5-羥色胺2C受體基因多態(tài)性與特發(fā)性癲癇關聯(lián)研究

徐瓏洋， 伍雪英， 林 旭， 何進宇， 張 林， 王志敏， 王英明， 徐亞歐

癲癇又名羊癲瘋，是大腦神經元異常放電、導致短暫大腦功能異常的一種慢性疾病，據估算全球65億人口中有癲癇患者5500萬人，據流行病學調查，一般人群的年患病率為5‰～7‰[1]，而其發(fā)病機制十分復雜，且研究較少，目前臨床抗癲癇類藥物的治療效果也不佳[2]。從20世紀初期，人們就通過遺傳學研究觀察癲癇的家族性發(fā)病傾向，并發(fā)現某些特定基因對癲癇發(fā)病起作用。

目前，在人類中樞神經系統(tǒng)中5-HTR受體一共發(fā)現了7種，14個亞型，通過不同的交互能力和G蛋白激活磷脂酶C和D信號級聯(lián)反應，而5-HTR2C是唯一由RNA修飾調節(jié)的G蛋白偶聯(lián)受體，調節(jié)血清素在中樞神經系統(tǒng)中的傳遞，具有降低細胞興奮的功能[3]。5-HTR2C定位于X染色體q24區(qū)，含3個內含子，編碼458個氨基酸，主要作用于中樞系統(tǒng)，包括脈絡叢、嗅核、梨狀核、帶狀核、邊緣系統(tǒng)的伏隔核、海馬杏仁核和基底神經節(jié)的尾狀核和黑質及外周神經[3]，目前5-HTR2C作為抗癲癇藥物新的靶點已進入臨床前及臨床評價階段。本研究采用PCR-SSCP,結合測序方法檢測癲癇患者與正常人5-HTR2C基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點并利用統(tǒng)計學方法分析其多態(tài)性與特發(fā)性癲癇的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 實驗組標本均來自成都三六三醫(yī)院癲癇?？凭驮\并確診為特發(fā)性癲癇患者220例，癲癇診斷根據發(fā)作史，目擊者對發(fā)作過程提供可靠的詳細描述，輔以腦電圖癇性放電、腦血管造影、核素腦掃描、CT、MRI等檢查證據共同確診。其中男性107例，年齡2～78歲，占患者總人數48.63%；女性113例，年齡5～79歲，占患者總人數51.37%。對照組標本血液均來自成都三六三醫(yī)院健康體檢部人群一共200例，其中對照組年齡、性別、所屬地區(qū)構成均與實驗組匹配。以上所有病例均征得患者及家屬同意后簽署家屬知情同意書，采取靜脈采血的方法提取血液。

1.2 方 法

1.2.1 血液總DNA提取 采取靜脈采血的方法提取研究對象血液，血液標本采回后放入含抗凝劑的10 ml離心管，至于冰箱-20 ℃中保存。DNA提取按照天根生化科技(北京)公司的血液DNA提取試劑盒操作進行，取400 μl血液提取得到160 μl溶液，至于-20 ℃保存，防止DNA降解。

1.2.2 PCR引物設計合成 根據NCBI公布的5-HTR2C基因序列(Gene ID:3358)，利用Primer Premier 6.0設計引物并將其與NCBI數據庫Primer-BLAST進行引物在線比對，設計引物送生工生物有限公司合成(純度為PAGE級)。rs113961355位點：上游引物5’-GGATGATATGATGAACCTAGCC-3’，下游引物5’-TTACAGGAATGAATGCACCG-3’，115 bp；rs114141491位點：上游引物5’-ACCCTAACCAAGACCAGAACG-3’，下游引物5’-GGCACCACATGATCAGAAACA，141 bp；rs113817908位點：上游引物5’-CTTGTCTCCCCATCCTTTCCCT-3’，下游引物5’-ACCTCTTGCTGCCTTGACCTTG-3’，259 bp。

1.2.3 PCR擴增及檢測 按照Takara公司Long Taq PCR Master Mix混合酶使用說明配25 μl的反應體系： Long Taq PCR Master Mix 12.5 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，DNA模板1 μl，ddH2O 9.5 μl。PCR反應條件：預變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 30 s，退火54 ℃(rs113961355)/58 ℃(rs114141491)/64 ℃(rs113817908)30 s，延伸72 ℃ 30 s，延長72 ℃ 10 min，共35個循環(huán)。

獲得的PCR產物經由1～2%瓊脂糖凝膠水平電泳檢測，根據克隆基因大小確定電泳條帶為目的條帶，且條帶清晰、單一無雜帶干擾。

1.2.4 SNP位點檢測及測序 PCR產物變性后(取1 μl PCR產物加入9 μl LIS-SSCP變性緩沖液，混勻， 98 ℃變性10 min，之后迅速拿出PCR管置于冰上急速冷卻5 min)加樣于12%聚丙烯酰胺凝膠上，200 V電泳90 min。銀染后出現特異性條帶，根據條帶分析結果，挑取不同帶型產物送生工生物有限公司測序。

1.2.5 統(tǒng)計學分析 根據Hardy-Weinberg平衡檢測及χ2檢驗檢測原理對5-HTR2C受體基因rs113961355、rs114141491、rs113817908多態(tài)位點基因型頻率與等位基因頻率在病例組及對照組中是否存在顯著性差異，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 測序結果分析 以5-HTR2C受體基因rs113961355位點、rs114141491位點、rs113817908位點設計的引物2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，經紫外光照射均可見一條明亮清晰的熒光條帶大小分別為約115 bp、141 bp、259 bp與預期結果相符。

