Fh8明顯增強PCV2 Cap蛋白的可溶性表達及抗原性

郭蕓蕓， 張碧成， 孫小涵， 汪 偉， 何孔旺， 牛家強， 張雪寒

(1.江蘇省農業(yè)科學院獸醫(yī)研究所/農業(yè)部獸用生物制品工程技術重點實驗室/江蘇省食品質量安全重點實驗室——省部共建國家重點實驗室培育基地，江蘇 南京 210014； 2.西藏農牧學院動物科學學院，西藏 林芝 860000)

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)可導致斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)，它是豬圓環(huán)病毒家族中重要的成員，也是豬群中最常見的豬圓環(huán)病毒型[1-4]。

PCV2是環(huán)狀、單股負鏈DNA 病毒，病毒基因組包含有11 個開放閱讀框(Open reading frame，ORF)[5]。ORF2主要編碼Cap蛋白，Cap蛋白分子量大小約27 800，由233～234個氨基酸構成，該蛋白是PCV2唯一的結構蛋白，與豬圓環(huán)病毒2型的感染與免疫有著密切關系[6]。因此，Cap蛋白是研發(fā)PCV2疫苗和PCV2檢測試劑的靶標蛋白[7-9]，但其體外表達的可溶性嚴重制約Cap蛋白的應用。

Fh8是肝片吸蟲在感染早期分泌的蛋白，因其分子量為8 000，故命名為Fh8[10-12]。Fh8融合標簽是高效的蛋白可溶性表達增強子，它的分子量小，相比現有的大融合標簽具有先天優(yōu)勢。

以PCV2基因組DNA為參照，獲得ORF2基因，克隆到含有Fh8標簽的大腸桿菌表達載體中，實現Cap蛋白的可溶性表達，免疫小鼠評估其免疫原性，為PCV2防控制劑的研發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

PCV2b 基因型的強毒株，由江蘇省農業(yè)科學院獸醫(yī)研究所自行分離、鑒定、保存，病毒滴度為1 ml 106.25TCID50。pCold-Fh8表達質粒，由江蘇省農業(yè)科學院獸醫(yī)研究所自行構建和保存。異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、T4 DNA連接酶、限制性內切酶，購買于 TaKaRa 公司。質粒提取試劑、膠回收試劑盒，購買于Axygen 公司。DH5α和BL21感受態(tài)細胞，購買于南京助研生物科技公司。豬抗PCV2多克隆抗體和HRP-羊抗豬IgG，分別購買于VRDM和 BETHYL公司。

1.2 獲得優(yōu)化的PCV2 ORF2基因片段

根據 GenBank已有PCV2ORF2基因序列(登錄號：KC153106.1)，參照大腸桿菌偏愛的密碼子優(yōu)化ORF2的稀有密碼子，并在基因序列的5′端和3′端分別添加酶切位點，優(yōu)化的ORF2基因由南京金斯瑞生物技術有限公司合成，克隆入 pUC57載體，獲得重組質粒 pUC57-ORF2。

1.3 構建重組質粒

將上述重組質粒pUC57-ORF2和表達載體pCold-Fh8分別用XhoⅠ與EcoR Ⅰ酶切。酶切產物經回收，再與pCold-Fh8連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂布LB 平板(氨芐青霉素，100 μg/ml)，37 ℃過夜培養(yǎng)。次日，挑取單菌落接種含有氨芐青霉素的液體 LB，繼續(xù)37 ℃過夜培養(yǎng)，雙酶切鑒定質粒，陽性質粒命名為 pCold-Fh8-Cap。同時構建3個對照重組質粒pCold-Cap、pCold、pCold-Fh8。

1.4 構建重組菌和誘導表達

1.4.1 重組菌的構建 將上述重組質粒轉化大腸桿菌BL21，涂布LB 平板(氨芐青霉素，100 μg/ml)。過夜培養(yǎng)，挑取單菌落，酶切鑒定，獲得重組菌株pCold-Fh8-Cap/BL21、pCold-Cap/BL21、pCold /BL21和pCold-Fh8/BL21。

