng)，導(dǎo)致葉綠素a含量降低［4］。

N、P 質(zhì)量濃度對綠色顫藻（Oscillatoria chlorine）葉綠素a質(zhì)量濃度的影響顯著，其中主要影響因子是N［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，N限制處理的單位細(xì)胞葉綠素a 含量遠(yuǎn)低于P限制處理，這可能是由于葉綠素a的分子結(jié)構(gòu)中不含有P元素，P不像N那樣直接參葉綠素a的合成，因此，當(dāng)培養(yǎng)液中N受到限制，葉綠素a合成減少，而P限制條件下，N源充足，有足夠的N用于葉綠素a的合成。同一培養(yǎng)條件下，不同P.lima藻株單位細(xì)胞葉綠素a含量存在差異，Morton等［23］研究表明，來自N位點的A249 藻株葉綠素a含量顯著高于其余5種藻株，本研究中對照的葉綠素a含量與上述研究的A249無顯著差異，高于Varkitzi等和Nascimento等研究的 P.lima 藻株［4，24］。

3.3 N、P限制對P.lima生長的影響

微藻的生長依賴于營養(yǎng)物質(zhì)的供給［4，9］。N和P是微藻生長所必需的主要元素，不同N、P 營養(yǎng)鹽水平對微藻生長影響顯著［7，25-26］。N、P起始濃度影響微藻的生長，與藻細(xì)胞生長速率往往呈正相關(guān)［4，7］。過高或過低的N、P濃度對藻細(xì)胞生長表現(xiàn)出顯著的抑制效應(yīng)［7］。本研究表明，隨著N、P起始濃度的降低，P.lima各生長指標(biāo)（生長速率、細(xì)胞終密度、單位體積葉綠素a含量）下降，表現(xiàn)出明顯的生長抑制。Vanucci等［9］的研究結(jié)果也證實了低N、P濃度會抑制P.lima的生長。

營養(yǎng)鹽限制尤其是P 限制能夠顯著降低藻細(xì)胞的比生長速率和細(xì)胞密度，縮短藻細(xì)胞指數(shù)生長期和穩(wěn)定期的持續(xù)時間［26］。網(wǎng)狀原角藻的生長更多地受P 限制的影響而不是N 限制［26-28］，在本研究及其他一些DSP產(chǎn)毒藻［29-31］和 PSP產(chǎn)毒藻［32-33］中亦證明了 P對藻的生長影響比N更大。然而，與上述藻不同，N對Ostreopsis cf.ovata生長的影響比P大［34］。N限制對銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）的生長有明顯抑制作用，而磷限制則沒有［35］。也有些藻對N、P營養(yǎng)限制均不敏感，如惠氏微囊藻在不同N、P起始濃度下，除了低磷濃度（1/100）處理外，其余濃度處理的生長速率并未表現(xiàn)出顯著影響［7］。

3.4 N、P限制對P.lima 產(chǎn)毒的影響

甲藻對營養(yǎng)物質(zhì)吸收的能力低于其他藻類，在營養(yǎng)缺乏條件下，其競爭能力會比其他硅藻和無毒甲藻差，而毒素的產(chǎn)生可能是甲藻對低營養(yǎng)利用率的一種補償性競爭策略，可以作為對攝食浮游藻類生物的威懾，防止被攝食；當(dāng)營養(yǎng)不平衡時，毒素作為營養(yǎng)儲存化合物，可以減輕某些過剩營養(yǎng)物質(zhì)對藻造成的不利影響［26］。有研究表明，在營養(yǎng)平衡的條件下，藻類產(chǎn)毒量往往較低；而當(dāng)營養(yǎng)失衡，尤其低N、P濃度條件能夠刺激藻類產(chǎn)毒增加［4，8-9］，本研究結(jié)果也支持上述觀點。低P濃度條件下比低N 濃度更能促進(jìn)毒素的累積［9，26，36］。胡蓉等［37］研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液中不添加P時，鏈狀裸甲藻的產(chǎn)毒量最大、達(dá)3.3 pg/cell，P限制可以促進(jìn)鏈狀裸甲藻細(xì)胞中PSP毒素的產(chǎn)生。P濃度對2種甲藻塔瑪亞歷山大藻（Alexandrium tamarense）和微小亞歷山大藻（Alexandtium minutum）的生長和產(chǎn)毒能力均有顯著性影響，此兩種藻均在0 μmol/L 磷濃度下產(chǎn)毒能力最高［38］。DSP 是一類聚醚類或大環(huán)內(nèi)酯類化合物，其結(jié)構(gòu)中不含磷，磷鹽直接參與DSP生物合成的可能性很小。磷鹽對DSP合成的影響可能與該藻類在磷鹽條件下的生長狀況有關(guān)［39］，它可能通過影響微囊藻的生長或者其他途徑來影響藻毒素的合成［40］。