分別對5-HTR2C受體基因三位點的PCR產物進行PCR-SSCP檢測，發(fā)現只有rs113817908位點處出現3種條帶，而其余兩點位點未發(fā)現變異條帶。結合基因測序顯示rs113817908位點為A/C突變，與預期結果相符，分別定義為AA、AC、CC 3種類型(見圖1)。

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗分析 采用Hardy-Weinberg平衡檢驗對癲癇病例組與正常對照組rs113817908位點基因多態(tài)性進行適應性檢驗，χ2值分別為189.68、185.40，P值小于0.005，差異極顯著,說明5-HTR2C受體基因多態(tài)性位點的基因型頻率和基因頻率在病例組及正常對照組均不處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(見表1)。該結果可能是由兩種純合子個體受某種因素影響，存在潛在作用的選擇現象，從而導致無論病例組還是正常對照組的基因及基因型頻率差異極顯著。

2.3 基因頻率及基因型頻率獨立性檢驗分析 采用獨立性檢驗，研究特發(fā)性癲癇與rs113817908位點突變的關聯(lián)性。在病例組和正常對照組中等位基因A出現的頻率分別為89.32%、84%；等位基因C出現的頻率分別為10.68%、16%，C等位基因頻率在正常組中明顯高于病例組。在病例組和正常對照組中AA型基因出現的頻率分別為88.6%、83.5%；在病例組和正常對照組中CC型基因出現的頻率分別為10%、15.5%；在病例組和正常對照組中AC型基因出現的頻率分別為1.4%、1%。利用獨立性檢驗計算出χ2為5.16，P值小于0.025，說明H3位點基因多態(tài)性在病例組和對照組間差異顯著，該位點堿基突變與特發(fā)性癲癇有機器顯著的相關性(見表2)。

2.4 半盒型基因型頻率分析 5-HTR2C受體基因定位于Xq24區(qū)，癲癇組及對照組基因型分布χ2檢驗表明，癲癇組H3位點男性患者攜帶C半盒子與女性患者攜帶C+(CC與CA)基因型的比率顯著低于正常組(男性：χ2=11.5693703，P<0.05；女性χ2=4.109905348，P<0.05)(見表3)。

表1 5-HTR2C受體基因rs113817908位點Hardy-Weinberg平衡檢驗

表2 5-HTR2C受體基因rs113817908位點的等位基因頻率和基因型頻率

P<0.05表示差異顯著

表3 5-HTR2C受體基因rs113817908位點半盒子基因型頻率比較

A～C分別為CC、AA、CA基因型

圖1 5-HTR2C受體基因rs113817908位點測序圖譜

3 討 論

遺傳學研究觀察癲癇的家族性發(fā)病傾向，多數人認為癲癇病具有遺傳傾向，但具體遺傳模式及治病基因尚未明確。目前研究表明，癲癇的發(fā)病是由多基因、多位點共同作用的結果。大量研究表明，5-HT及其受體5-HTR1A、5-HTR2C、5-HTR 3、5-HTR7等對癲癇的發(fā)病都具有重要作用[4]，對其神經興奮起了抑制作用。研究發(fā)現， 5-HTR2C受體基因缺失的小鼠呈現出偶發(fā)性癲癇綜合征,有時甚至導致死亡[3]，相比于對照組野生型小鼠，缺失5-HTR2C受體的小鼠發(fā)作更為敏感[5]，5-HTR2C受體基因被破壞的小鼠也可表現出癲癇的癥狀，且較正常的小鼠有較低的癲癇域值[2]。對大鼠用M-CPP(5-HTR2C受體激動劑)可以抑制肌陣攣作用效應可持續(xù)1 h，并在時間和數量上出現顯著的劑量依賴性[6]。曾有研究表明，M-CPP可加重強迫癥的發(fā)病概率，對此我們可將癲癇與強迫癥的發(fā)病做相關性研究[7，8]。國內外目前關于5-HTR2C受體抑制癇性發(fā)作的機制研究尚少,有人認為5-HTR2C受體在杏仁核點燃過程中起到了約束的作用，還有研究證明它能抑制細胞內外核質網絡的點燃[9]。

本研究所設計的rs113817908位點分布于5-HTR2C受體基因5’側翼，與基因轉錄有關。所研究的5-HTR2C 基因H3位點出現3種條帶類型，基因測序結果顯示第89位堿基突變，其基因型分布為AA、AC、CC,說明此位點位A/C突變。平衡檢驗結果表明無論癲癇組還是正常組中，基因及基因型頻率差異極顯著(P<0.005)，說明5-HTR2C基因rs113817908多態(tài)性位點基因型頻率、基因頻率在兩組中都不處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。從基因型分布來看純合子占絕對優(yōu)勢，該結果說明雜合子受某種因素影響，導致雜合子個體不利于其選擇，從而導致雜合子顯著低于兩種純合子。另一可能的原因是，本研究所抽取的樣本在其表型上與雜合基因型有某種關聯(lián)，從而導致所選樣本出現此種現象[10]，這有待于進一步研究。也有可能是因為本研究所抽取的樣本多集中于中國西南地區(qū)，受地域、人種的遺傳背景等因素影響。雖然中國西南地區(qū)人群相對均一性較好，遺傳背景基本相同，但也應在不同地域的人群中進行類似研究，以消除地域偏倚，同時也應在家族連鎖不平衡研究中尋找更多的證據[11]。

利用獨立性檢驗得到的χ2值為5.16，P值<0.025，表明rs113817908位點在特發(fā)性癲癇病例組和正常對照組中差異顯著，男性患者攜帶C半合子與女性患者攜帶C+(CC與AC)基因型的比率及C等位基因的頻率均明顯高于對照組，亦驗證了這一假說。說明此位點與特發(fā)性癲癇有相關性，其位點突變可能與基因轉錄有關。

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