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    輔助性T細(xì)胞及其細(xì)胞因子在重癥肌無(wú)力中的作用

    2018-05-09 03:17:36王麗芳韓金鳴馮加純
    關(guān)鍵詞:肌無(wú)力胸腺免疫性

    王麗芳, 張 宇, 韓金鳴, 祝 捷, 馮加純, 鄧 暉

    重癥肌無(wú)力(myasthenia gravis,MG)是累及神經(jīng)肌肉接頭突觸后膜、導(dǎo)致信息傳遞障礙的獲得性自身免疫性疾病,其發(fā)病機(jī)制主要是由乙酰膽堿受體(acetylcholinergic receptor,AChR)抗體介導(dǎo)、依賴(lài)于細(xì)胞免疫、同時(shí)有補(bǔ)體參與。已有研究發(fā)現(xiàn)多種自身免疫性疾病或免疫缺陷病的發(fā)生發(fā)展與輔助性T(T helper,Th)細(xì)胞免疫網(wǎng)絡(luò)平衡失調(diào)密切相關(guān)[1]。近年來(lái),隨著研究的深入,越來(lái)越多的Th細(xì)胞亞型被發(fā)現(xiàn),包括Th1、Th2、Th17、Th22以及最近報(bào)道的濾泡輔助性T細(xì)胞(follicular helper T cells,Tfh)[2]。各種Th細(xì)胞之間相互協(xié)同制約,維持機(jī)體的免疫平衡。MG是神經(jīng)系統(tǒng)典型的自身免疫性疾病,關(guān)于Tfh細(xì)胞及其細(xì)胞因子與MG發(fā)病之間的關(guān)系鮮有報(bào)道,本研究將對(duì)MG患者外周血中Tfh細(xì)胞及其細(xì)胞因子進(jìn)行研究,并結(jié)合不同Th細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子進(jìn)行全面分析,進(jìn)一步認(rèn)識(shí)輔助性T細(xì)胞在MG的發(fā)病中的作用,為未來(lái)通過(guò)調(diào)節(jié)Tfh、Th1、Th2、Th17、Th22等Th細(xì)胞之間的平衡治療MG提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 主要儀器和試劑 Fortessa流式細(xì)胞分析儀 (Becton,Dickinson and Company),淋巴細(xì)胞分離液(GE公司)。BB515 Mouse Anti-Human CD4,Alexa Fluor647 Rat Anti-Human CXCR5,BV605 Mouse Anti-Human PD-1,PE Mouse Anti-Human ICOS,BV510 Mouse Anti-Human CD45RO,PerCp-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD45RA,Human IFN-γ (CBA) Flex Set,Human IL-4(CBA) Flex Set,Human IL-17A(CBA) Flex Set,Human IL-21(CBA) Flex Set(BD Biosciences)。Human IL-22 ELISA Kit (R&D systems)。

    1.2 研究對(duì)象 重癥肌無(wú)力組:收集就診于吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科確診為全身型MG的門(mén)診或住院患者33例。該研究經(jīng)吉林大學(xué)第一醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn),患者簽署知情同意書(shū)。MG患者入組標(biāo)準(zhǔn):臨床診斷為全身型MG的患者,其診斷標(biāo)準(zhǔn)包括:波動(dòng)性骨骼肌無(wú)力、疲勞試驗(yàn)陽(yáng)性、新斯的明試驗(yàn)陽(yáng)性、肌電圖低頻重復(fù)電刺激顯示低頻遞減、高頻無(wú)變化[3];排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并其他自身免疫性疾??;(2)已應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)劑(包括糖皮質(zhì)激素)治療。健康對(duì)照組:選取年齡、性別與MG患者相匹配的本院醫(yī)務(wù)人員34名,納入對(duì)象均無(wú)自身免疫病史和近期感染史。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法 重癥肌無(wú)力患者定量評(píng)分及分組:根據(jù)2000年美國(guó)重癥肌無(wú)力協(xié)會(huì)(myasthenia gravis foundation of America,MGFA)提出的the quantitative myasthenia gravis score (QMGs)對(duì)納入研究的MG患者進(jìn)行評(píng)分,QMGs反映了MG患者的病情嚴(yán)重程度。根據(jù)MG患者胸腺CT掃描或胸腺病理結(jié)果,將患者分為胸腺正常組、胸腺增生組和胸腺瘤組。MG組及健康對(duì)照組年齡、性別相匹配(見(jiàn)表1)。人外周血單個(gè)核細(xì)胞和血清的制備:患者就診/入院后第2日上午8:00-10:00用肝素鈉真空抗凝管收取外周血4 ml,應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液制備外周血單個(gè)核細(xì)胞用于Tfh細(xì)胞的檢測(cè),檢測(cè)需在取樣后8 h內(nèi)完成;用分離膠促凝管取外周血2 ml,通過(guò)離心獲取血清,用于IL-4、IL-17A、IFN-γ、IL-21、IL-22的檢測(cè)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血中的Tfh細(xì)胞,應(yīng)用Flow Jo 7.6.1軟件對(duì)流式檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。分別測(cè)定CXCR5+CD4+T、ICOS+CXCR5+CD4+T、PD-1+CXCR5+CD4+T、CD45RO+CXCR5+CD4+T、CD45RA+CXCR5+CD4+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例。CBA技術(shù)檢測(cè)血清中的IL-17A、IFN-γ、IL-4、IL-21,ELISA技術(shù)檢測(cè)血清中的IL-22(依說(shuō)明書(shū)操作)。