雖然 N 限制會促使 DSP 產(chǎn)量增加［4，9，12］，但會抑制PSP的產(chǎn)量［31-32］和Ostreopsis cf.ovata的毒素產(chǎn)量［34］，這是由于毒素組成元素不同，對營養(yǎng)限制的反應(yīng)也有所不同［34］。Van等［41］研究發(fā)現(xiàn)，N和P限制對富含N的毒素會產(chǎn)生相反效果：N限制條件下毒素含量下降，P限制條件下毒素含量增加。N限制對銅綠微囊藻的產(chǎn)毒有明顯抑制作用，而P限制對其產(chǎn)毒影響不大［35］。然而，無論N限制還是P限制對富含C的毒素具有相同的作用效果，均促進(jìn)了毒素的產(chǎn)生［41］，因為在營養(yǎng)限制的條件下，相對過剩的能量和新合成的有機(jī)碳不能用于細(xì)胞生長，因而被分流合成富含C的分子如毒素。

在所有營養(yǎng)限制條件下，當(dāng)細(xì)胞生長速度減慢時（進(jìn)入穩(wěn)定期），OA的產(chǎn)量均在增加，這是因為雖然細(xì)胞生長速率減慢，但OA生成的速率不變，從而使得OA在P.lima中累積，這表明OA的產(chǎn)量受生長的調(diào)節(jié)［4］，這一結(jié)論在其他有毒藻類［42］中也得到證實。本研究中，營養(yǎng)限制越強的處理組生長速率下降得越快，穩(wěn)定期到來的時間越提前，在同樣培養(yǎng)時間的前提下，OA累積時間越長，因此，限制最強的1/32處理組獲得的OA含量最高。

采用不同培養(yǎng)條件對P.lima產(chǎn)毒研究的結(jié)果存在差異。Vanucci等［9］研究中的培養(yǎng)條件為：溫度20℃，光暗周期16L∶8D，鹽度25，90 μmol/m2s，f/2培養(yǎng)基，其結(jié)果表明，在N限制條件下，從低限制（1/3N）向強限制（1/50N），OA含量升幅不明顯；P限制下（1/3P～1/50P），OA的峰值出現(xiàn)在1/20P，而不是限制最強的1/50P。本研究〔溫度28（±1）℃，光暗周期13 L∶11 D，鹽度30，光照強度4 000 lx，改良K培養(yǎng)基〕則發(fā)現(xiàn)在N、P限制條件下，從低限制（1/2）向強限制（1/32），OA含量增幅明顯，增幅最大的處理（1/32）比限制程度最低的處理（1/2）高出1倍多。毒素的產(chǎn)生受細(xì)胞生理條件的調(diào)控，這些生理條件受到多種因素的影響（如營養(yǎng)限制），DSP毒素的大量產(chǎn)生可能是一種藻細(xì)胞對生理不平衡的非特異性細(xì)胞應(yīng)答［9］。

參考文獻(xiàn)：

［1］Smith V H，Schindler D W.Eutrophication science：where do we go from here?［J］.Trends in ecology & evolution，2009，24（4）：201-207.

［2］李蘭濤，葉健欣，葉寧，等.利瑪原甲藻對湛江港多種魚蝦貝的毒性研究［J］.水產(chǎn)科學(xué)，2011，30（9）：547-550.

［3］曾玲，文菁，徐春曼.氮，磷對微藻生長和產(chǎn)毒的影響［J］.湛江師范學(xué)院學(xué)報，2011，32（6）：103-108.

［4］Varkitzi I，Pagou K，Graneli E，et al.Unbalanced N：P ratios and nutrient stress controlling growth and toxin production of the harmful dinoflagellate Prorocentrum lima（Ehrenberg）Dodge［J］.Harmful Algae，2010，9（3）：304-311.