1.4.2 重組菌的誘導表達 上述的重組菌首先接種LB液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)。次日，再以1%比例轉接新鮮的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng) 2～3 h后，加入終濃度為 0.1～0.5 mmol/L 的IPTG，16 ℃繼續(xù)培養(yǎng) 18～24 h，收獲細菌。

1.5 SDS-PAGE分析和Western blotting鑒定

1.5.1 SDS-PAGE分析 上述誘導培養(yǎng)物，各取1 ml，8 000 r/min離心10 min，收集菌體，用1/5體積的TE(pH為8.0)緩沖液重懸，SDS-PAGE分析表達情況。

1.5.2 Western blotting鑒定 常規(guī)方法進行半干式轉印，然后將轉印有Cap蛋白的轉移膜放入含有5%脫脂乳的盒子中，過夜震搖孵育。次日，棄去脫脂乳，用TBST(Tris-HCl緩沖鹽溶液，含有0.05% Tween 20) 溶液稀釋PCV2陽性血清(1∶1 000)，室溫孵育1 h，洗滌后，再用HRP-羊抗豬IgG(1∶10 000)，室溫再孵育1 h，洗滌后，ECL顯色分析。

1.6 蛋白質表達形式分析以及蛋白質純化

1.6.1 蛋白質表達形式的分析 收集1 ml誘導后重組菌培養(yǎng)物，離心收集菌泥，用1/5 體積的TE(pH為8.0)緩沖液重懸，在冰水浴中超聲裂解，1次2 s，間隔2 s，直到菌體全部破碎，離心分離菌體上清液和沉淀，上清液為可溶性蛋白，沉淀為包涵體。SDS-PAGE分別電泳上清液和沉淀，分析重組蛋白是否為可溶性表達。

1.6.2 重組蛋白的純化 參照 His·BindTMResin 親和層析蛋白純化步驟對菌體的上清液部分進行純化，并對純化蛋白進行SDS-PAGE分析。

1.7 重組Cap蛋白的免疫效力

1.7.1 疫苗的制備 測定經過純化的重組蛋白濃度，用于疫苗制備。選取2個劑量的Cap 抗原10 μg和50 μg，與佐劑ISA 206分別進行乳化制備疫苗，添加免疫增強劑A(含有5 μg LTB和5 μg 沙門氏桿菌鞭毛蛋白)以提高免疫效果。配制疫苗和與動物分組情況見表 1。

1.7.2 免疫小鼠 參照文獻[13]，將5～6周齡Balb/c雌性小鼠 60只，隨機分成5組，標記為 G1～G5，每組12只，如表 1 中所示， G3組接種全病毒滅活疫苗，為南京天邦生物科技股份有限公司產品。所有疫苗皮下多點注射小鼠(試驗數量為12只)。

表1動物免疫情況

Table1Theimmunizationofanimal

組別免疫增強劑抗原佐劑G1AFh8?CapISA206G2AFh8?CapISA206G3-對照苗G4(對照1)APBSISA206G5(對照2)---

G1免疫劑量為10 μg,G2免疫劑量為50 μg,G3免疫劑量為0.2 ml。

1.7.3 PCV2 特異性抗體檢測 使用圓環(huán)病毒2型抗體檢測試劑盒(Synbiotics公司產品)測定小鼠血清OD450值，操作步驟參照說明書進行。所有小鼠分別于免疫前(0 d)和免疫后(28 d)采血，分離血清，保存待檢。

1.7.4 PCV2 強毒攻擊試驗[14-15]免疫后 28 d，所有小鼠腹腔注射PCV2b病毒(1 ml含 106.25TCID50)，每只0.1 ml，連續(xù)觀察 21 d。PCR方法檢測組織中PCV2 病毒，以分析免疫動物和非免疫動物病毒攜帶的差異，進而評價重組Cap疫苗的免疫效力。