    2 結(jié) 果

    2.1 MG組與對(duì)照組Tfh細(xì)胞各亞群及Th相關(guān)細(xì)胞因子的比較 用Flow Jo 7.6.1軟件測(cè)定Tfh細(xì)胞各亞群占CD4+T細(xì)胞的百分率。其中CXCR5+CD4+T細(xì)胞表示總的Tfh細(xì)胞,CD45RO+CXCR5+CD4+T細(xì)胞為記憶Tfh細(xì)胞或成熟Tfh細(xì)胞,CD45RA+CXCR5+CD4+T細(xì)胞為幼稚Tfh細(xì)胞,ICOS+CXCR5+CD4+T細(xì)胞和PD-1+CXCR5+CD4+T細(xì)胞為循環(huán)Tfh細(xì)胞或功能Tfh細(xì)胞。(1)MG患者外周血中CXCR5+CD4+T細(xì)胞、CD45RO+CXCR5+CD4+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例較對(duì)照組高,差異具有顯著性(P<0.05)(見(jiàn)圖1a、b);CD45RA+CXCR5+CD4+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例兩組之間無(wú)顯著性差異(見(jiàn)圖1c)。(2)MG患者外周血中ICOS+CXCR5+CD4+T細(xì)胞、PD-1+CXCR5+CD4+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例較對(duì)照組高,差異具有顯著性(P<0.05)(見(jiàn)圖2a、b)。(3)MG組血清中IFN-γ、IL-17A、IL-21含量較對(duì)照組增多,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖3a~c)。MG組血清中IL-4較對(duì)照組略有增多,IL-22較對(duì)照組含量略有降低,但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2.2 MG組Tfh細(xì)胞及Th細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子與MG嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析 (1)通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),ICOS+CXCR5+CD4+T細(xì)胞的數(shù)量與QMGs無(wú)相關(guān)性(見(jiàn)圖4a);PD-1+CXCR5+CD4+T細(xì)胞的數(shù)量與QMGs正相關(guān)(r=0.405,P=0.019)(見(jiàn)圖4b)。(2)MG組IL-4含量與QMGs呈負(fù)相關(guān),差異具有顯著性(P<0.05)(見(jiàn)圖4c);IFN-γ、IL-17A、IL-21、IL-22與QMGs無(wú)顯著相關(guān)性。(3)ICOS+CXCR5+CD4+T細(xì)胞、PD-1+CXCR5+CD4+T細(xì)胞的數(shù)量與CD45RO+CXCR5+CD4+T細(xì)胞的數(shù)量正相關(guān)(r=0.500,P=0.003;r=0.410,P=0.018)。

    2.3 Tfh、IL-21、IL-4、IL-17A、IFN-γ、IL-22與胸腺的關(guān)系 根據(jù)MG患者胸腺CT掃描或胸腺病理結(jié)果,將MG患者分為胸腺正常組(8例),胸腺增生組(10例),胸腺瘤組(15例)。3組間Tfh細(xì)胞比例及IL-21、IL-4、IL-17A、IFN-γ、IL-22含量均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