［5］Lim P T，Leaw C P，Kobiyama A，et al.Growth and toxin production of tropical Alexandrium minutum Halim（Dinophyceae）under various nitrogen to phosphorus ratios［J］.Journal of applied phycology，2010，22（2）：203-210.

［6］Dolman A M，Rücker J，Pick F R，et al.Cyanobacteria and cyanotoxins：the influence of nitrogen versus phosphorus［J］.PloS one，2012，7（6）：1-14.

［7］孫凱峰，肖愛風(fēng)，劉偉杰，等.氮磷濃度對惠氏微囊藻和斜生柵藻生長的影響［J］.南方水產(chǎn)科學(xué)，2017，13（2）：69-76.

［8］龍超，龍麗娟.氮，磷對克氏前溝藻三亞株生長及產(chǎn)毒特性的影響［J］.熱帶海洋學(xué)報，2012，31（4）：117-123.

［9］Vanucci S，Guerrini F，Milandri A，et al.Effects of different levels of N-and P-deficiency on cell yield，okadaic acid，DTX-1，protein and carbohydrate dynamics in the benthic dinoflagellate Prorocentrum lima［J］.Harmful Algae，2010，9（6）：590-599.

［10］Morliaix M，Lassus P.Nitrogen and phosphorus effects upon division rate and toxicity of Prorocentrum lima（Ehrenberg）Dodge ［J］.Cryptogam Algol，1992，13（3）：187-195.

［11］Tomas C R，Baden D G.The inf l uence of phosphorus source on the growth and cellular toxin content of the benthic dinof l agellate Prorocentrum lima［A］.Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea［C］.Amsterdam：Elsevier，1993：565-570.

［12］Mclachlan J L，Marr J C，Conlon-Kelly A，et al.Effects of nitrogen concentration and cold temperature on DSP-toxin concentration in the dinof l agellate Prorocentrum lima（Prorocentrales.Dinophycae）［J］.Toxins，1994，2：263-270.

［13］Sohet K，Pereira A，Braekman J C，et al.Growth and toxicity of Prorocentrum lima（Ehrenberg）Dodge in different culture media：effect of humic acids and organic phosphorus//Harmful Marine Algal Blooms［C］.Nantes：LASSUS P，1995：669-674.

［14］鐘娜，楊維東，劉潔生，等.不同氮源對利瑪原甲藻（Prorocentrum lima）生長和產(chǎn)毒的影響［J］.環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2008，28（6）：1186-1191.

［15］Keller M D，Guillard R R L.Factors significant to marine dinoflagellate culture//Anderson D M，White A W，Baden D G.Proceedings of the Third International Conference on Toxic Dinoflagellates［M］.Elsevier，New York，1985：113-116.

［16］Guillard R R L.Division rates//Handbook of Phycological Culture Methods and Growth Measurements［M］.Cambridge：Cambridge University Press，1973：289-311.

［17］Quilliam M A.Chemical methods for lipophilic shellf i sh compounds//Manual on Harmful Marine Microalgae［C］.Paris：UNESCO publ，2003：211-245.

［18］Pan Y，Cembella A D，Quilliam M A.Cell cycle and toxin production in the benthic dinof l agellate Prorocentrum lima［J］.Mar Biol，1999，134：541-549.

［19］Aikman K E，Tindall D R，Morton S L.Physiology and potency of the dinof l agellate Prorocentrum hoffmanianum during the complete growth cycle//Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea［C］.New York：Elsevier，1993：463-468.

［20］Fan C，Glibert P M，Burkholder J M.Characterization of the aff i nity for nitrogen，uptake kinetics，and environmental relationships for Prorocentrum minimum in natural blooms and laboratory cultures［J］.Harmful Algae，2003，2：283-299.

［21］Glibert P M，Burkholder J M，Kana T M.Recent insights about relationships between nutrient availability，forms，and stoichiometry，and the distribution，ecophysiology，and food web effects of pelagic and benthic Prorocentrum species［J］.Harmful Algae，2012，14：231-259.

［22］李活，賀春花，黃翔鵠，等.氮，磷，鐵質(zhì)量濃度對綠色顫藻生長的限制性條件［J］.南方水產(chǎn)科學(xué)，2015，11（3）：80-87.

［23］Morton S L，Tindall D R.Morphological and biochemical variability of the toxic dinof l agellate Prorocentrum lima isolated from three locations at Heron Island［J］.J Phycol，1995，31：914-921.