2 結果與分析

2.1 重組表達質粒的鑒定

構建的重組質粒pCold-Fh8-Cap、pCold-Cap、pCold-Fh8 和pCold經XhoⅠ與EcoRⅠ雙酶切，結果顯示pCold-Fh8-Cap和pCold-Cap在紫外線下可見載體片段和 702 bp 左右目的條帶，與預期片段相符，pCold-Fh8 和pCold只有載體片段。

2.2 重組蛋白的 SDS-PAGE

經 SDS-PAGE 電泳分析，與對照菌pCold-Fh8/BL21和pCold I/BL21相比，重組菌pCold-Fh8-Cap/BL21和pCold-Cap/BL21分別在35 000 (圖 1)和27 000(圖3)處明顯多出1條蛋白質條帶，說明重組菌pCold-Fh8-Cap/BL21和pCold-Cap/BL21在IPTG 誘導下成功獲得表達，與預期結果相符。

1：pCold-Fh8/BL21 誘導前；2：pCold-Fh8/BL21 誘導后；3：重組菌 pCold-Fh8-Cap/BL21 誘導前；4：重組菌 pCold-Fh8-Cap/BL21誘導后；M：預染中分子量蛋白質標準。圖1 SDS-PAGE鑒定重組菌pCold-Fh8-Cap/BL21的表達Fig.1 Identification expression of recombinant bacteria pCold-Fh8-Cap/BL21 with SDS-PAGE analysis

2.3 重組蛋白的可溶性分析

誘導后的重組菌pCold-Fh8-Cap/BL21和 pCold-Cap/BL21菌體，分別進行超聲波破碎，SDS-PAGE 分析全菌裂解物、破碎后上清液以及破碎后沉淀。結果表明，重組菌 pCold-Fh8-Cap/BL21誘導表達靶蛋白大部分在上清液中，以可溶性形式存在(圖 2)，而重組菌pCold-Cap/BL21目的蛋白以包涵體形式表達，存在于菌體沉淀中(圖3)。

M：分子量蛋白質標準；1：重組菌 pCold-Fh8-Cap/BL21超聲破碎全菌蛋白質；2：重組菌 pCold-Fh8-Cap/BL21超聲破碎上清液； 3：重組菌 pCold-Fh8-Cap/BL21超聲破碎沉淀。圖2 重組蛋白fh8-Cap的可溶性分析Fig.2 The solubility of the recombinant protein fh8-Cap

M：蛋白質分子量標準；1：重組菌 pCold-Cap/BL21超聲破碎全菌蛋白質；2：重組菌 pCold-Cap/BL21超聲破碎上清液；3：重組菌 pCold-Cap/BL21超聲破碎沉淀。圖3 SDS-PAGE鑒定重組菌pCold-Cap/BL21的表達和可溶性分析Fig.3 Expression identification of recombinant bacteria pCold-Cap/BL21 with SDS-PAGE and the solubility of the recombinant protein

2.4 蛋白質純化和Western blotting鑒定

2.4.1 蛋白質純化 重組菌pCold-Fh8-Cap/BL21超聲裂解的菌體上清液經His·BindTMResin 親和層析柱純化，獲得高純度可溶性重組蛋白，分子量為35 000(圖4)，洗脫蛋白質的第3管濃度明顯高于第1管和第2管。

2.4.2 Western blotting鑒定 對照菌pCold-Fh8/BL21和重組菌pCold-Fh8-Cap/BL21全菌裂解物，經 SDS-PAGE電泳后轉膜，Western blotting 鑒定，在目的條帶大小(35 000)位置出現1條明顯的黑色印跡，而對照菌的泳道在相應位置則無反應條帶(圖5)，這說明表達產物可被豬PCV2 多克隆抗體特異性識別，具有較好的反應原性。

1～3：重組Cap蛋白第1～3管；M：預染中分子量蛋白質標準。圖4 SDS-PAGE分析純化的重組蛋白Fig.4 The SDS-PAGE analysis of purified recombinant protein

1：重組菌 pColdⅠ-Fh8-Cap/BL21誘導后；2：pColdⅠ-Fh8/BL21 誘導后；M：預染中分子量蛋白質分子量標準。圖5 Western blotting 鑒定重組蛋白Fig.5 Identification of the recombinant protein with Western blotting assay