    表1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象一般資料

    圖1 兩組間CXCR5+CD4+T、CD45RO+CXCR5+CD4+T、CD45RA+CXCR5+CD4+T細(xì)胞的比較

    圖2 兩組ICOS+CXCR5+CD4+T、PD-1+CXCR5+CD4+T細(xì)胞的比較

    圖3 MG組與對(duì)照組血清中IFN-γ、IL-17A、IL-21、IL-4、IL-22的比較

    圖4 Tfh細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子與QMGs的相關(guān)性分析

    3 討 論

    2000年Schaerli等[2]初次在扁桃腺中發(fā)現(xiàn)了一種特殊的CD4+T細(xì)胞,其定位在淋巴濾泡,具有輔助B細(xì)胞活化成熟的功能,其特異性表達(dá)趨化因子受體(C-X-C chemokine receptor type 5,CXCR5),被命名為濾泡輔助性T (follicular helper T,Tfh)細(xì)胞。在趨化因子CXCL13(CXCR5配體)的誘導(dǎo)下,Tfh和B細(xì)胞能共同遷移至淋巴濾泡,形成GC。目前認(rèn)為T(mén)fh細(xì)胞是輔助B細(xì)胞活化成熟的主要Th亞群,而Th1和Th2細(xì)胞的效應(yīng)因子IFN-γ、IL-4在B細(xì)胞活化和Ig類(lèi)別轉(zhuǎn)換中只發(fā)揮調(diào)節(jié)的作用。Tfh細(xì)胞輔助B細(xì)胞發(fā)生免疫反應(yīng),主要依賴(lài)于其特異性趨化因子受體(C-X-C chemokine receptor type 5,CXCR5)、程序性死亡分子1 (programmed death 1,PD-1)、誘導(dǎo)性協(xié)同刺激因子(inducible co-stimulator,ICOS)、特異性轉(zhuǎn)錄因子bcl-6 (B cell lymphoma 6)以及其它分泌的特異性細(xì)胞因子IL-21來(lái)發(fā)揮作用。2010年,Simpson等[4]首次將CXCR5+CD4+T細(xì)胞中高表達(dá)ICOS和PD-1的Tfh細(xì)胞定義為循環(huán)的Tfh(circulating Tfh)細(xì)胞。ICOS和PD-1對(duì)GC的形成和抗體分泌細(xì)胞的產(chǎn)生都發(fā)揮著重要作用。ICOS缺陷時(shí),外周血和GC中CXCR5+CD4+T細(xì)胞及記憶B細(xì)胞嚴(yán)重缺失[5]。PD-1為CD28家族成員,是一種重要的免疫抑制分子,Tfh細(xì)胞高表達(dá)PD-1,PD-1與其配體相互作用抑制Tfh細(xì)胞的分化。Good-Jacobson等[6]研究發(fā)現(xiàn)PD-1缺乏時(shí),長(zhǎng)壽命漿細(xì)胞(long-lived plasma cells)數(shù)量減少,其機(jī)制為雖然PD-1的缺乏導(dǎo)致Tfh細(xì)胞數(shù)量增多,但Tfh細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-21的能力降低,進(jìn)而導(dǎo)致B細(xì)胞分化成熟減少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示全身型MG患者外周血中ICOS+CXCR5+CD4+T、PD-1+CXCR5+CD4+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例較健康對(duì)照組高,提示Tfh細(xì)胞參與了MG的發(fā)生發(fā)展,支持Luo等[7]的Tfh細(xì)胞參與了MG發(fā)病的研究結(jié)果。本研究結(jié)果還顯示PD-1+CXCR5+CD4+T細(xì)胞與QMGs正相關(guān),進(jìn)一步證明了PD-1在全身型MG發(fā)病中可能起到致病性作用。

    CD45RO+T細(xì)胞為記憶T細(xì)胞,CD45RA+T細(xì)胞為幼稚T細(xì)胞[8]。本研究結(jié)果顯示MG組ICOS+CXCR5+CD4+T、PD-1+CXCR5+CD4+T細(xì)胞比例與CD45RO+CXCR5+CD4+T細(xì)胞比例正相關(guān),且PD-1+CXCR5+CD4+T細(xì)胞比例與QMGs正相關(guān),說(shuō)明全身型MG患者外周血中記憶Tfh細(xì)胞越多,功能性Tfh細(xì)胞越多,患者病情越重。IL-21是Tfh細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子,其對(duì)GC以及抗體的生成都起著至關(guān)重要的作用[9]。Tfh細(xì)胞也主要是通過(guò)IL-21來(lái)促進(jìn)抗體分泌細(xì)胞的形成[8]。本研究結(jié)果顯示全身型MG患者血清中IL-21含量增多,提示IL-21參與了全身型MG的發(fā)病,未來(lái)有望通過(guò)拮抗IL-21來(lái)減輕MG患者的癥狀。