［24］Nascimento S M，Purdie D A，Morris S.Morphology，toxin composition and pigment content of Prorocentrum lima strains isolated from a coastal lagoon in southern UK［J］.Toxicon，2005，45：633-649.

［25］沈盎綠，李道季.不同營養(yǎng)鹽水平對東海原甲藻和米氏凱倫藻生長的影響［J］.海洋漁業(yè)，2016，38（4）：415-423

［26］高春蕾，孫萍，賈智慧，等.溫度和營養(yǎng)鹽限制對網(wǎng)狀原角藻生長與產(chǎn)毒的影響［J］.生態(tài)學(xué)報，2017，37（12）：4217-4226.

［27］R?der K，Hantzsche F M，Gebühr C，et al.Effects of salinity，temperature and nutrients on growth，cellular characteristics and yessotoxin production of Protoceratium reticulatum［J］.Harmful Algae，2012，15：59-70.

［28］Mitrovic S M，Amandi M F，McKenzie L，et al.Effects of selenium，iron and cobalt addition to growth and yessotoxin production of the toxic marine dinoflagellate Protoceratium reticulatum in culture［J］.Journal of Experimental Marine Biology and Ecology，2004，313（2）：337-351.

［29］Guerrini F，Ciminiello P，Dell A C，et al.Influence of temperature，salinity and nutrient limitation on yessotoxin production and release by the dinoflagellate Protoceratium reticulatum in batch-cultures［J］.Harmful Algae，2007，6（5）：707-717.

［30］Rodriguez J J G，Mirron A S，Garcia M C C，et al.Macronutrients requirements of the dinoflagellate Protoceratium reticulatum［J］.Harmful Algae，2009，8（2）：239-246.

［31］Rodriguez J J G，Mirron A S，Camacho F G，et al.Culture of dinoflagellates in a fed-batch and continuous stirred-tank photobioreactors：growth，oxidative stress and toxin production［J］. Process Biochemistry，2010，45（5）：660-666.

［32］John E H，F(xiàn)lynn K J.Growth dynamics and toxicity of Alexandrium fundyense（dinophyceae）：the effect of changing N：P supply ratios on internal toxin and nutrient levels［J］.Journal of Phycology，2000，35：11-23.

［33］John E H，F(xiàn)lynn K J.Modelling changes in paralytic shellfish toxin content of dinoflagellates in response to nitrogen and phosphorus supply［J］.Marine Ecology Progress Series，2002，225：147-160.

［34］Vanucci S，Pezzolesi L，Pistocchi R，et al.Nitrogen and phosphorous limitation effects on cell growth，biovolume，and toxin production in Ostreopsis cf.Ovata［J］.Harmful algae，2012，15：78-90.

［35］代瑞華，劉會娟，曲久輝，等.氮磷限制對銅綠微囊藻生長和產(chǎn)毒的影響［J］.環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2008，28（9）：1739-1744.

［36］Markou G.Alteration of the biomass composition of Arthrospira（Spirulina）platensis under various amounts of limited phosphorus［J］．Bioresource Technology，2012，116：533-535．

［37］胡蓉，徐艷紅，張文，等.N，P，Mn和Fe對鏈狀裸甲藻生長和產(chǎn)毒的影響［J］.海洋環(huán)境科學(xué)，2012，31（2）：167-172.

［38］黃世玉，王雪虹，張麗莉.磷濃度對2種有毒亞歷山大藻生長和產(chǎn)毒力的影響［J］.水生態(tài)學(xué)雜志，2012，33（1）：107-111.

［39］楊維東，鐘娜，劉潔生，等.不同磷源及濃度對利瑪原甲藻生長和產(chǎn)毒的影響研究［J］.環(huán)境科學(xué)，2008，29（10）：2760-2765.

［40］嚴(yán)楊蔚，代瑞華，劉燕，等.氮和磷對有害藻類生長及產(chǎn)毒影響的研究進(jìn)展［J］.環(huán)境與健康雜志，2013，30（4）：358-362.

［41］Van de Waal D B，Smith V H，Declerck S A J，et al.Stoichiometric regulation of phytoplankton toxins［J］.Ecology letters，2014，17（6）：736-742.

［42］Granéli E，F(xiàn)lynn K.Chemical and physical factors influencing toxin content［M］.Ecology of harmful algae.Springer，Berlin，Heidelberg，2006：229-241.