2.5 免疫小鼠的免疫效力

2.5.1 血清PCV2特異性IgG抗體檢測 連同對照小鼠，使用試劑盒檢測各免疫小鼠的PCV2抗體水平，由圖6可見，免疫小鼠血清OD450均值極顯著(P<0.01)高于所有對照小鼠，免疫組G1(OD450=1.15)、G2(OD450=1.24)和G3(OD450=1.22)各組間平均OD450差異不顯著(P>0.05)。對照組G4(OD450=0.13)和G5(OD450=0.14)血清均值低于試劑盒的質控陰性對照(OD450=0.30)。結果表明，可溶性表達的Cap蛋白具有良好的免疫原性。

OD450≥0.5 判為陽性。G1、G2、G3、G4、G5分別表示Cap疫苗10 μg組、Cap疫苗50 μg組、商品化疫苗組、單獨佐劑組和未接種組。圖6 PCV2抗體檢測結果Fig.6 Detection of PCV2 specific antibody

2.5.2 攻毒小鼠的PCR檢測 除G5外，所有小鼠均攻毒。于攻毒后21 d內，每周剖殺3只，取肺臟和肝臟進行檢測，結果顯示，G4小鼠，可以擴增出目的條帶，702 bp，而G5小鼠PCR檢測為陰性，說明小鼠作為PCV2攻毒模型成立。免疫組中(G1、G2和G3)，攻毒后7 d和14 d，PCR結果為陽性，第21 d，免疫組(G1、G2和G3)全部為陰性。結果表明，可溶性的重組Cap蛋白疫苗免疫后，有效阻止了PCV2在動物體內的復制(表2)。

表2小鼠臟器PCR檢測結果

Table2PCRdetectionfororgansfromthemice

監(jiān)測期(d)G1G2G3G4G573/33/33/32/30/3143/32/33/33/30/3210/30/30/33/30/3

表中數據表示陽性數/總數。

3 討 論

PCV2作為嚴重影響國內外養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要病原之一，它引起的PMWS 在世界范圍內廣泛流行[1]。該病毒主要侵害豬的免疫系統(tǒng)，并能夠造成機體的免疫抑制，給國內外養(yǎng)豬業(yè)造成不可估量的經濟損失。

Cap蛋白作為病毒唯一的結構蛋白，常被用于PCV2疫苗和診斷方法的研究[6]。昆蟲細胞/桿狀病毒表達系統(tǒng)生產的亞單位疫苗，已被廣泛使用。假型桿狀病毒載體疫苗、乳酸菌口服活載體疫苗、博德特氏菌載體疫苗和大腸桿菌載體疫苗正在研制中。其中大腸桿菌表達載體作為非常成熟的表達載體，擁有便于培養(yǎng)、生長速度快等特點，但病毒蛋白多為包涵體表達，將在一定程度上影響抗原的免疫原性等生物學特性，進而影響其廣泛應用。

Fh8肽段是肝片吸蟲感染早期分泌的蛋白質，具有成為可溶性表達增強子的先天優(yōu)勢[11-12]。本研究構建PCV2ORF2 和Fh8-ORF2融合基因，克隆到低溫表達質粒中，均獲成功表達，但只有Fh8-Cap為可溶性蛋白，解決了Cap的體外表達難題。

以小鼠為模型，評估Fh8-Cap蛋白的免疫原性[13-15]。重組蛋白免疫小鼠1次，第4周可誘導較高水平的IgG，OD450值可達1.0以上。不管低劑量(每只10 μg)還是較高劑量(每只50 μg)，均可誘導較高滴度抗體，并且劑量之間無顯著差異，進一步表明Fh8-Cap具有良好的免疫原性，為研制新型亞單位疫苗和檢測診斷技術奠定物質基礎。

綜上所述，本研究成功表達PCV2型Cap蛋白，借助Fh8融合標簽，獲得可溶性蛋白。相比對照小鼠，免疫小鼠產生高滴度抗體，并且臟器病毒載量明顯降低。

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