    IL-17主要由Th17細(xì)胞分泌,Th17在宿主防御感染及自身免疫組織炎癥中發(fā)揮重要作用。應(yīng)用抗IL-17抗體或抑制Th17細(xì)胞的分化,可以明顯減輕疾病的癥狀。Th17及其細(xì)胞因子IL-17在橋本甲狀腺炎患者外周血中增多。另外,Th17在GBS、多發(fā)性硬化、乙型肝炎、風(fēng)濕性心臟病、支氣管哮喘等疾病發(fā)病中都起到一定作用[10]。本研究結(jié)果顯示全身型MG患者外周血清中IL-17A水平較對(duì)照組增多,與王等[11]的Th17參與了MG發(fā)病的研究結(jié)果一致。由此可見(jiàn)IL-17在多種自身免疫性疾病中均可能起到促進(jìn)發(fā)病的作用,為將來(lái)自身免疫疾病的治療提供了新的方向。

    IFN-γ主要是由Th1細(xì)胞分泌,主要調(diào)節(jié)IgG2a的產(chǎn)生,介導(dǎo)細(xì)胞免疫;IL-4主要由Th2細(xì)胞分泌,主要調(diào)節(jié)IgG1的產(chǎn)生,介導(dǎo)體液免疫。Th1、Th2分別通過(guò)分泌IFN-γ、IL-4實(shí)現(xiàn)相互抑制、自我增強(qiáng)的作用[12]。Th1、Th2細(xì)胞的失衡將會(huì)導(dǎo)致自身免疫性疾病、免疫缺陷病等的發(fā)生[13]。在EAE小鼠中,Th1細(xì)胞增多,Th2細(xì)胞缺乏,誘導(dǎo)或活化Th2細(xì)胞會(huì)抑制EAE或其他Th1介導(dǎo)的自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展[14]。Wu等[15]研究表明干燥綜合征小鼠經(jīng)白芍總苷治療后IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4下降,提示白芍總苷可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡來(lái)發(fā)揮治療作用。本研究結(jié)果顯示,MG患者外周血中IFN-γ的水平較正常組升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示全身型MG患者Th1分泌IFN-γ的功能增強(qiáng),可能起到促進(jìn)MG發(fā)病的作用;IL-4的含量較對(duì)照組略有增高,雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但I(xiàn)L-4的含量與QMGs負(fù)相關(guān),由此我們推測(cè)IL-4在MG發(fā)病中可能發(fā)揮保護(hù)作用,減緩MG的進(jìn)展,未來(lái)我們將加大樣本量,進(jìn)一步研究IL-4與MG之間的關(guān)系。

    IL-22主要由Th22細(xì)胞分泌, Zheng等[16]研究發(fā)現(xiàn)MG患者外周血中IL-17含量升高,IL-22含量降低,且IL-22含量與AchR抗體滴度負(fù)相關(guān),推測(cè)IL-22在MG中發(fā)揮保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示MG組IL-22的水平較對(duì)照組降低,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且IL-22與QMGs無(wú)顯著相關(guān)性。關(guān)于Th22及其細(xì)胞因子IL-22在自身免疫性疾病中到底發(fā)揮保護(hù)作用還是致病作用有待進(jìn)一步的研究。

    胸腺是T細(xì)胞發(fā)育成熟的免疫器官,其內(nèi)的生發(fā)中心是T細(xì)胞與B細(xì)胞相互作用的主要場(chǎng)所,其具備自身抗體形成的所有要素。為了探究MG患者免疫狀態(tài)與胸腺類(lèi)型的關(guān)系,我們將MG患者分為胸腺正常組、胸腺瘤組、胸腺增生組,分析3組之間Tfh細(xì)胞及IL-21、IL-4、IL-17、IL-22、IFN-γ的差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn)3組之間無(wú)顯著性差異,但因例數(shù)較小不足以說(shuō)明問(wèn)題,下一步我們將加大樣本量,進(jìn)一步研究MG患者與胸腺類(lèi)型的相關(guān)性。

    總之,我們的研究表明全身型MG患者體內(nèi)存在異常增高的Tfh細(xì)胞,并與疾病嚴(yán)重程度相關(guān),提示其可能促進(jìn)MG發(fā)病。MG患者體內(nèi)還存在異常增多的IL-21、IL-17、IFN-γ,提示它們?cè)贛G的發(fā)病中也起著促進(jìn)作用。IL-4的含量與QMGs負(fù)相關(guān),由此我們推測(cè)IL-4在MG發(fā)病中可能發(fā)揮保護(hù)作用。將來(lái)我們將加大樣本量,并通過(guò)研究治療前后上述細(xì)胞及細(xì)胞因子的變化,進(jìn)一步明確它們?cè)贛G發(fā)病中的作用。

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